丁 婷，李 勇

益生菌是一類(lèi)定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能改善人體微生態(tài)平衡，發(fā)揮有益作用的活性微生物[1]。它不僅是一種食品補(bǔ)充劑，而且具有多種生理功能，如控制體內(nèi)毒素，提高免疫力，預(yù)防病菌感染，降血壓，調(diào)節(jié)膽固醇，抑腫瘤，減少食物過(guò)敏反應(yīng)，緩解乳糖不耐受癥狀，預(yù)防心血管疾病以及延緩衰老等。尤其在調(diào)節(jié)腸道菌群組成，改善胃腸道功能，維持腸道生態(tài)平衡和健康等方面具有特殊的功效[2-6]。當(dāng)人體某些生理?xiàng)l件改變時(shí)，如病原菌感染、抗生素類(lèi)藥物的使用等會(huì)引起腸道菌群紊亂，腸道微生態(tài)環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致一系列癥狀的發(fā)生，如腹瀉、便秘、腸胃炎等，影響人體健康，此時(shí)需要補(bǔ)充益生菌。然而，益生菌產(chǎn)品在加工、運(yùn)輸、貯藏、銷(xiāo)售以及食用過(guò)程中活菌數(shù)下降很快，溫度、基質(zhì)及氧氣等外界因素均會(huì)影響菌株的活力，某些益生菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求很高，對(duì)氧氣極為敏感，對(duì)低pH 環(huán)境抵抗力差，活性保持較困難[7-8]。此外，益生菌在食用后需通過(guò)胃環(huán)境，然而，因胃酸的殺菌作用，致活性益生菌大量死亡。這也使很多市售益生菌產(chǎn)品的活菌數(shù)降低，達(dá)不到對(duì)人體的益生效果。添加益生菌促生長(zhǎng)因子（益生元）是提高益生菌存活率的有效途徑?，F(xiàn)被廣泛應(yīng)用的益生元有菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、葡聚糖等，然而，這些快速發(fā)酵性寡糖能引起人體腹瀉和脹氣等弊端[9]。探索對(duì)益生菌有益生效應(yīng)的物質(zhì)及方法，提高其對(duì)高溫、氧氣、胃酸及膽汁等不良環(huán)境因子的抵抗能力，增強(qiáng)對(duì)人體生理健康的維護(hù)作用具有重要意義。

嗜酸乳桿菌是益生菌家族中的一種，其營(yíng)養(yǎng)保健及治療作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。嗜酸乳桿菌具有抑制腸道不良微生物的增殖，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高乳糖消化性等多種益生功能，在食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[10-11]。乳清蛋白水解物（Whey Protein Hydrolysate，WPH）是通過(guò)將新鮮的甜味乳清經(jīng)特殊工藝處理后，再經(jīng)酶解得到的肽和游離氨基酸的混合物，具有提高產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)和功能的作用，常用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)等領(lǐng)域。本研究以嗜酸乳桿菌為研究對(duì)象，探究乳清蛋白水解物對(duì)細(xì)菌的益生效應(yīng)及機(jī)制，為提高益生菌的存活率和市售產(chǎn)品的穩(wěn)定性、營(yíng)養(yǎng)性提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）JC1 由本實(shí)驗(yàn)室保藏。菌株使用前按照1%的比例接種于滅菌的MRS 肉湯培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)24 h （37 ℃，160 r/min），經(jīng)3 次傳代，使菌種恢復(fù)活力。MRS 液體培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。乳清蛋白水解物 （8350 Whey Protein Hydrolysate，Hilmar 公司提供）為淡黃色粉末，主要成分為蛋白質(zhì)、肽和氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸含量較多。

1.2 WPH 濃度對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響

將MRS 液體培養(yǎng)基用移液管分裝到20 mL厭氧管中，置于121 ℃滅菌鍋中滅菌15 min。以MRS 培養(yǎng)基為空白對(duì)照，分別加入0.2%，0.4%，0.8%，1.6%的WPH，以1.6%菊粉作為對(duì)照，接種活化3 代的1%嗜酸乳桿菌，37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔4 h 取1 次樣，用MRS 固體培養(yǎng)基（MRS 固體培養(yǎng)基為液體MRS 培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂） 采用二倍稀釋法進(jìn)行樣品稀釋?zhuān)? 個(gè)合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度3 個(gè)重復(fù)，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后對(duì)嗜酸乳桿菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3 嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)變化規(guī)律研究

微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型可以計(jì)算微生物的延滯期和最大比生長(zhǎng)速率等數(shù)值。常用的微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型有：Gompertz 模型、修正的Gompertz模型、修正的Logistic 模型、Monod 模型、Baranyi and Robertz 模型、Richards 模型、Stannard 模型和Schnute 模型等[12]。分別用修正的Gompetz 模型、修正的Logistic 模型非線(xiàn)性擬合不同培養(yǎng)基中的嗜酸乳桿菌隨時(shí)間的變化情況并描述微生物的變化規(guī)律。

（1）修正的Gompertz 模型 修正的Gompertz模型表達(dá)式為：

式中：t——時(shí)間，h；Nt——時(shí)間t 時(shí)的菌數(shù)，CFU/mL；Nmax——最大菌數(shù)，CFU/g；N0——初始菌數(shù)，CFU/g；μmax——最大生長(zhǎng)速率，h-1；λ——生長(zhǎng)延滯時(shí)間，h。

（2）修正的Logistic 模型 修正的Logistic 模型的公式為：

式中：Nt——t 時(shí)的菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值，CFU/mL；N0——初始菌落數(shù)CFU/mL；A——擬合參數(shù)；μmax——最大比生長(zhǎng)速率，h-1；λ——生長(zhǎng)延滯時(shí)間，h。

1.4 嗜酸乳桿菌對(duì)WPH 的利用情況

稱(chēng)取8.6 mg 異硫氰酸熒光素溶于0.2 mL 0.1 mol/L 的氫氧化鉀溶液中振蕩均勻，加入1.6 mL 0.1 mol/L pH 值為8.3 的碳酸鹽緩沖液（Na2CO3/NaHCO3），滴入1 mL 含有0.4%乳清蛋白水解物的溶液，避光反應(yīng)4 h 后進(jìn)行異硫氰酸熒光素標(biāo)記。將標(biāo)記好的溶液加入MRS 培養(yǎng)基中，隨之接種1%嗜酸乳桿菌，于37 ℃培養(yǎng)24 h 后，吸取2.5 μL 菌液于潔凈載玻片，用激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）（TCSSP8，Leica company，德國(guó)）進(jìn)行觀(guān)察。最大發(fā)射波長(zhǎng)：520～530 nm，最大吸收波長(zhǎng)：490～495 nm。

1.5 WPH 對(duì)嗜酸乳桿菌生物被膜產(chǎn)生的影響

1.5.1 生物被膜定量測(cè)定 嗜酸乳桿菌菌株按照1%比例接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)24 h（37 ℃，160 r/min）。按1∶100 比例稀釋后取100 μL 菌液加入96 孔板中，分別加入0.2%，0.4%，0.8%，1.6%的WPH，以1.6%的菊粉作為對(duì)照，MRS 肉湯做為空白對(duì)照。將96 孔板放置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置48 h。培養(yǎng)后，用無(wú)菌PBS 緩沖液沖洗3 遍以除去未黏附的細(xì)菌。XTT 用PBS 配置為0.5 mg/mL 儲(chǔ)備液，并用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，-70 ℃貯藏。維生素K3 用丙酮溶解（10 mmol/L）。將維生素K3 加入XTT 中達(dá)到1 μmol/L 濃度。將200 μL 的XTT-維生素K3 溶液加入96 孔板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光放置2 h 后，在490 nm 下用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)試。每個(gè)樣品重復(fù)4 次取平均值。

1.5.2 生物被膜顯微鏡觀(guān)察 嗜酸乳桿菌菌株按照1%的比例接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)24 h （37 ℃，160 r/min）。按1∶100 比例稀釋后取200 μL 菌液加入無(wú)菌平板中，分別加入1.6%的WPH、MRS 肉湯（對(duì)照）。向平板底部放入無(wú)菌蓋玻片后于37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，用超純水潤(rùn)洗蓋玻片3 次，0.4%結(jié)晶紫染色20 min，在油鏡下觀(guān)察細(xì)菌生物被膜情況。

1.6 WPH 對(duì)嗜酸乳桿菌EPS 的影響

嗜酸乳桿菌菌株按照1%的比例接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)24 h（37 ℃，160 r/min）。按1∶100 比例稀釋后取200 μL 菌液加入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，分別加入1.6%的乳清蛋白水解物、MRS 肉湯（對(duì)照）。每個(gè)平板底部放有1 片打磨過(guò)的鋅片（0.5 mm×0.5 mm×0.3 mm），其作用是使生物被膜黏附于鋅片上。將平板放置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后，將鋅片取出，用無(wú)菌水緩緩沖洗3 遍以除去未黏附的細(xì)菌。干燥30 min 后用拉曼光譜儀（LabRAM HR Evolution Raman spec trometer，HORIBA Scientific company，法國(guó)）對(duì)EPS的化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)試。激光光源波長(zhǎng)：532 nm；激光光源功率：25 mW；50 倍物鏡；5 次曝光次數(shù)；檢測(cè)光譜范圍：100～3 500 cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 WPH 對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響

通過(guò)測(cè)定嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)來(lái)考察WPH 對(duì)其生長(zhǎng)的影響。圖1為添加WPH 的嗜酸乳桿菌數(shù)量隨時(shí)間的變化情況。從圖中可以看出，嗜酸乳桿菌在MRS 培養(yǎng)基中增殖迅速，細(xì)菌快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，遲滯期較短，菌體大量生長(zhǎng)繁殖；而后細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)趨于平穩(wěn)，細(xì)菌的生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期；后期由于乳酸等代謝產(chǎn)物不斷累積，降低了發(fā)酵液的pH 值，細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境逐漸惡劣，菌體代謝逐漸緩慢，活菌數(shù)開(kāi)始下降，菌體逐漸衰老死亡，進(jìn)入衰亡期。添加菊粉后細(xì)菌增加較空白組顯著，但到后期細(xì)菌生長(zhǎng)逐漸緩慢。而添加WPH 的培養(yǎng)基增菌效果較菊粉更好，試驗(yàn)組活菌數(shù)都比空白組有明顯提高，且濃度增大增菌效果更加明顯。不僅將細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期提前，穩(wěn)定期也延長(zhǎng)，穩(wěn)定期期間添加0.2%，0.4%，0.8%，1.6%的培養(yǎng)基中活菌數(shù)分別達(dá)到了1.07×109，2.40×109，1.02×1010，1.48×1010CFU/mL。由此表明乳清蛋白水解物可以增強(qiáng)細(xì)菌的代謝速率，促進(jìn)有益菌的增殖。用微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型探究嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的變化規(guī)律，將細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)分別用修正的Gompertz 方程以及修正的Logistic 方程進(jìn)行非線(xiàn)性擬合發(fā)現(xiàn)，修正的Gompertz 方程和修正的Logistic 方程可以很好地?cái)M合嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，大部分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)都在擬合曲線(xiàn)上或離擬合曲線(xiàn)較近，這兩個(gè)方程能較好地反映嗜酸乳桿菌隨時(shí)間的變化情況及生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。不同微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程擬合效果也可由決定系數(shù)（R2）來(lái)判定。R2值越大，說(shuō)明微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)與微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程擬合程度越好。從表1中可以看出，用不同微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程擬合不同培養(yǎng)基中嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)后得到的決定系數(shù)值各不相同。其中，用修正的Gompertz 方程可以得出微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)的最大比生長(zhǎng)速率和延滯期。擬合后發(fā)現(xiàn)所有的R2>0.98988，用修正的Logistic 方程擬合后所有的R2>0.98924，也表明兩個(gè)方程能很好地描述微生物的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。生長(zhǎng)速率是研究對(duì)數(shù)生長(zhǎng)情況下微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律的重要參數(shù)，不僅可以估算某一時(shí)刻的菌體濃度，還可以作為判斷微生物生長(zhǎng)情況和環(huán)境關(guān)系的一個(gè)指標(biāo)。微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程非線(xiàn)性擬合相關(guān)參數(shù)如表1所示。從表中可以看出，乳清蛋白水解物和菊粉的添加對(duì)細(xì)菌的最大比生長(zhǎng)速率和延滯期影響顯著。添加乳清蛋白水解物和菊粉后，細(xì)菌的最大比生長(zhǎng)速率（μmax）比空白組增加；延滯期（λ）縮短。WPH對(duì)μmax和λ 的作用比菊粉更明顯。以上結(jié)果可以得出，乳清蛋白水解物能促進(jìn)細(xì)菌增殖，使其提前進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，乳清蛋白水解物可以作為益生菌的促生長(zhǎng)因子使用，且是一種具有巨大應(yīng)用價(jià)值的益生元。

圖1 嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)用微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程擬合結(jié)果Fig.1 Growth curve of L.acidophilus JC1 fitted with microbial growth kinetic equation

表1 嗜酸乳桿菌不同微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程非線(xiàn)性擬合相關(guān)參數(shù)Table 1 Nonlinear fitting parameters of different microbial growth kinetics equations of L.acidophilus JC1

2.2 嗜酸乳桿菌對(duì)WPH 的利用情況

向嗜酸乳桿菌的液體培養(yǎng)基中加入經(jīng)異硫氰酸熒光素染色的乳清蛋白水解物，異硫氰酸熒光素中的異硫氰酸基團(tuán)可以與WPH 中的氨基酸發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而能夠在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察到嗜酸乳桿菌對(duì)乳清蛋白水解物的利用情況。CLSM 發(fā)現(xiàn)絕大部分細(xì)菌內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有熒光標(biāo)記的乳清蛋白水解物。嗜酸乳桿菌可以很好地利用WPH，熒光標(biāo)記的WPH 大都分布在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中，表明乳清蛋白水解物中的大部分物質(zhì)可以自由透過(guò)細(xì)菌的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌中供細(xì)菌進(jìn)行各項(xiàng)代謝活動(dòng)并提供所需能量。

2.3 WPH 對(duì)嗜酸乳桿菌生物被膜的影響

從圖3乳清蛋白水解物對(duì)嗜酸乳桿菌生物被膜的定量測(cè)定可以看出，菊粉和乳清蛋白水解物對(duì)嗜酸乳桿菌生物被膜的產(chǎn)生均具有促進(jìn)作用，但是乳清蛋白水解物的促進(jìn)作用更加明顯，且濃度越高，促進(jìn)作用越顯著。當(dāng)乳清蛋白水解物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.2%，0.4%，0.8%，1.6%時(shí)，細(xì)菌生物被膜含量較空白組分別增加了22.15%，53.68%，69.79%和96.64%（P<0.01）。定量試驗(yàn)結(jié)果表明乳清蛋白水解物顯著促進(jìn)了嗜酸乳桿菌生物被膜的產(chǎn)生。

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察嗜酸乳桿菌對(duì)乳清蛋白水解物的利用情況Fig.2 Utilization of WPH to L.acidophilus JC1 by CLSM

圖3 定量測(cè)定乳清蛋白水解物對(duì)嗜酸乳桿菌生物被膜的影響Fig.3 The effect of WPH on the biofilm of L.acidophilus JC1 by quantitative determination

從圖4可以看出，光學(xué)顯微鏡下嗜酸乳桿菌的生物被膜經(jīng)結(jié)晶紫染色后，對(duì)照組的細(xì)菌分布較為分散，生物被膜含量較少，而添加乳清蛋白水解物后，細(xì)胞聚集成團(tuán)，形成大片的、致密的生物被膜，細(xì)菌包裹于生物被膜中，形成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，表明乳清蛋白水解物顯著刺激了嗜酸乳桿菌生物被膜的產(chǎn)生。這一結(jié)論與生物被膜定量試驗(yàn)相吻合。

圖4 顯微鏡觀(guān)測(cè)乳清蛋白水解物對(duì)嗜酸乳桿菌生物被膜的影響Fig.4 The effect of WPH on the biofilm of L.acidophilus JC1 by optical microscope

2.4 乳清蛋白水解物對(duì)嗜酸乳桿菌胞外聚合物的影響

通過(guò)拉曼光譜測(cè)試可以檢測(cè)乳清蛋白水解物的添加對(duì)嗜酸乳桿菌EPS 化學(xué)成分的影響。由圖5可以看出，添加乳清蛋白水解物后，細(xì)菌所產(chǎn)生的EPS 拉曼光譜峰峰強(qiáng)度增加。

通過(guò)比對(duì)拉曼光譜特征峰[13]對(duì)應(yīng)物質(zhì)可以看出（圖5a），嗜酸乳桿菌所產(chǎn)胞外聚合物的主要成分為蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)等物質(zhì)。未添加乳清蛋白水解物時(shí)，其EPS 拉曼光譜圖顯示，在600 cm-1附近的拉曼條帶中對(duì)應(yīng)的物質(zhì)主要是變形芳環(huán)拉伸環(huán)孢菌素、苯丙氨酸結(jié)構(gòu)，這種物質(zhì)在EPS中含量較高。在1 030～1 130 cm-1是碳水化合物，其變形振動(dòng)主要由-C-C-、C-O 以及C-O-H 引起。在1 200～1 290 cm-1主要是Amide III；在1 343 cm-1左右的拉曼光譜條帶對(duì)應(yīng)的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)（amide III）；在1 855～2 920 cm-1表明，嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的EPS 中含有CH2基團(tuán)、CH3基團(tuán)以及孢粉素和脂質(zhì)。添加乳清蛋白水解物后，拉曼光譜（圖5b）顯示，600 cm-1處對(duì)應(yīng)的碳水化合物明顯增加；1 343 cm-1處對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)含量也顯著增加；2 920～1 855 cm-1的拉曼光譜所對(duì)應(yīng)的Amide I、不飽和脂質(zhì)、孢粉素，脂質(zhì)等物質(zhì)也顯著增加。以上結(jié)果表明乳清蛋白水解物的添加顯著刺激了嗜酸乳桿菌產(chǎn)生EPS 的能力。

圖5 拉曼光譜檢測(cè)乳清蛋白水解物對(duì)嗜酸乳桿菌EPS 的影響Fig.5 Effect of WPH on EPS of L.acidophilus JC1 by Raman spectroscopy

3 討論

嗜酸乳桿菌是一種重要的益生菌，在發(fā)酵過(guò)程中，它能產(chǎn)生大量的乳酸、醋酸及胞外多糖等物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)調(diào)整腸道菌群平衡、促進(jìn)腸道消化、平衡身體內(nèi)的酸堿度以及控制體內(nèi)毒素等至關(guān)重要。但是益生菌在加工、銷(xiāo)售過(guò)程中往往會(huì)受到來(lái)自外界不利條件的影響，且以口服形式進(jìn)入人體腸道內(nèi)的益生菌必須通過(guò)胃環(huán)境，致使其活性和存活率大幅度下降[14-16]。因此益生菌的增殖培養(yǎng)變得越來(lái)越重要。據(jù)研究報(bào)道，添加外源有益菌增菌的物質(zhì)，可以刺激益生菌生長(zhǎng)與活性。Dave等[17]研究發(fā)現(xiàn)蛋白水解物能夠加速發(fā)酵過(guò)程中益生菌的生長(zhǎng)繁殖。Martone[18]從鱈魚(yú)魚(yú)片廢料中得到一種高溶性的魚(yú)蛋白水解物。他們發(fā)現(xiàn)水解蛋白能促進(jìn)鹽生細(xì)菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的生長(zhǎng)，可作為微生物培養(yǎng)的替代底物。Mccomas 等[19]也發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白水解物可以促進(jìn)益生菌（長(zhǎng)雙歧桿菌S9、嗜酸乳桿菌O16 和嗜酸乳桿菌L-1） 在不同的酸奶培養(yǎng)物組合中的生長(zhǎng)。乳清蛋白水解物可作為促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)的益生元。Castro 等[20]報(bào)道了大豆分離蛋白、牛乳清蛋白和蛋清蛋白水解液對(duì)嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、德氏乳桿菌 （Lactobacillus delbrueckii）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和乳酸雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）的生長(zhǎng)有積極的促進(jìn)作用。因此探究乳清蛋白水解物對(duì)益生菌的生長(zhǎng)刺激作用，探究其作為新型益生元使益生菌發(fā)揮長(zhǎng)效作用切實(shí)可行，且將會(huì)有巨大的應(yīng)用潛力。

在嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)基中添加乳清蛋白水解物后，細(xì)菌的增殖速度加快，對(duì)數(shù)期提前，穩(wěn)定期延長(zhǎng)，表明乳清蛋白水解物增強(qiáng)了細(xì)菌的代謝速率，這可能是由于乳清蛋白水解物增加了細(xì)菌對(duì)逆環(huán)境的耐受性的緣故。胞外聚合物是細(xì)菌在一定環(huán)境下分泌的一些高分子聚合物。細(xì)菌包裹于這些聚合物中形成復(fù)雜的生物被膜結(jié)構(gòu)，通過(guò)這些結(jié)構(gòu)可以使細(xì)菌抵御殺菌劑和其它有毒物質(zhì)的侵害[21-22]。而生物被膜和EPS 的產(chǎn)生均受到細(xì)菌群體感應(yīng)（Quorum Sensing,QS）系統(tǒng)的調(diào)控[23-25]。QS 是一種細(xì)菌之間進(jìn)行通訊與交流的機(jī)制，也是細(xì)菌根據(jù)自身群體密度來(lái)調(diào)整其生理和生化特性的過(guò)程。細(xì)菌能夠產(chǎn)生、釋放和識(shí)別被稱(chēng)為自誘導(dǎo)物（Autoinducers,AIs）的胞外信號(hào)分子，AIs 會(huì)隨著細(xì)菌密度的增加而累積，一旦達(dá)到種群密度的閾值濃度，信號(hào)分子就會(huì)被多種受體感應(yīng)，進(jìn)而激活或抑制特定靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)菌的多種群體性行為的產(chǎn)生，如生物被膜的產(chǎn)生、細(xì)菌胞外酶的分泌、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，抗生素合成等[26-28]。已有研究證明，生物被膜狀態(tài)下的益生菌比浮游狀態(tài)下的益生菌具有更顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[29]。Cheow 等[30]發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)益生菌微制劑相比，高密度生物被膜狀態(tài)下益生菌制備的微制劑具有更好的抗冷凍干燥能力、耐熱性和耐酸性。Chew 等[31]發(fā)現(xiàn)益生菌鼠李糖乳桿菌GR-1 和羅伊氏乳桿菌RC-14 可以抑制或干擾致病菌光滑念珠菌生物被膜的形成。Vuotto 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以用來(lái)對(duì)抗生物被膜相關(guān)的感染性疾病。因此，添加乳清蛋白水解物后，嗜酸乳桿菌的生物被膜加厚，EPS 分泌增加，乳清蛋白水解物對(duì)益生菌的益生效應(yīng)很可能是因?yàn)槠浯龠M(jìn)了由QS 系統(tǒng)調(diào)控的生物被膜和EPS 的產(chǎn)生，從而增加了細(xì)菌對(duì)不良環(huán)境的抵抗性所導(dǎo)致。益生菌生物被膜的形成受到多種因素的影響。據(jù)報(bào)道，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏及限制碳源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給會(huì)促進(jìn)鼠李糖乳桿菌GG 生物被膜的形成[33]。Slizova 等[34]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中吐溫-80 及糖的含量和種類(lèi)在羅伊氏乳桿菌生物被膜的形成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。因此，有目的的控制乳清蛋白水解物的添加量，可以靶向提高嗜酸乳桿菌生物被膜的形成，對(duì)提高益生菌的活性具有指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

本研究考察了乳清蛋白水解物對(duì)嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)、生物被膜產(chǎn)生以及EPS 的影響，發(fā)現(xiàn)乳清蛋白水解物不僅促進(jìn)了嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖，且增加了細(xì)菌生物被膜和EPS 的分泌量。乳清蛋白水解物對(duì)嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)的促進(jìn)作用很可能跟細(xì)菌的群體感應(yīng)效應(yīng)有關(guān)。乳清蛋白水解物具有作為益生元的潛力，可作為促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)的新型增殖因子，為改善相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量，提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供參考。