張 澤，鄧業(yè)成，陳 敢，王瑞昊，張燕玲，鄧志勇，藍(lán)福生，郭麗霞，張川梅，梁保明，駱海玉，張明良

(1.廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006； 2.桂林吉福思羅漢果有限公司，廣西 桂林 541006)

羅漢果[Siraitiagrosvenorii(Swingle) C．Jeffrey]是葫蘆科藤本植物[1]，被稱為“東方神果”。羅漢果味甘性涼，除了具有食用價(jià)值外，還有巨大的藥用價(jià)值。其在生長(zhǎng)過(guò)程中易受白絹病[2]和根腐病[3]等土傳病害的危害，造成羅漢果產(chǎn)量減少、質(zhì)量下降。目前，作物土傳病害的防治仍以傳統(tǒng)化學(xué)藥劑為主，成本高且易造成環(huán)境污染，同時(shí)也易致使農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，有違農(nóng)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的要求[4-6]。因此，尋找健康、對(duì)人類無(wú)害且有利于環(huán)境保護(hù)的土傳病害防治方法成為目前羅漢果種植產(chǎn)業(yè)面臨的重要問(wèn)題。

國(guó)內(nèi)外利用拮抗微生物進(jìn)行農(nóng)作物生物防治的研究已有諸多報(bào)道。劉雨等[7]研究了9種化學(xué)殺菌劑、3種植物源殺菌劑和5種微生物菌劑對(duì)白絹病菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)微生物菌劑對(duì)白絹病菌的抑制效果較為明顯。杜用璽等[8]總結(jié)了黃連根腐病的發(fā)生規(guī)律以及防治措施，認(rèn)為利用微生物防治可有效地降低化學(xué)防治對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞，更符合可持續(xù)發(fā)展的要求。拮抗微生物可通過(guò)改善土壤理化性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)狀況促進(jìn)植物生長(zhǎng)，進(jìn)而提高作物抗病能力[9-12]，也可通過(guò)改變與病原菌的競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位點(diǎn)、激活植物防御體系、調(diào)節(jié)根系分泌物等方面[13-14]，達(dá)到有效控制病害的目的。

目前，利用拮抗微生物防治羅漢果土傳病害方面的研究報(bào)道較少，僅見(jiàn)馮世鑫等[15]利用芽孢桿菌及其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)羅漢果白絹病菌開(kāi)展拮抗活性研究及田間試驗(yàn)。鑒于此，從發(fā)病羅漢果果園健康植株根際土壤中分離純化對(duì)羅漢果土傳病菌有抑制作用的拮抗真菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，研究其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)根腐病菌及白絹病菌的抗菌活性，旨在解決該類病害危害嚴(yán)重、防治困難、化學(xué)防治造成農(nóng)藥殘留等問(wèn)題，為羅漢果產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土傳病原菌:白絹病菌(Sclerotiumrolfsii，編號(hào)為BJB)和根腐病菌(Fusariumsolani，編號(hào)為GFB)，均由廣西師范大學(xué)珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤中拮抗真菌的分離與純化 參照袁佐清[16]、LUO等[17]的方法，對(duì)羅漢果根際土壤中拮抗真菌進(jìn)行分離純化。首先稱取10 g土壤樣品，裝入已滅菌的三角瓶中，加入100 mL無(wú)菌水，用恒溫?fù)u床充分振蕩20 min。待振蕩完畢，將制備好的土壤懸浮液在超凈工作臺(tái)上經(jīng)0.5 μm濾膜過(guò)濾后，用移液槍吸取1 mL到裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，充分振蕩后即為質(zhì)量濃度10 mg/mL土壤懸浮液，從中吸取1 mL到另一支裝有9 mL無(wú)菌水試管中，以此類推，制備出質(zhì)量濃度為1、0.1、0.01 mg/mL的土壤懸浮液。

在超凈工作臺(tái)中使用移液槍分別吸取各質(zhì)量濃度的土壤懸浮液1 mL，采用涂布平板法接種在馬丁氏培養(yǎng)基上，每個(gè)質(zhì)量濃度3皿重復(fù)，27 ℃恒溫倒置培養(yǎng)72 h。將不同形態(tài)的菌落單獨(dú)轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，27 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，不斷重復(fù)此操作，直至長(zhǎng)出單一菌落形態(tài)。

1.2.2 拮抗真菌對(duì)羅漢果病原真菌的拮抗活性測(cè)定 采用平板對(duì)峙法。將已分離純化的菌株和根腐病菌株及白絹病菌株在恒溫28 ℃條件下培養(yǎng)72 h后，分別在其菌落邊緣打0.4 cm的菌餅，將病原菌和拮抗菌的菌餅接種在以培養(yǎng)皿中心點(diǎn)為中心向兩端延伸1 cm的位置上，其菌餅間距為2 cm，對(duì)照組將單獨(dú)的病原菌接種在培養(yǎng)皿中心，28 ℃條件下培養(yǎng)72 h后，采用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，取平均值，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)÷(對(duì)照菌落直徑-0.4)×100%。

1.2.3 拮抗菌的鑒定 將已分離純化的拮抗真菌菌株在PDA培養(yǎng)基中27 ℃恒溫倒置培養(yǎng)72 h，觀察其菌落形態(tài)(包括其菌落大小、形態(tài)、顏色等)，并結(jié)合光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。然后，委托北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進(jìn)行18S rDNA測(cè)序分析，將獲得的測(cè)序結(jié)果在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì),并采用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多序列同源性分析,最終利用其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)及粗提物制備 發(fā)酵培養(yǎng)采用液體PDB發(fā)酵和固體大米發(fā)酵2種方式[18]。液體發(fā)酵選擇的培養(yǎng)基為PDB液體培養(yǎng)基，將已經(jīng)活化好的拮抗菌在無(wú)菌操作臺(tái)中用直徑為0.4 cm的打孔器在菌落邊緣打孔，取4塊菌餅接種至含有PDB培養(yǎng)基(400 mL)的錐形瓶(1 000 mL)中,放置恒溫箱中(27 ℃)靜置培養(yǎng)45 d。發(fā)酵液使用抽濾瓶重復(fù)抽濾2次即得到純凈發(fā)酵液和濾渣，將純凈發(fā)酵液使用等體積的乙酸乙酯萃取，萃取3次后得到乙酸乙酯萃取物和萃余物，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分別蒸干溶劑，即得到乙酸乙酯萃取物和萃余物。將其濾渣放入60 ℃烘箱中烘干水分，粉碎后使用甲醇浸泡(m濾渣∶V甲醇=1∶4)3 d，提取3次，合并濾液進(jìn)行濃縮蒸干，即得到甲醇提取物。

固體大米發(fā)酵即在無(wú)菌操作臺(tái)中用直徑0.4 cm的打孔器在病原菌菌落邊緣處打孔，取3塊菌餅接種至含有PDB培養(yǎng)基(150 mL)的錐形瓶(250 mL)中,置于恒溫?fù)u床上(27±1) ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后即可得到發(fā)酵種子液。取5 mL種子液接種于事先準(zhǔn)備好的大米培養(yǎng)基(大米∶水=1∶1)中,放置培養(yǎng)箱中27 ℃恒溫培養(yǎng)60 d。將發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行干燥、粉碎處理后,用適量的乙酸乙酯分別浸泡提取3次,將提取濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干,即為發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.5 拮抗菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)羅漢果病原真菌的抑菌活性測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[19]測(cè)定不同發(fā)酵方式不同有機(jī)溶劑萃取得到的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)根腐病菌及白絹病菌的抑菌活性。具體操作步驟：將粗提物樣品用丙酮溶解配成藥液，共設(shè)置10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 mg/mL 5個(gè)質(zhì)量濃度梯度，將配制好的藥液(對(duì)照用等量丙酮代替)與PDA培養(yǎng)基[(60±5)℃]按1∶9混合均勻后倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿待其冷卻，在每皿中央放置一塊直徑為0.4 cm的病原真菌菌餅，菌餅長(zhǎng)滿菌絲面朝下緊貼在培養(yǎng)基表面，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3皿。置于培養(yǎng)箱中27 ℃倒置培養(yǎng)72 h，采用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，取平均值，計(jì)算抑菌率。抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。根據(jù)抑菌率測(cè)定其對(duì)羅漢果根腐病菌和白絹病菌的毒力大小，用最小二乘法求出毒力回歸方程及EC50等。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 25株土壤拮抗真菌對(duì)2種羅漢果病原真菌的拮抗活性

通過(guò)平板稀釋涂布法從土樣中分離出25株真菌。由表1可見(jiàn)，采用平板對(duì)峙法篩選出對(duì)羅漢果根腐病菌抑菌活性較好(抑菌率為42.01%～63.56%)的拮抗真菌4株，分別為T(mén)YM-3-1、TYM-3-3、TYM-3-8和TYM-4-4；對(duì)羅漢果白絹病菌抑菌活性較好(抑菌率為59.81%～74.17%)的拮抗真菌3株，分別為T(mén)YM-3-1、TYM-3-3和TYM-3-8(表1)。

表1 25株土壤真菌對(duì)羅漢果根腐病菌和白絹病菌的抑制作用

2.2 土壤拮抗真菌的鑒定

4株抑菌活性較顯著的拮抗真菌的菌落形態(tài)見(jiàn)圖1。TYM-3-1菌落呈同心環(huán)狀，并產(chǎn)生稠密的分生孢子，菌落外邊緣為白色，內(nèi)側(cè)2～3個(gè)同心圓呈暗綠色，菌落背面呈白色，生長(zhǎng)速度快。TYM-3-3在PDA平板上27 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后，菌落表面呈黑綠色氈狀，邊緣呈白色，表面疏松有干粉，背面呈暗褐色，菌落生長(zhǎng)迅速，大小為1～2 cm小菌落，表面疏松。TYM-3-8在PDA平板上27 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后菌落中間呈灰綠色，邊緣呈白色，菌落形態(tài)呈氈狀，表面為絮狀，有放射狀褶裂。TYM-4-4菌落生長(zhǎng)較慢，質(zhì)地絮狀，菌絲體顏色由白色、淡黃色、粉紅色至淡紅色；滲出液成微滴，黃白色，背面由無(wú)色轉(zhuǎn)為黃色最終為橙紅色。將TYM-3-1、TYM-3-3、TYM-3-8和TYM-4-4的測(cè)序結(jié)果在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，并采用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多序列同源性分析，最終構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)特征，4株拮抗真菌鑒定結(jié)果為，TYM-3-1為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)，TYM-3-3為棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)，TYM-3-8為籃狀菌(Talaromycesangelicus)，TYM-4-4為微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)。

2.3 4株拮抗真菌液體發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)羅漢果根腐病菌和白絹病菌的抑菌活性

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了液體發(fā)酵拮抗真菌得到的乙酸乙酯萃取物、萃余物及甲醇浸泡菌絲體得到的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)根腐病菌和白絹病菌的抗菌活性。由表2可知，不同拮抗真菌的不同有機(jī)溶劑萃取物對(duì)根腐病菌及白絹病菌表現(xiàn)出不同的抗菌活性。TYM-3-1、TYM-3-3、TYM-3-8的乙酸乙酯萃取物對(duì)根腐病菌均表現(xiàn)出最高的抗菌活性，EC50值分別為1.290 1、2.637 0、3.646 9 mg/mL，其中TYM-3-1乙酸乙酯萃取物對(duì)根腐病菌具有最高的毒力；TYM-3-3、TYM-3-8、TYM-4-4的乙酸乙酯萃取物對(duì)白絹病菌均表現(xiàn)出較好的抗菌活性，EC50值分別為1.740 4、3.925 1、0.636 2 mg/mL，其中TYM-4-4乙酸乙酯層萃取物對(duì)白絹病菌具有最高的毒力。以上表明，TYM-3-1對(duì)根腐病菌具有較強(qiáng)的抑制作用，TYM-4-4對(duì)白絹病菌具有較強(qiáng)的抑制作用。此外，由表4還可以看出，乙酸乙酯萃取物對(duì)2種病原菌的抑制活性優(yōu)于萃余物和菌絲體甲醇提取物，即4株拮抗真菌拮抗根腐病菌及白絹病菌的活性成分主要集中在乙酸乙酯層。

表2 4株拮抗真菌液體發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)根腐病菌及白絹病菌菌絲的毒力

2.4 4株拮抗真菌大米固體發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)羅漢果根腐病菌和白絹病菌的抑菌活性

為進(jìn)一步探究4株土壤拮抗真菌對(duì)羅漢果根腐病菌和白絹病菌的抑制活性，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定4株真菌大米發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對(duì)根腐病菌及白絹病菌的抑制活性，結(jié)果見(jiàn)表3。TYM-3-1對(duì)根腐病菌、白絹病菌均具有較強(qiáng)的毒力，EC50值分別為2.339 4、1.941 8 mg/mL，均小于2.5 mg/mL。

表3 4株拮抗真菌大米固體發(fā)酵粗提物對(duì)根腐病及白絹病菌菌絲的毒力

3 結(jié)論與討論

本研究從羅漢果根際土壤分離、篩選、鑒定拮抗真菌，并探究了其對(duì)羅漢果土傳根腐病菌和白絹病菌的拮抗活性。結(jié)果表明，從羅漢果根際土壤中篩選出4株對(duì)羅漢果根腐病菌抑菌活性較好(抑菌率為42.01%～63.56%)的拮抗真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，分別為棘孢木霉、棘孢曲霉、籃狀菌和微紫青霉。目前，棘孢木霉制劑在防治農(nóng)作物土傳病害方面效果顯著[20]；微紫青霉生物活性的研究已有相關(guān)報(bào)道[21]，但其對(duì)羅漢果土傳病害的防治效果尚無(wú)報(bào)道；關(guān)于棘孢曲霉和籃狀菌對(duì)羅漢果土傳病害的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

對(duì)拮抗真菌液體發(fā)酵產(chǎn)物粗提物的抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，該4種真菌粗提物對(duì)根腐病菌和白絹病菌均具有不同程度的抑制作用，且至少有1種萃取物具有良好的抗菌活性。其中，TYM-3-1乙酸乙酯萃取物對(duì)根腐病菌具有較好的毒力，其EC50值為1.290 1 mg/mL，TYM-4-4乙酸乙酯萃取物對(duì)白絹病菌具有較好的毒力，其EC50值為0.636 2 mg/mL?？梢?jiàn)，棘孢木霉對(duì)根腐病菌表現(xiàn)出明顯的抗菌活性，微紫青霉對(duì)白絹病菌具有明顯的抑菌活性，其活性成分主要集中在乙酸乙酯層。此外，拮抗真菌大米固體發(fā)酵得到的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)2種病原菌的毒力測(cè)定結(jié)果表明，棘孢木霉菌對(duì)根腐病菌、白絹病菌均表現(xiàn)出明顯的抗菌活性，其EC50值分別為2.339 4、1.941 8 mg/mL。對(duì)比2種發(fā)酵方式得到的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性，液體發(fā)酵得到的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)2種病原菌的抗菌活性較強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，健康羅漢果根際土壤中具有豐富的真菌資源，且發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質(zhì)表現(xiàn)出明顯抗根腐病菌及白絹病菌活性。

綜上，從羅漢果根際土壤中分離得到棘孢木霉菌、棘孢曲霉菌、籃狀菌和微紫青霉菌，對(duì)羅漢果根腐病菌及白絹病菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。其中，棘孢木霉菌對(duì)根腐病菌表現(xiàn)出明顯的抗菌活性，微紫青霉菌對(duì)白絹病菌具有明顯的抑菌活性。本研究為研制有效的生物源菌劑，解決目前羅漢果土傳病害危害嚴(yán)重、防治困難以及因化學(xué)防治造成的羅漢果產(chǎn)品農(nóng)藥殘留問(wèn)題提供了重要資源。