從線粒體凋亡通路探討參附注射液對膿毒癥小鼠心肌損害的影響

徐坡 謝靖 彭媛 陸士奇

膿毒癥是嚴重創(chuàng)傷、重癥感染等多種危重疾病應(yīng)激狀態(tài)下的常見并發(fā)癥，具有高發(fā)病率，高死亡率的特點，其高死亡率與它易致多臟器功能損傷直接相關(guān)。40%～50%的膿毒癥可導(dǎo)致心功能不全[1]，心肌細胞損傷是膿毒癥心功能不全發(fā)生的主要原因，細胞凋亡在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，早在2008年Flierl MR等[2]的研究就證明抗凋亡治療有逆轉(zhuǎn)膿毒癥心肌損傷的作用。本研究通過觀察參附注射液對膿毒癥小鼠心肌細胞凋亡指數(shù)、心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)及心肌組織B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymPhoma-2，Bcl-2)、BH3介導(dǎo)的死亡域激動劑(BH3 interacting-domain death agonist，Bid)、截短型Bid(truncated Bid，tBid)、半胱胺酸-天門冬胺酸酶(cysteine-dePendent asPartate-sPecifc Proteases-9，Caspase-9)蛋白表達的影響，從線粒體凋亡通路探討參附注射液對膿毒癥小鼠心肌線粒體損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物

選取56只5～6周齡SPF級雄性C57/B6J小鼠[由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(蘇)2016-0010。動物合格證編號：201915419]，動物飼養(yǎng)在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗動物中心，溫度22～24℃、相對濕度為40%～70%的SPF環(huán)境中，自由進食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 分組與造模

56只雄性C57/B6J小鼠被隨機分為4組，具體分組如下：正常對照組9只(NC組，不做任何處理)；假膿毒癥組9只(Sham組，腹腔注射溶媒)；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)腹腔注射誘導(dǎo)膿毒癥模型組12只(LPS組)；LPS造模+參附注射液腹腔注射組(SFI組)26只。造模予LPS(sigma L2880)按8 mg/kg單次腹腔注射LPS溶液；SFI組在造模前24小時、12小時、6小時分別腹腔注射參附注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司，劑量按10.0 mL/kg進行)。除NC組外，另外3組別動物，每組分別于造模后6小時，12小時各處死3只，剩余動物和全部對照組動物，于實驗24小時全部統(tǒng)一處死取材，并按要求保存。所有動物實驗均得到蘇州大學(xué)實驗動物保護協(xié)會批準(zhǔn)。

1.3 電鏡觀察小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)

選用儀器：透射電鏡(日本電子JEM1400型)；超薄切片機(leica UC-7)；數(shù)碼相機(EMSIS，morada G3)。取1 cm3心肌組織若干塊，于戊二醛中固定(2.5%)，倒掉固定液入PBS緩沖液，1%鋨酸后固定2小時，乙醇梯濃度脫水(30%、50%、70%、80%、95%、100%)，環(huán)氧丙烷和環(huán)氧樹脂1∶1浸透，純環(huán)氧樹脂包埋入烤箱，超薄切片(70 nm)，鉛鈾染色。JEM1400型透射電鏡(日本)觀察心肌超微結(jié)構(gòu)，數(shù)碼相機(EMSIS，morada G3)拍照。

1.4 蘇木精—伊紅染色

心肌組織樣本放置于4%甲醛中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯2次透明，浸蠟，石蠟包埋切片，厚度在4 μm；鋪片，烤片，脫蠟，蘇木精浸染，沖洗，0.5%氨水返藍，伊紅染色，沖洗，脫蠟，封片，晾干。于顯微鏡下觀察不同視野病理切片狀態(tài)，不同倍數(shù)下拍照，分析病理結(jié)果。

1.5 TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡

取石蠟包埋的心肌組織4 μm切片，以TUNEL法按試劑盒說明進行心肌組織切片細胞凋亡檢測。具體方法如下：先將硬石蠟包埋的切片進行二甲苯脫蠟，逐級乙醇脫水。用PBS潤洗樣本3次，滴加100 μL 1×Equilibration Buffer，室溫孵育30分鐘。解凍FITC-12-dUTP Labeling Mix，加入緩沖液；37℃孵育60分鐘，避免光照；移除封口膜，切片置于PBS溶液中室溫孵育5分鐘；重復(fù)該步驟1次；染色,洗滌樣本，室溫放置5分鐘，重復(fù)兩次，在熒光顯微鏡(OLYMPUS IX53)下分析樣本(×100)，選擇有意義的組織，經(jīng)登錄、編號、采集、分析、讀取數(shù)據(jù)。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法

將研碎的心肌組織加入細胞裂解液，低溫勻漿，離心，應(yīng)用SDS-PAGE進行蛋白分離，30%丙烯酰胺凝膠中電泳，CD63、CD81-200 mA、70分鐘條件下電轉(zhuǎn)膜，TBST封閉液浸泡PVDF膜于Bcl-2、Bid、tBid一抗中(稀釋比例分別為1∶1000、1∶1000、1∶2000)，4℃孵育過夜。再加入HRP標(biāo)記二抗(稀釋比例為1∶50000)，進行免疫反應(yīng)，ECL顯色系統(tǒng)顯色，保存結(jié)果圖片，用Image J圖像分析軟件分析膠片灰度值。以上小鼠心肌病理損傷檢測每組均選取3只小鼠的心肌組織進行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠膿毒癥心肌損傷模型鑒定

通過預(yù)實驗及天津市心血管中心發(fā)表的膿毒癥心肌損傷小鼠模型建立和評價[3]證實建模方法可靠，實驗結(jié)果顯示膿毒癥小鼠心肌組織在光鏡和電鏡下均可見心肌小血管周圍大量炎性細胞浸潤，心肌肌絲紊亂，細胞間質(zhì)水腫等表現(xiàn)。

2.2 透射電鏡下各組小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)改變情況

電鏡顯示，對照組心肌肌絲排列規(guī)則、整齊，粗細相見，各條帶均較清楚，肌節(jié)結(jié)構(gòu)正常，線粒體豐富，分布在肌絲之間，大小正常，形狀多為圓形和橢圓形，線粒體的嵴很密集，平行排列，基質(zhì)內(nèi)有較多致密的基質(zhì)顆粒。Sham組與對照組相比無明顯區(qū)別，膿毒癥小鼠心肌肌絲紊亂，線粒體腫脹明顯，部分出現(xiàn)“空泡樣變”、邊界不清晰、基質(zhì)密度降低、不均勻等。造模后12小時LPS模型組小鼠線粒體改變最嚴重，線粒體平均面積和體密度明顯增大，和Sham組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)過參附注射液處理小鼠心肌線粒體有明顯緩解情況，空泡樣變明顯減少，線粒體腫脹有所緩解，參附組較Sham組相比線粒體立體計量指標(biāo)均有明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳情見圖1及表1。

表1 各組別線粒體立體計量比較

注：A：正常對照組；B：Sham組；C組：LPS組；D組：SFI組；阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3分別對應(yīng)相應(yīng)組別的6小時、12小時、24小時。A組為正常對照組，只選取24小時進行心肌切片，故只有1張圖片圖1 電鏡下各組小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)影響(1 μm)

2.3 光鏡下各組小鼠心肌細胞凋亡情況

HE染色結(jié)果：與正常對照組相比，Sham組心肌結(jié)構(gòu)大致正常，LPS組心肌組織可見結(jié)構(gòu)破壞、纖維不完整、肌質(zhì)溶解、局部心肌壞死，間質(zhì)水腫以及炎性細胞浸潤，心肌細胞空泡樣變；SFI組心肌結(jié)構(gòu)基本完整，心肌纖維斷裂減少，間質(zhì)水腫明顯好轉(zhuǎn)，炎性細胞浸潤明顯改善，病理損害明顯減輕。詳細情況詳見圖2。

注：A：正常對照組；B：假膿毒癥組(Sham)；C：膿毒癥模型組(LPS)；D：參附組(SFI)圖2 各組小鼠心肌細胞HE染色(×100)

TUNEL染色結(jié)果：TUNEL檢測心肌細胞凋亡，正常細胞核呈淡藍色，形態(tài)清晰、完整。凋亡細胞核呈熒光色，研究顯示，與正常對照組相比，Sham組心肌組織凋亡無明顯變化，LPS組、SFI組小鼠心肌細胞 TUNEL 凋亡率均高于Sham組(P<0.05)，但SFI組較LPS組凋亡率明顯下降(P<0.05)。詳細情況詳見圖3。

2.4 各組小鼠心肌組織Bcl-2、Bid、tBid、Caspase-9表達水平變化

與對照組比較，造模后12小時LPS組小鼠心肌Bcl-2表達明顯抑制(P<0.05)，Bid、tBid、Caspase-9表達上調(diào)明顯(P<0.05)；SFI組小鼠心肌Bcl-2表達較LPS組明顯增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),同時SFI組Bid、tBid、Caspase-9表達較LPS組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。具體見圖4及表3。

表2 各組小鼠心肌細胞凋亡率的比較

表3 各組小鼠不同時間點心肌組織Bcl-2、Bid、tBid、Caspase-9灰度值比較

圖4 各組小鼠不同時間點心肌組織Bcl-2、Bid、tBid、Caspase-9蛋白表達

注：A：正常對照組；B：假膿毒癥組(Sham)；C：膿毒癥模型組(LPS)；D：參附組(SFI)圖3 各組小鼠心肌細胞TUNEL檢測及凋亡率比較(×100)

3 討論

膿毒癥，是宿主對感染產(chǎn)生的失控反應(yīng)，并出現(xiàn)危及生命的器官功能障礙。心臟是膿毒癥損傷中最為重要的靶器官。研究指出20%～60%的膿毒癥可發(fā)生心肌抑制[1]，膿毒癥誘導(dǎo)的心肌功能障礙(sepsis induced myocardial dysfunction，SIMD)死亡率更是高達50%～70%，心功能對膿毒癥患者的預(yù)后判斷起關(guān)鍵作用。目前關(guān)于膿毒癥心肌損傷的機制研究方向繁多，歸根結(jié)底，不同機制最終都會導(dǎo)致心肌細胞凋亡，這是膿毒癥心肌損傷的關(guān)鍵原因。

Bcl-2家族包括多結(jié)構(gòu)域抗凋亡蛋白(BH1-BH4)，多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白(BH1-BH3)和促凋亡BH3-only蛋白三大類。促凋亡成員和抗凋亡成員之間的相互平衡被破壞導(dǎo)致了凋亡的發(fā)生。當(dāng)抗凋亡蛋白占優(yōu)勢時，便可調(diào)節(jié)線粒體膜通透性，抑制凋亡發(fā)生。Bcl-2是其家族中最重要的抗凋亡蛋白，孫彬栩等[4]以及Zhang N等[5]的研究指出，Bcl-2可通過編碼自身蛋白而具有抗心肌細胞凋亡的功能。Bid是只含有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，它能裂解形成tBid，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細胞凋亡[6]。羅敏等[7]研究中，右美托咪定預(yù)處理的方式可促使心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白過表達，誘導(dǎo)Bax蛋白表達下降，最終有助于改善大鼠心肌缺血再灌注損傷。而陳華文等[8]對膿毒癥大鼠應(yīng)用丹參酮ⅡA，發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠心肌細胞Bcl-2蛋白表達會上調(diào)，心肌細胞凋亡則會相應(yīng)減少。本研究表明，小鼠注射LPS后通過促凋亡蛋白(Bad、t-Bid)激活細胞凋亡(Caspase-9)，同時減少抗凋亡蛋白Bcl-2，增加TUNEL凋亡細胞數(shù)，這些結(jié)果與之前報道一致。

參附注射液是一個由紅參、附片提取制成，被廣泛用于休克、心跳呼吸驟停、心力衰竭等急危重癥的中藥注射劑[9-11]，并且因為大量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，被眾多國內(nèi)急危重癥治療指南[12-13]收錄。參附注射液的藥理成分主要是人參皂苷[14]。研究證實參附注射液給藥劑量與體內(nèi)暴露量呈線性關(guān)系，多次給藥不影響藥物體內(nèi)代謝、無蓄積[15]。其作用包含了改善循環(huán)、干預(yù)血流動力學(xué)、保護臟器細胞、減輕炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、增強免疫、減輕腫瘤藥物化療的外周毒性作用等方面。本研究應(yīng)用參附注射液可減輕膿毒癥小鼠的心肌損傷，開拓了參附注射液的應(yīng)用范圍。本研究清楚地表明，與LPS組比較，SFI組小鼠心肌 Bcl-2 表達明顯上調(diào)，同時SFI組Bid、tBid、Caspace9表達較LPS組明顯降低(P<0.01)。Bcl-2水平的升高反映了線粒體對凋亡的易感性下降，且SFI組小鼠Bcl-2/Bid以及Bcl-2/tBid較LPS組明顯升高，說明參附注射液可以使Bcl-2的抗凋亡作用在細胞內(nèi)占優(yōu)勢。故參附注射液可以通過上調(diào)心肌細胞 Bcl-2 表達，下調(diào)Bid表達，抑制tBid活化，抑制Caspase-9釋放，減少膿毒癥小鼠心肌線粒體凋亡，反映SFI對線粒體凋亡的保護作用。此外，通過電鏡還觀察到脂多糖誘導(dǎo)的線粒體腫脹被SFI減輕，線粒體平均面積以及線粒體體密度均明顯下降，支持了SFI對線粒體凋亡的作用。

綜上，SFI可通過增加Bcl-2的表達，降低Bid、t-Bid的表達，改善LPS誘導(dǎo)的線粒體形態(tài)，保護線粒體的完整性，阻止caspase-9釋放，減少膿毒癥小鼠心肌細胞凋亡，減輕與膿毒癥相關(guān)的心肌損傷。