豬A組輪狀病毒HN2019-01株的分離鑒定及VP6基因序列分析

黃正陽(yáng)，陳宇婧，黃 克，冷超糧,2,3，劉陽(yáng)坤,2,3，姚倫廣,2,3，李 娜,2,3

(1.南陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473061；2.河南省畜禽保健品工程技術(shù)研究中心，河南 南陽(yáng) 473061；3.河南省動(dòng)物疫病診斷與綜合防控工程技術(shù)研究中心，河南 南陽(yáng) 473061)

輪狀病毒(Rotavirus，RV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬成員，病毒顆粒呈球形，由3層病毒蛋白組成，直徑70 nm左右，無包膜，電鏡下觀察呈車輪狀，是導(dǎo)致嬰幼兒和多種幼齡動(dòng)物病毒性腹瀉的主要病原之一[1-2]，可以分為10個(gè)亞型(A—J)[3-4]。仔豬中存在A組輪狀病毒(Group A rotaviruses，RVA)、B組輪狀病毒(Group B rotaviruses，RVB)、C組輪狀病毒(Group C rotaviruses，RVC)、E組輪狀病毒(Group E rotaviruses，RVE)和H組輪狀病毒(Group H rotaviruses，RVH)等多個(gè)亞型感染[5]，其中RVA是引起斷奶前后仔豬腹瀉最常見的亞型[6]。RVA感染以患病仔豬腹瀉、厭食、嘔吐、脫水為特征[7-8]，常與其他細(xì)菌、病毒混合感染而使病情加重，導(dǎo)致仔豬生長(zhǎng)緩慢，患病豬群死亡率升高[9]。該病潛伏期短、傳染性強(qiáng)、流行范圍廣，在多個(gè)國(guó)家普遍存在，威脅著全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[10-11]。

RV基因組由11個(gè)不連續(xù)的雙鏈RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)組成，依次命名為基因1—11，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7)和5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5)[11]。RV結(jié)構(gòu)蛋白中，VP1、VP2和VP3是病毒的核心結(jié)構(gòu)蛋白，VP4、VP6和VP7則是形成病毒衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白。VP6位于病毒粒子的中層，含量豐富，約占病毒蛋白質(zhì)總量的51%，是病毒轉(zhuǎn)錄酶和復(fù)制酶的必需亞基[12]。VP6蛋白免疫原性強(qiáng)，能夠介導(dǎo)黏膜免疫，是最重要的群特異性抗原，決定了RV血清型的特異性[13]。同時(shí)，VP6蛋白序列保守，在不同哺乳動(dòng)物群體中的氨基酸相似性大于87%，是國(guó)內(nèi)外多種檢測(cè)方法的首選靶標(biāo)[14]。

由于RV基因組具有節(jié)段性，不同亞型毒株在感染同一宿主時(shí)，可能會(huì)造成基因片段交換而發(fā)生重配，導(dǎo)致新變異株的產(chǎn)生[15]。RV最新分類系統(tǒng)是基于其11個(gè)完整的基因組RNA片段(VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5)進(jìn)行分類，不同毒株根據(jù)序列被命名為Gx-Px-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx[16]。目前,RV已發(fā)現(xiàn)有36種G基因型、51種P基因型[17]和26種I基因型[18]。病毒感染存在一定的種間屏障，然而有研究發(fā)現(xiàn)，RV能夠進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，可能發(fā)生跨種傳播[18-19]。SATOSHI等[20]在患有嚴(yán)重腹瀉的嬰兒糞便中分離到人輪狀病毒KKL-117毒株，其11個(gè)基因片段與豬源基因均高度相似，證實(shí)了RV從豬到人的跨種傳播。

RV作為人畜共患的病原體，不僅危害養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，還威脅到社會(huì)的公共衛(wèi)生安全。因此，有必要對(duì)動(dòng)物源RV的特征及流行情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。鑒于此，在河南某豬場(chǎng)分離獲得豬源RV，并對(duì)分離毒株的VP6基因進(jìn)行了序列測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析，旨在為河南省豬RV的流行病學(xué)調(diào)查提供參考，為RV疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料及細(xì)胞 臨床病料樣品為河南省某豬場(chǎng)疑似RV感染病豬的糞便；MA-104細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 DNA聚合酶購(gòu)自New England Biolabs(NEB)公司；Trans DNA Marker Ⅰ、Trans2K Plus DNA Marker和pEASY-Blunt載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RNAiso Plus和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TAKARA公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；氨芐青霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離及鑒定 將病料用pH值7.4的PBS稀釋成20%懸液，4 ℃條件下3 000 r/min離心30 min，取上清，過濾除菌后加入青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/L)，同時(shí)加入與病料相同體積的胰酶(20 mg/L)，混勻后置于37 ℃處理2 h，然后接種MA-104細(xì)胞。37 ℃條件下培養(yǎng)72 h后，收獲細(xì)胞及培養(yǎng)液，凍融3次，過濾離心，再將上清接種生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MA-104細(xì)胞，盲傳5代，提取每一代細(xì)胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA。利用檢測(cè)引物(RV-F：5′-CCCCGGTATTGAATATACCACAGT-3′；RV-R：5′-TTTCTGTTGGCCACCCTTTAGT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(目的片段長(zhǎng)341 bp)，并以ddH2O為模板作陰性對(duì)照，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2VP6基因擴(kuò)增及鑒定 根據(jù)NCBI中所報(bào)道的RVVP6基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物VP6-F：5′-GGCTTTWAAACGAAGTCTTC-3′；VP6-R：5′-GGTCACATCCTCTCACT-3′。以1.2.1中得到的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增包含完整VP6基因的片段，并將其克隆至pEASY-Blunt載體，菌液PCR鑒定得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒，由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.3VP6基因及其編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用DNAStar v7.0軟件對(duì)VP6基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，將測(cè)序結(jié)果與NCBI中的參考毒株進(jìn)行核苷酸及氨基酸相似性分析，參考毒株序列信息見表1。利用MEGA 7.0軟件對(duì)VP6基因序列采用最大似然法(Maximum likelihood)構(gòu)建核苷酸系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并以Bootstrap值(1 000)來評(píng)估進(jìn)化樹的可靠性。利用軟件ProtParam分析VP6蛋白分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；利用軟件NetNGlyc 1.0和NetPhos 2.0分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)潛在N糖基化位點(diǎn)和潛在磷酸化位點(diǎn)；采用軟件SOPMA分析VP6蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；應(yīng)用在線軟件(https://swiss-model.expasy.org)及Pymol軟件分析VP6蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

表1 參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床樣品中RV的檢測(cè)

利用RV特異性檢測(cè)引物，對(duì)于疑似RV感染的病豬腹瀉樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，可見大小約341 bp的目的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符，說明該病豬腹瀉樣品中存在RV病毒核酸。

M：Trans DNA Marker Ⅰ；1：陰性對(duì)照；2：臨床樣品

2.2 RV分離毒株鑒定

為進(jìn)一步鑒定病料中的病原，將腹瀉樣品病料處理后接種MA-104細(xì)胞，盲傳5代，并提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR鑒定，所傳代次均可檢測(cè)到RV的特異性條帶(圖2)，但感染細(xì)胞未觀察到明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)(圖3)。將分離毒株命名為RVA/Pig-wt/HN2019-01。

M：Trans DNA Marker Ⅰ；1：陰性對(duì)照；2—6：培養(yǎng)1—5代RV的MA-104檢測(cè)

A：正常MA-104；B：感染RV分離毒株的MA-104

2.3 分離毒株VP6基因擴(kuò)增

從圖4可以看出，利用引物VP6-F/R，擴(kuò)增獲得1 356 bp的VP6基因全長(zhǎng)片段，與預(yù)期結(jié)果相符。

M：Trans2K Plus DNA Marker；1：陰性對(duì)照；2：VP6基因的擴(kuò)增片段

2.4 基于VP6基因的遺傳特征分析

測(cè)序結(jié)果表明，分離毒株RVA/Pig-wt/HN2019-01株VP6基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 194 bp，核苷酸序列與參考毒株序列的相似性為76.7%～97.9%(圖5)，其中與SWU-1C(豬源)序列相似性最高(97.9%)，與人源毒株相似性為81.6%～93.1%。分離株VP6蛋白由397個(gè)氨基酸組成，氨基酸序列與參考毒株序列的相似性為88.2%～99.7%(圖6)。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，RVA/Pig-wt/HN2019-01株VP6基因與豬源中國(guó)株SWU-1C處于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近，同屬I5亞型(圖7)。

圖5 VP6基因核苷酸序列相似性分析

圖6 VP6蛋白氨基酸序列相似性分析

圖7 基于RV分離毒株VP6基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.5 分離毒株VP6蛋白理化性質(zhì)及修飾位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及氨基酸組成分析結(jié)果顯示，分離毒株VP6蛋白的397個(gè)氨基酸中含有39個(gè)堿性氨基酸(R、K、H)、36個(gè)酸性氨基酸(D、E)、142個(gè)親水性氨基酸(G、Y、N、Q、S、T、C)、180個(gè)疏水性氨基酸(A、V、L、I、F、W、M、P)。VP6蛋白分子質(zhì)量為44 717.91 u，理論等電點(diǎn)pI =6.11。該蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞、酵母和埃希氏大腸桿菌中表達(dá)的半衰期分別為30 h、大于20 h和大于10 h，在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為43.00(高于閾值40)，屬于不穩(wěn)定蛋白。VP6蛋白存在4個(gè)N糖基化位點(diǎn)，分別位于26、58、167、345氨基酸處(圖8)，存在18個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)(包括9個(gè)絲氨酸、6個(gè)蘇氨酸和3個(gè)酪氨酸)。

圖8 RV分離毒株VP6蛋白N糖基化位點(diǎn)分析

2.6 分離毒株VP6蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，RVA/Pig-wt/HN2019-01毒株VP6蛋白含有α-螺旋(Hh)(藍(lán)色)、延伸鏈(Ee)(紅色)、無規(guī)卷曲(Cc)(黃色)和β-轉(zhuǎn)角(Tt)(綠色)等多種結(jié)構(gòu)(圖9)。其中，α-螺旋包含175個(gè)氨基酸，占44.08%；延伸鏈包含78個(gè)氨基酸，占19.65%；無規(guī)卷曲包含120個(gè)氨基酸，占30.23%；β-轉(zhuǎn)角包含24個(gè)氨基酸，占6.05%。前3種結(jié)構(gòu)貫穿于整個(gè)氨基酸鏈，β-轉(zhuǎn)角主要分布在第250個(gè)氨基酸之后。

圖9 RV分離毒株VP6蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.7 分離毒株VP6蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

從圖10可以看出，分離毒株的VP6蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與已發(fā)表的牛輪狀病毒RF毒株的VP6蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(PDB：1qhd)相似度較高。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疊加聯(lián)配比對(duì)結(jié)果表明，分離毒株與RF毒株VP6蛋白結(jié)構(gòu)的距離函數(shù)(Root-mean-square deviation，RMSD)值為0.076 ?，說明分離毒株RVA/Pig-wt/HN2019-01與RF毒株的VP6蛋白立體結(jié)構(gòu)極為相似(RMSD值越小，結(jié)構(gòu)間相似度越高)。

圖10 RV分離毒株VP6蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將RVA/Pig-wt/HN2019-01株的VP6氨基酸序列與已報(bào)道毒株(豬源OSU株、人源Wa株、鼠源EDIM株)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位區(qū)域進(jìn)行比對(duì)分析(表2)，發(fā)現(xiàn)除個(gè)別位點(diǎn)(P295、P349)外，RVA/Pig-wt/HN2019-01的VP6在2個(gè)CTL抗原表位區(qū)域氨基酸序列保守。

表2 VP6蛋白CTL抗原表位序列

3 結(jié)論與討論

本研究分離獲得豬RV毒株RVA/Pig-wt/HN2019-01，其VP6基因與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的RVA參考毒株的VP6基因核苷酸及其編碼氨基酸序列的相似性分別為76.7%～97.9%和88.2%～99.7%，氨基酸的序列相似性比核苷酸的序列相似性整體要高，說明VP6核苷酸序列中存在一定數(shù)量的無義突變。研究發(fā)現(xiàn)，豬源RVA在檢測(cè)到的G基因型和P基因型中通常有所不同，但大多具有I5-R1-C1-M1-A8-N1-T7-E1-H1遺傳主鏈[21]。本研究中，RVA/Pig-wt/HN2019-01毒株VP6基因與已報(bào)道的豬源毒株SWU-1C核苷酸序列相似性最高，處于較近的進(jìn)化分支，同屬于I5亞群，而在此亞群中的BE2001毒株和Ryukyu-1120毒株均為能夠感染人的輪狀病毒，也提示了此毒株跨種傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

VP6蛋白是輪狀病毒的群特異性抗原，同群中高度保守，可以誘導(dǎo)針對(duì)不同輪狀病毒毒株的交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答，具有良好的免疫原性和抗原性[22-23]。鼠輪狀病毒EDIM株的P289—302區(qū)域被鑒定為CD4+T細(xì)胞抗原表位[24]。人輪狀病毒W(wǎng)a株的P340—348區(qū)域被鑒定為CD8+T細(xì)胞抗原表位[25]。本研究中，RVA/Pig-wt/HN2019-01的VP6蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與牛RV(RF毒株)的VP6蛋白結(jié)構(gòu)高度一致，且氨基酸序列在已報(bào)道的2個(gè)CTL抗原表位區(qū)域相對(duì)保守。

綜上，本研究分離的豬源RV河南株RVA/Pig-wt/HN2019-01為I5亞群的RV毒株，其VP6蛋白與牛源RV的VP6蛋白結(jié)構(gòu)相似，且與鼠源及人源RV的CTL抗原表位區(qū)域序列相近。本研究結(jié)果為豬RV新型疫苗的設(shè)計(jì)、診斷試劑的研發(fā)及單克隆抗體的篩選等奠定了基礎(chǔ)。