楊祥，徐長征，陳金華，孟勝利，王澤鋆，申碩，陳曉琦

1.武漢生物制品研究所有限責任公司病毒性疫苗研究一室，湖北武漢430207；2.國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430207

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）是一種由多種人腸道病毒（human enteroviruses，HEVs）引起的急性傳染疾病，多發(fā)于5歲以下兒童。臨床癥狀表現(xiàn)為手、足、口、臀等部位出疹及發(fā)熱等多種臨床癥狀。2008年5月2日，HFMD被納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的丙類傳染病進行管理。在中國，2012年前引起HFMD的主要病原為腸道病毒71型（enterovirus A71，EV-A71）和柯薩奇病毒A組16型（Coxsackievirus A16，CV-A16）［1-4］。近年來，柯薩奇病毒A組6型（Coxsackievirus A6，CV-A6）、柯薩奇病毒A組10型（Coxsackievirus A10，CV-A10）等病原導致的HFMD在印度、東亞、日本、歐洲等地持續(xù)增加［4-9］，已成為HFMD的主要病原，為HFMD的防控帶來更大的挑戰(zhàn)。本研究以武漢生物制品研究所有限責任公司生產(chǎn)的EV-A71疫苗Ⅳ期臨床研究為基礎(chǔ)，分析EV-A71疫苗干預(yù)后，HFMD相關(guān)腸道病毒病原譜的變化及分子流行病學特征，為HFMD的預(yù)防及多價HFMD疫苗的研發(fā)和臨床研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 標本 采集湖北省潛江市2019年5—12月，谷城縣2019年6—12月診斷為HFMD的患兒肛拭子樣本，于-80℃保存待檢。診斷標準參照《手足口病診療指南》（2018年版）。

1.2 主要試劑及儀器 核酸提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；EV-A71型 ／CV-A16型／CV-A10特異性及腸道病毒通用型RNA檢測試劑盒購自碩世生物科技股份有限公司；Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit和TaKaRa LA Taq購自寶日醫(yī)生物工程（北京）有限公司；ABI7500型熒光定量PCR儀和梯度PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 病毒R N A的提取 用核酸提取試劑盒提取樣本RNA，-80℃保存待用。

1.4 腸道病毒型別鑒定 提取的RNA用EV-A71型／CV-A16型／CV-A10特異性及腸道病毒通用型RNA檢測試劑盒，通過ABI7500型熒光定量PCR儀進行檢測。

1.5 腸道病毒V P1區(qū)部分基因序列擴增 使用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，以腸道病毒陽性樣品RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)參考文獻［10］合成引物（表1），對VP1區(qū)部分基因進行半巢式PCR擴增，反應(yīng)條件：95℃熱啟動5 min；95℃變性30 s，42℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸5 min。產(chǎn)物于-20℃保存。

表1 基于VP1區(qū)段腸道病毒分型鑒定通用引物Tab.1 Primers used for typing and characterization of VP1 region of enterovirus

1.6 序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將陽性產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行比對，確定病原的型別。再用DNAStar 7.0軟件對參考株和流行株進行核苷酸序列同源性分析，根據(jù)參考文獻［11-19］，選取國內(nèi)外CV-A6、CV-A10、CV-A16、CV-A5各基因型和基因亞型的代表參考株與2019年谷城縣和潛江市兩地的代表流行株，使用MEGA 6.0軟件通過鄰接法（neighbor-joining，NJ），p-distance模型構(gòu)建進化樹。通過1 000 Bootstrap評估建樹的可靠性，節(jié)點上顯示70%以上的Bootstrap值。

1.7統(tǒng)計學分析 應(yīng)用統(tǒng)計學軟件SPSS 23.0，采用卡方檢驗對標本的陽性檢出率進行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HF MD相關(guān)腸道病毒病原譜 共采集HFMD標本520份（谷城縣259份，潛江市261份），其中檢出腸道病毒陽性樣本490份，檢出陽性率為94.23%。谷城縣男性患兒陽性率為93.80%（121／129），女性患兒陽性率為93.08%（121／130），兩者差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.007，P＞0.05）；潛江市男性患兒陽性率為97.45%（153／157），女性患兒陽性率為91.35%（95／104），兩者差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.647，P＞0.05）。在實驗室檢測結(jié)果為腸道病毒陽性樣品中，共定型487份。其中谷城縣檢出腸道病毒陽性樣本242份，共檢出6種腸道病毒，構(gòu)成比分別為CV-A6 84.30%（204／242）、A16 2.48%（6／242）、A10 7.44%（18／242）、A5 3.31%（8／242）、A4 0.83%（2／242）、A8 0.41%（1／242）、其他未定型的腸道病毒（other enterovirus，Other HEV）1.24%（3／242）；潛江市檢出腸道病毒陽性樣本248份（含2份CV-A6、A10共感染），共檢出4種腸道病毒，構(gòu)成比分別為CV-A6 54.80%（137／250）、A16 40.4%（101／250）、A5 4.40%（11／250）、A8 0.40%（1／250）。見圖1。

圖1 谷城縣2019年6—12月（A）、潛江市2019年5—12月（B）腸道病毒陽性樣本各病原構(gòu)成比Fig.1 Constituent ratios of pathogens in enteroviruses positive samples in Gucheng County from June to December 2019（A）and in Qianjiang City from May to December 2019（B）

2.2 時間和年齡分布 谷城縣和潛江市兩地區(qū)2019年下半年HFMD的流行各有特點，在流行時間上：谷城縣HFMD病例各月分布較分散，9—11月出現(xiàn)1個高峰，而潛江市HFMD病例在時間分布上較為集中，集中在5—8月，見圖2。在年齡分布上：谷城縣和潛江市兩地區(qū)主要發(fā)病人群為5歲以下兒童，占比分別達100%和98.08%，其中以1~2歲年齡組占比最高，分別為68.73%和3.68%，見圖3。

圖2 谷城縣2019年6—12月（A）和潛江市2019年5—12月（B）HFMD病例月分布Fig.2 Monthly distribution of cases of HFMD in Gucheng County from June to December 2019（A）and in Qianjiang City from May to December 2019（B）

圖3 谷城縣2019年6—12月和潛江市2019年5—12月HFMD患兒年齡分布Fig.3 Age distribution of children with HFMD in Gucheng County from June to December 2019 and in Qianjiang City from May to December 2019

2.3 分子進化分析 進化樹見圖4，VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性見表2。結(jié)果表明，谷城縣、潛江市兩地區(qū)的CV-A6流行株均屬于D3亞型；谷城縣的CVA10流行株屬于C亞型；谷城縣的CV-A16流行株屬于B1a亞型，而潛江市的CV-A16流行株屬于B1b亞型；兩地區(qū)的CV-A5流行株與2016年澳大利亞參考株MH111030最為接近。

表2 4種主要病原CV-A6、CV-A10、CV-A16、CV-A5基于部分VP1區(qū)同源性分析Tab.2 Homology of partial VP regions of four main pathogens CV-A6，CV-A10，CV-A16 and CV-A5

圖4 CV-A6（A）、CV-A10（B）、CV-A16（C）、CV-A5（D）部分VP1區(qū)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on partial VP1 regions of CV-A6（A），CV-A10（B），CV-A16（C）and CV-A5（D）

續(xù)圖4 CV-A6（A）、CV-A10（B）、CV-A16（C）、CV-A5（D）部分VP1區(qū)進化樹Fig.4（Continued）Phylogenetic tree based on partial VP1 regions of CV-A6（A），CV-A10（B），CV-A16（C）and CV-A5（D）

3 討論

自2008年HFMD被列為我國法定丙類傳染病以來，截止2018年累計報告HFMD病例2 000多萬例，死亡3 670例，其中大部分重癥和死亡病例由EV-A71引起［18］，嚴重威脅著我國嬰幼兒的生命健康。2016、2017年，國內(nèi)3家公司的EV-A71疫苗相繼上市，HFMD相關(guān)重癥和死亡病例明顯減少。為了解疫苗干預(yù)后HFMD的病原譜特征，本研究以武漢生物制品研究所有限責任公司生產(chǎn)的EV-A71疫苗Ⅳ期臨床試驗為基礎(chǔ)，分析接種地區(qū)HFMD腸道病毒病原譜及分子流行病學特征。共收集谷城縣2019年6—12月和潛江市2019年5—12月兩地區(qū)疑似HFMD標本520份，未發(fā)現(xiàn)重癥和死亡病例，檢出腸道病毒陽性樣本490份，陽性率94.23%。共檢出6種不同型別的腸道病毒，未發(fā)現(xiàn)由EV-A71引起的HFMD，表明EV-A71疫苗對接種者產(chǎn)生了很好的保護效果。

在本次HFMD相關(guān)病原譜研究中，CV-A6在谷城縣、潛江市兩地區(qū)病原構(gòu)成比中均占比最高，分別達84.30%和54.80%，超過其他所有病原之和，是引起HFMD的主要病原。而目前已上市的單價EVA71疫苗對其他血清型腸道病毒引起的HFMD無交叉保護作用［20］，因此，加快包含CV-A6組分的多價HFMD疫苗研發(fā)，是目前防控HFMD的重要手段。根據(jù)參考文獻［11，20］，CV-A6在我國的流行可分為3個階段：第1階段是2009年以前，病例散發(fā)，以D2亞型為主；從2009—2012年為第2階段，CV-A6開始在廣東等地區(qū)小規(guī)模暴發(fā)，此時開始出現(xiàn)D3亞型，該階段為D2、D3亞型共流行；2013年以后，CV-A6引起的HFMD大規(guī)模暴發(fā)，此時流行的CV-A6以D3亞型為主。本研究結(jié)果顯示，谷城縣、潛江市兩地區(qū)的CV-A6均為D3亞型，與我國目前CV-A6的流行現(xiàn)狀一致。這可能與D3亞型毒株的毒力和傳播能力有關(guān)，盡管其分子機制還有待進一步研究，但對今后的疫苗研究及疾病防控具有重要意義。

此外，谷城縣、潛江市兩地區(qū)在HFMD病原構(gòu)成譜上具有明顯差異，CV-A16在潛江市HFMD病原構(gòu)成中占比第2位，達40.4%，而CV-A16在谷城縣HFMD病原構(gòu)成中占比較低，僅為2.48%。通過進化樹的構(gòu)建和分析顯示，兩地區(qū)流行的CV-A16屬于不同亞型，潛江市流行株均屬于B1b亞型，谷城縣流行株均屬于B1a亞型。兩地區(qū)流行的CV-A16亞型不同，在病原構(gòu)成譜中占比差異明顯，推測兩地區(qū)CV-A16流行株的傳播能力不同，B1b亞型的傳播能力強于B1a亞型。

谷城縣病原構(gòu)成中占比第2位的是CV-A10（7.44%），通過進化樹的構(gòu)建和分析顯示，谷城縣流行的CV-A10為C亞型，與近年來國內(nèi)CV-A10流行株的亞型一致。而潛江市未發(fā)現(xiàn)由CV-A10引起的HFMD，可能是由于潛江市嬰幼兒體內(nèi)存在抗CVA10母傳抗體的比例較高［21］。因此，對于由多種病原引起的HFMD的防控，僅依靠單價疫苗很難大幅度降低其發(fā)病率，研發(fā)多價HFMD疫苗是預(yù)防HFMD最有效的手段。另外需要關(guān)注的是，CV-A5在兩地區(qū)的病原構(gòu)成中均占據(jù)第3位，分別為谷城縣3.31%、潛江市4.40%，有進一步成為優(yōu)勢病原體的趨勢，而目前關(guān)于該病毒的相關(guān)研究較少，因此需增加對CVA5的相關(guān)研究，以便更準確地預(yù)防與診斷由CV-A5引起的疾病。

綜上所述，2019年EV-A71疫苗在湖北潛江市和谷城縣兩地區(qū)接種后，均未發(fā)現(xiàn)由EV-A71引起的HFMD，表明EV-A71疫苗對接種者產(chǎn)生了良好的保護效果。EV-A71疫苗接種后，兩地區(qū)病原構(gòu)成均以CV-A6為主，其他病原中CV-A10和CV-A5分別占據(jù)一定比例，潛江市CV-A16占比較高。通過對EV-A71疫苗干預(yù)后HFMD相關(guān)腸道病毒病原譜研究及主要病原VP1序列的分子進化分析，為HFMD的預(yù)防及多價HFMD疫苗的研發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持。