付霞麗，鄭紫方，馬志倩，徐樂(lè)樂(lè)，李志偉，李洋，肖書(shū)奇，李爽

酸性硫酸鈣對(duì)臨床常見(jiàn)致病微生物的殺滅能力

付霞麗，鄭紫方，馬志倩，徐樂(lè)樂(lè)，李志偉，李洋，肖書(shū)奇，李爽

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100

【】研究消毒劑酸性硫酸鈣（ACS）對(duì)微生物的殺滅效果，為用消毒劑防控人畜疫病提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。將ACS與中和劑（3%卵磷脂、5%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液）共孵育一段時(shí)間后，再分別加入大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）共培養(yǎng)一段時(shí)間，將與細(xì)菌的混合物涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)18—24 h；將與病毒的混合物接種于細(xì)胞板，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一定時(shí)間，評(píng)價(jià)中和劑的中和效果。其對(duì)照設(shè)置和評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)如下：消毒劑+菌懸液或病毒懸液（第1組），（消毒劑+菌懸液或病毒懸液）+中和劑（第2組），（中和劑+消毒劑）+菌懸液或病毒懸液（第3組），（無(wú)菌硬水+菌懸液或病毒懸液）+中和劑（第4組），（無(wú)菌硬水+菌懸液或病毒懸液）+PBS（第5組），無(wú)菌硬水+PBS（第6組）；細(xì)菌殺滅試驗(yàn)中和劑效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：第1組有極少量細(xì)菌生長(zhǎng)或無(wú)菌生長(zhǎng)，第2組有菌生長(zhǎng)且明顯少于第3、4、5組但多于第1組，第3、4、5組細(xì)菌數(shù)接近且與陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)菌數(shù)接近，第6組無(wú)菌生長(zhǎng)，3次重復(fù)試驗(yàn)均符合上述條件，結(jié)果一致，判定所選中和劑及濃度合適；病毒滅活試驗(yàn)中和劑效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：第1組有極少量病毒生長(zhǎng)或無(wú)病毒生長(zhǎng)，第2組有病毒生長(zhǎng)且明顯少于第3、4、5組但多于第1組，第3、4、5組病毒生長(zhǎng)與原接種量相近，第6組細(xì)胞正常生長(zhǎng)，3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致，判定所選中和劑及濃度合適。利用懸液定量殺菌法和測(cè)定病毒滴度的方法評(píng)價(jià)ACS對(duì)上述細(xì)菌和病毒的消滅效果，將ACS 稀釋200、300、400、500、600、700倍分別與上述細(xì)菌或病毒作用不同時(shí)間后加入中和劑進(jìn)行中和，然后將細(xì)菌混合物涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，通過(guò)計(jì)算菌落數(shù)評(píng)價(jià)ACS殺滅細(xì)菌的效果，測(cè)定病毒混合物中病毒滴度評(píng)價(jià)ACS對(duì)病毒的殺滅效果。所選用的中和劑能夠有效地中和ACS 200倍稀釋液對(duì)細(xì)菌和病毒的殘留作用，且該中和劑對(duì)細(xì)菌、病毒和細(xì)胞無(wú)毒性。當(dāng)ACS與細(xì)菌作用0 h后立即被中和，最大稀釋300倍對(duì)大腸桿菌的滅菌率為100%，最大稀釋600倍對(duì)金黃色葡萄球菌的滅菌率為100%，最大稀釋700倍時(shí)對(duì)沙門(mén)氏菌的滅菌率為100%。當(dāng)ACS 稀釋至700倍時(shí)，分別與上述細(xì)菌作用1d或6d后被中和，滅菌率均為100%；此外，ACS稀釋200倍時(shí)，與PRRSV作用60 min后被中和，未檢測(cè)出病毒滴度。ACS稀釋700倍與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌作用1 d或1 d以上均能產(chǎn)生較好的殺滅效果；ACS稀釋200倍與PRRSV作用60 min能完全殺滅病毒。這可為養(yǎng)殖場(chǎng)選用消毒劑防控疫病提供參考。

酸性硫酸鈣；微生物；中和劑；殺滅效果

0 引言

【研究意義】大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是危害人或動(dòng)物健康的病原微生物，環(huán)境中若不能及時(shí)清除這些微生物，很容易造成疾病的暴發(fā)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。如大腸桿菌可以導(dǎo)致人、畜和禽呼吸道和消化道感染，對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成巨大威脅[1-2]。金黃色葡萄球菌可引起多種感染，造成呼吸道疾病以及其繼發(fā)的敗血癥，威脅人類(lèi)健康。此外，由金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的葡萄球菌乳腺炎嚴(yán)重影響牛羊等家畜的健康及乳制品品質(zhì)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。沙門(mén)氏菌是食源性致病菌，傳播力強(qiáng)、致病力高，每年沙門(mén)氏菌感染造成約1.15億人患病和約37萬(wàn)人死亡，是公共衛(wèi)生和食品安全的重要防控對(duì)象[6]。PRRSV可導(dǎo)致妊娠母豬繁殖障礙以及保育豬、生長(zhǎng)豬和育肥豬的呼吸道疾病，是長(zhǎng)期威脅養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要病原[7]。高效的消毒劑對(duì)防控病毒和細(xì)菌等致病微生物的傳播具有重要意義，如消毒劑在防控新型冠狀病毒的過(guò)程中發(fā)揮了不可替代的作用。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用一種安全且高效的消毒劑對(duì)人和動(dòng)物的健康尤為重要。同時(shí)，消毒劑的不同作用時(shí)間和不同作用濃度對(duì)于其發(fā)揮消毒效果具有重大影響，因此，在應(yīng)用高效消毒劑時(shí)，要選擇合適的濃度和作用時(shí)間。酸性硫酸鈣（ACS）是一種新型酸化劑，由氫氧化鈉、硫酸鈣、硫酸為原料混合而成，其化學(xué)本質(zhì)是一種IIA族絡(luò)合物（AGIIS）的酸性溶液，但ACS中的IIA族絡(luò)合物AGIIS的元素排列與氫氧化鈣類(lèi)似，這種特殊的結(jié)構(gòu)使ACS在具備強(qiáng)酸特性的同時(shí)不具備較強(qiáng)的腐蝕性[8-11]，并且能與水以任意比例互溶[12]。ACS最開(kāi)始是以食品添加劑的方式從美國(guó)引進(jìn)[13-15]，近年來(lái)該化合物作為抑菌和殺毒劑，逐漸引起人們重視。【前人研究進(jìn)展】張利平等發(fā)現(xiàn)ACS在700倍稀釋時(shí)殺滅金黃色葡萄球菌的效果與350 mg·L-1有效氯相當(dāng)[16]。王勁等發(fā)現(xiàn)ACS對(duì)載體表面細(xì)菌繁殖體有較好的殺菌效果，且穩(wěn)定性好[17]。談智等發(fā)現(xiàn)ACS對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒具有較強(qiáng)的抑制作用[18]。吉鐘山等發(fā)現(xiàn)ACS殺滅微生物的效果與它的pH呈反比，即ACS的pH越高，其殺滅微生物的能力越弱[19]。ACS出色的抑菌和殺毒能力可能與其強(qiáng)酸特性有關(guān)[20]。基于ACS優(yōu)良的抗微生物性能，且使用較為安全，不影響食品色澤和口感，低毒無(wú)害，被廣泛應(yīng)用到食品防腐保鮮[21-22]、肉質(zhì)品防腐、蔬果保鮮中，以減少蔬菜和水果中的生物毒素殘留[23-28]。2016年黃明杰等研究表明，ACS 食品保鮮機(jī)制可能是其創(chuàng)造較低的pH環(huán)境限制了大多數(shù)微生物的生存空間，使微生物不能生存[29]。ACS除了可以保鮮食品，還具有其他優(yōu)良特點(diǎn)。BENLI等發(fā)現(xiàn)ACS添加到雞的飲用水中，可增加雞腸壁的厚度，使其不易破裂，提高飼料的轉(zhuǎn)化率[30]。且ACS作為膳食補(bǔ)充劑對(duì)蝦進(jìn)行飼喂能提高蝦的免疫力[31]。此外，在飼料中添加ACS降低了豬的腹瀉率，且不影響豬肉品質(zhì)[32]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于大腸桿菌在環(huán)境中廣泛存在、金黃色葡萄球菌具有抗生素耐藥性、沙門(mén)氏菌血清型多樣化和PRRSV基因組的快速變異等問(wèn)題，通過(guò)經(jīng)典藥物抑制或疫苗預(yù)防這些病原微生物的傳播困難較大。利用新型藥物消滅致病微生物，可從源頭遏制疾病的傳播。ACS具有優(yōu)良的殺滅病原微生物的能力，但是ACS的劑量和作用時(shí)間嚴(yán)重影響其效力，且不同微生物對(duì)藥物的反應(yīng)性不盡相同。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬通過(guò)懸液定量殺菌法和病毒滴度測(cè)定法研究ACS對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的最佳抑制時(shí)間和濃度，并明確ACS在短時(shí)間內(nèi)抑制PRRSV復(fù)制的效果，為拓寬ACS的應(yīng)用范圍、防治人畜疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

研究于2019年在西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院完成。

1.2 試驗(yàn)材料

硬水(硬度為342 mg·mL-1)由0.034 g氯化鈣、0.139 g氯化鎂加蒸餾水至1 000 mL配置而成。中和劑由含3%的卵磷脂、5%的吐溫-80的磷酸鹽緩沖液配置而成。

ACS為無(wú)色透明液體，無(wú)特殊氣味。進(jìn)行殺菌試驗(yàn)時(shí)，用無(wú)菌硬水配制成不同濃度的稀釋液。

試驗(yàn)所用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、PRRSV均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物病原微生物防控實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌懸液與病毒懸液的制備 細(xì)菌懸液的制備：取試驗(yàn)菌株的斜面營(yíng)養(yǎng)瓊脂新鮮培養(yǎng)物（37℃培養(yǎng)18—24 h），用無(wú)菌吸管吸取胰蛋白胨生理鹽水（TPS）將斜面菌苔洗下，震蕩混勻，制成細(xì)菌懸液備用（菌數(shù)范圍1×108—5×108cfu·mL-1）[33]。

病毒懸液制備：將MARC-145細(xì)胞鋪布于T75細(xì)胞瓶中，用含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h（細(xì)胞密度為80%—90%），將病毒接種于培養(yǎng)有MARC-145的細(xì)胞瓶中。待有80%—90%的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）時(shí)收獲病毒，制備病毒懸液，按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)組織感染量（median tissue culture infective dose，TCID50）[34]。

1.3.2 中和劑鑒定試驗(yàn) 細(xì)菌殺滅試驗(yàn)中和劑鑒定試驗(yàn)：設(shè)計(jì)6組試驗(yàn)：消毒劑+菌懸液（第1組）、（消毒劑+菌懸液）+中和劑（第2組）、（中和劑+消毒劑）+菌懸液（第3組）、（無(wú)菌硬水+菌懸液）+中和劑（第4組）、（無(wú)菌硬水+菌懸液）+PBS（第5組）、無(wú)菌硬水+PBS（第6組）。結(jié)果判定：第1組有極少量細(xì)菌生長(zhǎng)或無(wú)菌生長(zhǎng)；第2組有菌生長(zhǎng)且明顯少于第3、4、5組，但多于第1組；第3、4、5組細(xì)菌數(shù)接近且與陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)菌數(shù)接近；第6組無(wú)菌生長(zhǎng)。3次重復(fù)試驗(yàn)均符合上述條件，結(jié)果一致，判定所選中和劑及濃度合適[35]。

病毒滅活試驗(yàn)中和劑鑒定：試驗(yàn)設(shè)計(jì)6組：消毒劑+病毒懸液（第1組）、（消毒劑+病毒懸液）+中和劑（第2組）、（中和劑+消毒劑）+病毒懸液（第3組）、（無(wú)菌硬水+病毒懸液）+中和劑（第4組）、（無(wú)菌硬水+病毒懸液）+PBS（第5組）、無(wú)菌硬水+PBS（第6組）。結(jié)果判定：第1組有極少量病毒生長(zhǎng)或無(wú)病毒生長(zhǎng)；第2組有病毒生長(zhǎng)且明顯少于第3、4、5組，但多于第1組；第3、4、5組病毒生長(zhǎng)與原接種量相近；第6組細(xì)胞正常生長(zhǎng)。3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致，判定所選中和劑及濃度合適[18]。

1.3.3 定量殺菌試驗(yàn) 試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，將ACS用無(wú)菌硬水分別稀釋200、300、400、500、600、700倍。取稀釋好的消毒液4.5 mL（陽(yáng)性對(duì)照為無(wú)菌硬水）加入無(wú)菌試管中，隨后加入0.5 mL細(xì)菌懸液，充分混勻，作用不同時(shí)間后，取0.5 mL菌藥混合物（細(xì)菌懸液+消毒劑）放入含有4.5 mL中和劑試管中，充分混勻，作用10 min后稀釋接種，37℃培養(yǎng)18—24 h后活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算殺菌率：殺菌率（%）=1-（殘存菌數(shù)/總菌數(shù)）×100。試驗(yàn)重復(fù)3次每次2個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.4 病毒滅活試驗(yàn) 將ACS用無(wú)菌硬水分別稀釋200、300、400、500、600、700倍。取稀釋好的消毒液0.5 mL加入指形管中，室溫放置5 min后加入0.5 mL病毒懸液，混勻，作用至規(guī)定時(shí)間后，取0.1 mL加入0.9 mL的中和劑中，中和10 min，隨后取出適量中和后的混合液進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)阡伜玫腗ARC-145的96孔板中測(cè)定病毒滴度。平均滅活對(duì)數(shù)值按下式計(jì)算：設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組（病毒）平均病毒感染滴度為N0，試驗(yàn)組（消毒劑）平均病毒感染滴度為NX，平均滅活對(duì)數(shù)值=lgN0-lgNX。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 中和劑鑒定

2.1.1 定量殺菌試驗(yàn)中和劑鑒定 用含3%卵磷脂，5%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液作為中和劑，可有效中和ACS 200倍稀釋液對(duì)試驗(yàn)菌的殘留作用，且中和劑溶液對(duì)試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)和培養(yǎng)基狀態(tài)均無(wú)影響（表1）。

2.1.2 病毒滅活試驗(yàn)的中和劑鑒定 試驗(yàn)結(jié)果表明，含3%卵磷脂，5%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液可有效中和ACS 200倍稀釋時(shí)對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的殘留作用，且中和劑溶液和中和產(chǎn)物對(duì)MARC-145細(xì)胞的生長(zhǎng)和病毒滴度均無(wú)影響（圖1）。

表1 定量殺菌試驗(yàn)中和劑中和后的各試驗(yàn)菌的菌落數(shù)

A：只加正常培養(yǎng)基的MARC-145細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；B：加過(guò)中和劑的MARC-145細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；C: 加過(guò)消毒劑的MARC-145細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；D: 加過(guò)中和產(chǎn)物的MARC-145細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

2.2 定量殺菌試驗(yàn)

2.2.1 ACS與大腸桿菌作用 ACS與大腸桿菌懸液混勻后立即用中和劑中和，然后平板培養(yǎng)、計(jì)數(shù)（圖2），其在200、300倍稀釋時(shí)的滅菌率均為100%，在400倍稀釋時(shí)滅菌率為99.65%，500倍稀釋時(shí)滅菌率為99.3%，600倍稀釋時(shí)滅菌率為97.25%，700倍稀釋時(shí)滅菌率91.54%；ACS與大腸桿菌懸液混勻后室溫培養(yǎng)1d后再用中和劑中和，其滅菌率在200、300、400、500、600、700倍稀釋時(shí)均為100%；ACS與大腸桿菌懸液混勻后室溫培養(yǎng)6d后再用中和劑中和，其滅菌率在200、300、400、500、600、700倍稀釋時(shí)均為100%（表2）。

2.2.2 ACS與金黃色葡萄球菌作用 ACS與金黃色葡萄球菌懸液混勻后立即用中和劑中和，然后平板培養(yǎng)、計(jì)數(shù)（圖3），其在200、300、400、500、600倍稀釋時(shí)的滅菌率均為100%，在700倍稀釋時(shí)滅菌率為98.32%；ACS與金黃色葡萄球菌懸液混勻后室溫培養(yǎng)1d后用中和劑中和，其滅菌率在200、300、400、500、600、700倍稀釋時(shí)均為100%；ACS與金黃色葡萄球菌懸液混勻后室溫培養(yǎng)6d后用中和劑中和，其滅菌率在200、300、400、500、600、700倍稀釋時(shí)均為100%（表3）。

表2 不同稀釋倍數(shù)的ACS對(duì)大腸桿菌的殺滅率

表3 不同稀釋倍數(shù)的ACS對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅率

2.2.3 ACS與沙門(mén)氏菌作用 ACS與沙門(mén)氏菌懸液無(wú)論是混勻后立即中和，還是培養(yǎng)1或6d后中和，其滅菌率在200、300、400、500、600、700倍稀釋時(shí)均為100%（表4，圖4）。

2.3 病毒滅活試驗(yàn)

ACS與PRRSV懸液作用60 min后，測(cè)得各個(gè)稀釋倍數(shù)的病毒滴度為：200倍稀釋時(shí)的病毒滴度的對(duì)數(shù)值為0，300倍稀釋時(shí)為2.94，400倍稀釋時(shí)為4.56，500倍稀釋時(shí)為4.63，600倍稀釋時(shí)為4.69，700倍稀釋時(shí)為4.75，陽(yáng)性對(duì)照組為7.13（表5）。通過(guò)公式：平均滅活對(duì)數(shù)值=lgN0-lgNX計(jì)算ACS各稀釋濃度的平均滅活對(duì)數(shù)值。200倍稀釋時(shí)的平均滅活對(duì)數(shù)值為7.13，300倍稀釋時(shí)為4.19，400倍稀釋時(shí)為2.57，500倍稀釋時(shí)為2.50，600倍稀釋時(shí)為2.44，700倍稀釋時(shí)為2.38（表6）。

表5 與不同稀釋度的ACS作用后的病毒滴度對(duì)數(shù)值

表6 不同稀釋倍數(shù)的ACS對(duì)PRRSV的平均滅活對(duì)數(shù)值

3 討論

在2020年抗擊新冠疫情的戰(zhàn)役中，消毒劑發(fā)揮了不可替代的作用，它能及時(shí)殺滅環(huán)境中存在的新型冠狀病毒，有效切斷病毒的傳播途徑[36-38]。這使得人們對(duì)消毒劑在疫病防控中的作用有了更深刻的認(rèn)識(shí)。在畜牧業(yè)中，每年因養(yǎng)殖環(huán)境消毒效果不理想所致畜禽疾病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。濫用抗生素導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，更加重了對(duì)致病微生物防治的困難。大腸桿菌是一種常見(jiàn)的危害人和動(dòng)物健康的致病菌，能引起人和動(dòng)物腹瀉、出血性腸炎，更嚴(yán)重者可導(dǎo)致溶血性尿毒綜合征、終末期腎病。該菌在環(huán)境中存活率極高，普通藥物難以消滅[1-2]。金黃色葡萄球菌為呼吸道感染常見(jiàn)致病菌，是人和動(dòng)物獲得性感染的一種主要致病菌，可引起化膿性皮膚組織感染、肺炎，重癥者可引起膿毒血癥、中毒性休克綜合征等危及生命[3-4]。沙門(mén)氏菌是一種危害較大的食源性致病菌，在我國(guó)細(xì)菌性食物中毒中，有70%—80%是由沙門(mén)氏菌引起的。PRRSV是豬場(chǎng)疫病防控的主要對(duì)象，因PRRSV破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，至今沒(méi)有有效的疫苗可徹底地控制該病毒的感染。因此，研究開(kāi)發(fā)一種新型技術(shù)攻克致病微生物較難消滅的問(wèn)題顯得尤為重要。消毒劑作為廣譜抗菌劑，因價(jià)格便宜、使用方便，在畜牧業(yè)中被廣泛使用。常見(jiàn)的消毒劑有乙醇、含氯消毒劑、二氧化氯、過(guò)氧乙酸、過(guò)氧化氫、季銨鹽類(lèi)消毒劑。這些消毒劑雖能產(chǎn)生較好的消毒效果，但具有刺激氣味或腐蝕性，在日常使用時(shí)受到諸多限制。開(kāi)發(fā)一種新型消毒劑迫在眉睫。

ACS作為一種酸化劑，一開(kāi)始從美國(guó)引進(jìn)，后來(lái)逐漸在國(guó)內(nèi)推廣，常作為防腐劑廣泛應(yīng)用于即食肉制品的防腐，如牛肉、火腿等，也作為殺蟲(chóng)劑，替代其它有害殺蟲(chóng)劑殺滅軟體昆蟲(chóng)，減少樹(shù)葉和果品霉變[27,30]。ACS強(qiáng)酸低腐蝕的特性，使其作為消毒劑逐漸應(yīng)用于畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等。由于我國(guó)引進(jìn)ACS時(shí)間較短，其功效尚未被業(yè)界廣泛認(rèn)可，因此關(guān)于其殺滅微生物的相關(guān)研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)通過(guò)研究不同濃度ACS對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌的殺滅效果，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌對(duì)ACS的敏感性不同。其中，沙門(mén)氏菌對(duì)ACS最為敏感，其次為金黃色葡萄球菌，最后為大腸桿菌。把不同稀釋比例的ACS分別與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌作用不同時(shí)間，發(fā)現(xiàn)ACS稀釋700倍，與菌液作用1 d或1 d以上，能達(dá)到100%的滅菌效果。以上結(jié)果可為生產(chǎn)應(yīng)用提供參考，減少ACS用量，節(jié)約成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。

除此之外，本研究還探究了ACS對(duì)PRRSV的殺滅效果。PRRSV是對(duì)豬場(chǎng)危害性較大的一種RNA病毒，導(dǎo)致豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)，該病主要以懷孕母豬嚴(yán)重的生殖障礙以及各年齡段豬呼吸系統(tǒng)疾病為特征，每年給我國(guó)畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[39-40]。該病毒可通過(guò)分泌物在群體中傳播，消滅環(huán)境中的PRRSV將有助于PRRS的防控工作。本研究結(jié)果表明，ACS稀釋200倍時(shí)與PRRSV作用60 min能完全殺滅該病毒，對(duì)PRRSV有較好的殺滅效果。ACS具有低腐蝕性，有望作為一種新興消毒劑廣泛應(yīng)用于PRRSV的預(yù)防工作中。

4 結(jié)論

驗(yàn)證了酸性硫酸鈣對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌的殺滅效果，沙門(mén)氏菌對(duì)酸性硫酸鈣最為敏感，其次是金黃色葡萄球菌，最后是大腸桿菌。并且酸性硫酸鈣稀釋700倍時(shí)與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌懸液作用1 d或1 d以上能達(dá)到100%的滅菌效果。200倍稀釋的酸性硫酸鈣作用60 min能完全殺滅豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

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The Ability of Acidic Calcium Sulfate to Kill Common Clinical Pathogenic Microorganisms

FU XiaLi, ZHENG ZiFang, MA ZhiQian, XU LeLe, LI ZhiWei, LI Yang, XIAO ShuQi, LI Shuang

College of Veterinary Medicine, Northwest Agricultural and Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi

【】The purpose was to study the effect of disinfectant acid calcium sulfate (ACS) on the killing of microorganisms, and to provide basic data and theoretical basis for disinfectant prevention and control of human and animal diseases.【】After incubating ACS with 3% lecithin and 5% Tween-80 as phosphate buffer neutralizer for a period of time,,,and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) were added respectively for a period of time, We spread the culture mixture with bacteria on nutrient agar plates and cultured at 37℃ biochemical incubator for 18-24 h, the mixture with virus was inoculated on the cell plates and incubate in 37℃ cell incubator for a certain period of time to evaluate the neutralizing effect of the neutralizer. The comparison settings and evaluation criteria were as follows: disinfectant mixed with bacterial suspension or virus suspension (group 1), the mixture of disinfectant and bacterial suspension or virus suspension was mixed with neutralizer (group 2), the mixture of neutralizer and disinfectant was mixed with bacterial suspension or virus suspension (group 3), the mixture of sterile hard water and bacterial suspension or virus suspension was mixed with neutralizer (group 4), the mixture of sterile hard water and bacterial suspension or virus suspension was mixed with PBS (group 5), sterile hard water mixed with PBS (group 6). The evaluation criteria of the neutralizer effect in the bacteria killing test were as follows: group 1 had a very small amount of bacterial growth or aseptic growth; group 2 had bacterial growth, which was significantly less than that of groups 3, 4, and 5, but more than the group 1; the number of bacteria in group 3, 4,5 was close to that of the positive control group, no bacterial growth in group 6. All three repeated tests met the above conditions, and the results were consistent, it was determined that the selected neutralizer and concentration were appropriate. The evaluation criteria of the neutralizer effect in the virus inactivation test were as follows: group 1 had very little virus growth or no virus growth; group 2 had virus growth and was significantly less than that of groups 3, 4, and 5, but more than group 1. The growth of viruses in groups 3, 4, and 5 was similar to the original inoculation; the cells in group 6 grew normally. The results of the three repeated tests were consistent, and it was determined that the selected neutralizer and concentration were appropriate. We used the suspension quantitative sterilization method and the method of determining the virus titer to evaluate the elimination effect of ACS on the above-mentioned bacteria and viruses. We diluted the ACS 200, 300, 400, 500, 600, and 700 times to interact with the above-mentioned bacteria or virus for different time and added neutralizer for neutralization, then spread the bacterial mixture on nutrient agar plates to evaluate the killing effect of ACS by calculating the number of colonies, and determined the virus titer in the virus mixture to evaluate the killing effect of ACS on the virus.【】 The selected neutralizer can effectively neutralize the residual effects of ACS 200-fold dilution on bacteria and viruses, and the neutralizer was non-toxic to bacteria, viruses and cells. When ACS interacted with the bacteria for 0 h, it was neutralized immediately. The sterilization rate ofat the maximum dilution of 300 times was 100%, the sterilization rate ofat the maximum dilution of 600 times was 100%, and when the maximum dilution was 700 times, the sterilization rate of Salmonella was 100%. When ACS was diluted to 700 times, it was neutralized one day or six days after treatment with the above bacteria, and the sterilization rate was 100%. In addition, when ACS was diluted to 200 times, it was neutralized 60 minutes after treatment with PRRSV, and no virus titer was detected.【】When ACS diluted 700 times with,andfor one day or more, it can produce better killing effect; when ACS diluted 200 times with PRRSV for 60 minutes, it can completely kill the virus, which will provide strong data support for the selection of disinfectants in the farms and provide reference for the prevention and control of epidemic diseases.

acid calcium sulfate; microbial; neutralizing agent; killing effect

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.13.018

2020-06-01；

2020-12-30

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFD0500605）、陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019NY-076）、陜西高校青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目、西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（TGZX2020-24）

付霞麗，Tel：18702910446；E-mail:1579459296@qq.com。通信作者李爽，Tel：18700192876；E-mail：lishuang2006001@126.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）