金前躍，郭永剛，李俊朋，秦保亮，王寅彪，郭振華，王 麗，邢廣旭，鄧瑞廣，張改平,8

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中英禽病國(guó)際研究中心，河南 鄭州 450002； 3.江蘇高校動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046； 5.平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究中心，河南 平頂山 467001；6.新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 新鄉(xiāng) 453003； 7.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；8.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

鵝星狀病毒(Goose astrovirus，GAstV)屬于星狀病毒科(Astroviridae，AstV)、禽星狀病毒屬(Avastrovirus，AAstV)，是一種無(wú)囊膜、單鏈正義RNA病毒[1]。GAstV基因組全長(zhǎng)6.1～7.9 kb，包含5′非翻譯區(qū)(UTR)、3′UTR及多聚腺苷酸(PolyA)尾及3個(gè)開放性閱讀框(ORF)，分別為編碼蛋白酶的ORF1a、編碼RNA聚合酶的ORF1b、編碼衣殼蛋白(Capsid)的ORF2[2-4]。禽星狀病毒主要分為3個(gè)群，分別為禽星狀病毒1群(AAstV-1)、禽星狀病毒2群(AAstV-2)和禽星狀病毒3群(AAstV-3)[5]。GAstV屬于禽星狀病毒1群(AAstV-1)，是一種新發(fā)的星狀病毒。

GAstV主要感染5～20日齡的雛鵝，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重痛風(fēng)癥狀。剖檢病死雛鵝，可見內(nèi)臟器官表面有大量尿酸鹽沉積，部分死亡雛鵝關(guān)節(jié)腔內(nèi)有白色尿酸鹽沉積，死亡率高達(dá)20%～70%[6-10]。

2017年以來(lái)，雛鵝痛風(fēng)病例在山東、江蘇、安徽、河南、遼寧、廣東等主要養(yǎng)鵝地區(qū)不斷出現(xiàn)，且呈上升趨勢(shì)，對(duì)國(guó)內(nèi)養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大影響。國(guó)內(nèi)多家科研單位相繼分離到GAstV，ZHANG等[11]從華南地區(qū)分離到了GD株，YANG等[12]和ZHANG等[13]分別從華北地區(qū)分離到了AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01株，徐蓉等[14]從華東地區(qū)分離到了JSHA株。河南省多地也出現(xiàn)了雛鵝痛風(fēng)疫情，病死鵝表現(xiàn)出典型的內(nèi)臟痛風(fēng)癥狀，給河南省養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)造成了重大損失。

為明確GAstV河南流行株的基因組特征，從河南省新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣某鵝場(chǎng)采集了患有痛風(fēng)的病鵝樣品，通過(guò)盲傳和PCR檢測(cè)分離了GAstV，并對(duì)分離毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序和遺傳特征分析，為有效防控雛鵝痛風(fēng)疫情提供技術(shù)支持,并為GAstV在河南省的流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DME/F12培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶購(gòu)自Solarbio公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；Premix ExTaqDNA聚合酶、病毒基因組提取試劑盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix)購(gòu)自Takara公司。

1.2 病料和細(xì)胞

患有痛風(fēng)的雛鵝來(lái)源于河南省新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣某鵝場(chǎng)。解剖后，收集肝臟、腎臟等組織，凍存于-40 ℃冰箱。雞肝癌細(xì)胞系(LMH)由本實(shí)驗(yàn)室保存，利用含10%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)基于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 病料的處理

無(wú)菌條件下取適量病料，以1∶3的質(zhì)量體積比加入含青鏈霉素的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底研磨。將組織研磨液收集于無(wú)菌Eppendorf管中，在-80 ℃和室溫間反復(fù)凍融3次，10 000 r/mim離心15 min，使用0.22 μm的濾器過(guò)濾上清液并凍存于-80 ℃冰箱。

1.4 病毒的分離

待細(xì)胞瓶中的LMH細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基并用無(wú)菌PBS清洗3次。使用無(wú)血清DME/F12(含1 mg/L胰酶)培養(yǎng)基將上述處理后的病料研磨液稀釋50倍后接種于細(xì)胞上，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1.5 h。然后棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DME/F12(含1 mg/L胰酶)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。之后通過(guò)-80 ℃與室溫間反復(fù)凍融，2 000 r/min離心15 min，收集病毒液。無(wú)菌過(guò)濾后，再次接種于LMH細(xì)胞盲傳3代，然后繼續(xù)傳至第6代，獲得穩(wěn)定毒株。

1.5 病毒的鑒定

1.5.1 PCR檢測(cè) 根據(jù)AstV/SDPY/Goose/1116/17毒株(GenBank登錄號(hào)：MH052598.1)的RNA聚合酶基因ORF1b序列設(shè)計(jì)引物。PCR上游引物序列為5′-ACCCCTGGTTATCCAAAATTTAAGT-3′，下游引物序列為5′-CCGCCAGAAGAGAGGCTTGGGCAAC-3′，預(yù)期片段大小為420 bp。

按照病毒核酸提取試劑盒說(shuō)明書提取病毒總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取病毒cDNA作為PCR模板。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃停止反應(yīng)。GAstV ORF1b陽(yáng)性質(zhì)粒與PBS分別作為陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.5.2 全基因組測(cè)序 按照病毒基因組提取試劑盒說(shuō)明，提取GAstV的全基因組，反轉(zhuǎn)錄后交由杭州聯(lián)川生物進(jìn)行全基因組二代測(cè)序。

1.6 遺傳特征分析

根據(jù)分離毒株的全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行遺傳特征分析，主要包括同源性分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析、ORF2編碼蛋白氨基酸序列比對(duì)。本研究所用毒株序列信息見表1。

表1 研究所用毒株序列信息

續(xù)表1 研究所用毒株序列信息

1.6.1 同源性分析 利用DNAStar軟件MegAlign中的Clustal W Method模塊，將分離株的全基因組、ORF1b、ORF2的核苷酸及氨基酸序列與GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行同源性分析。

1.6.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將分離株的全基因組序列與GenBank中禽星狀病毒相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)。利用Mega 6.06軟件中的Clustal W程序完成分離株全基因組序列比對(duì)，并采用鄰接法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，步長(zhǎng)值(Bootstrap value)設(shè)置為1 000。

1.6.3 ORF2編碼蛋白氨基酸序列比對(duì) 利用DNAStar軟件MegAlign功能的Clustal W Method模塊，將分離毒株與GenBank中GAstV流行毒株的ORF2編碼蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 患痛風(fēng)雛鵝臨床解剖特征

患病雛鵝解剖后可見明顯的全身性痛風(fēng)癥狀，腎臟腫大、發(fā)白，輸尿管、膽囊、關(guān)節(jié)腔內(nèi)都有尿酸鹽沉積，心臟、肝臟、腺胃、腸道也不同程度附著有白色尿酸鹽(圖1)。

2.2 分離毒株P(guān)CR鑒定結(jié)果

將處理過(guò)的病料研磨液接種LMH細(xì)胞(未見明顯的細(xì)胞病變)，收集1—6代病毒液，提取核酸并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)后，均擴(kuò)增得到了420 bp大小的條帶(圖2)，符合預(yù)期大小。表明成功分離了1株GAstV，命名為XX株。

M.DNA Marker；1—6.1—6代收集的病毒液；7.陽(yáng)性對(duì)照；8.陰性對(duì)照

2.3 分離毒株全基因組序列分析

本研究分離的GAstV XX株(GenBank登錄號(hào)：MN337323)的基因組全長(zhǎng)為7 252 bp，包含長(zhǎng)度為245 bp(1—245)的5′UTR和228 bp(7 025—7 252)的3′UTR，ORF包括ORF1a(246—3 350)、ORF1b(3 341—4 891)、ORF2(4 910—7 024)。ORF1a、ORF1b編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包含蛋白酶、RNA聚合酶等，ORF1a和ORF1b之間有10 bp的重疊序列；ORF2編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，主要包括衣殼蛋白及其表面的刺突蛋白(Spike)。

2.4 分離毒株遺傳特征分析

2.4.1 同源性分析 全基因組及各基因序列的同源性分析結(jié)果(表2)表明，GAstV XX株基因組與導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的代表性毒株GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01的核苷酸同源性分別為98.1%、98.7%、98.7%。GAstV XX株的ORF1b、ORF2基因與導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的代表性毒株GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01核苷酸同源性為98.6%～ 99.4%，氨基酸同源性為98.6%～ 99.8%?？梢?，GAstV XX株與當(dāng)前導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的流行毒株同源性較高。

表2 分離毒株與代表性毒株的同源性

2.4.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析 為進(jìn)一步確定GAstV XX株與其他毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了基于基因組的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，GAstV XX株與當(dāng)前導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01等毒株處于同一進(jìn)化分支，屬于禽星狀病毒1群。

圖3 GAstV的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4.3 ORF2編碼蛋白氨基酸序列比對(duì) GAstV XX株的ORF2編碼蛋白氨基酸序列與其他流行毒株同源性較高，但也存在一些氨基酸位點(diǎn)的突變(表3)。這些突變主要集中在224(T→A)、225(Q→R)、379(P→T)、424(M→I)、464(N→A)、594(S→N)等位點(diǎn)。

表3 ORF2編碼蛋白氨基酸序列比對(duì)

3 結(jié)論與討論

禽星狀病毒可感染鴨[15]、雞[16]、火雞[17]等多種禽類，臨床常表現(xiàn)為肝臟、腎臟及腸道病變，但GAstV感染報(bào)道較少。本次暴發(fā)的GAstV感染可引起雛鵝嚴(yán)重痛風(fēng)癥狀，在禽星狀病毒中尚屬首次發(fā)現(xiàn)，與營(yíng)養(yǎng)性痛風(fēng)不同[18]，其具有極強(qiáng)的傳染性，即使在低蛋白質(zhì)日糧情況下也可發(fā)生。本研究分離了1株GAstV，對(duì)病毒進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并對(duì)其遺傳特征進(jìn)行了分析。

前人研究發(fā)現(xiàn)，雞星狀病毒可引起LMH細(xì)胞病變[16]。本研究中，GAstV XX株能在LMH細(xì)胞上穩(wěn)定傳代，但病毒感染不引起細(xì)胞病變，具體原因有待進(jìn)一步研究。通過(guò)全基因組序列分析可知，GAstV XX株基因組全長(zhǎng)7 252 bp，主要編碼ORF1a、ORF1b、ORF2蛋白。GAstV XX毒株與當(dāng)前導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的流行毒株同源性較高，均在97%以上，與代表性毒株GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01的基因組核苷酸同源性分別為98.1%、98.7%、98.7%。

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，GAstV XX株與當(dāng)前導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的流行毒株處于同一進(jìn)化分支，屬于禽星狀病毒1群，與鴨、火雞、雞星狀病毒進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，存在較大差異。不同鵝源毒株ORF2編碼蛋白氨基酸序列分析表明，各流行毒株之間差異較小，僅存在部分氨基酸位點(diǎn)的突變。