朱國萍，章超樺，曹文紅，盧虹玉，秦小明，高加龍，鄭惠娜

（廣東海洋大學食品科技學院//國家貝類加工技術研發(fā)分中心（湛江）//廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室//廣東省海洋生物制品工程實驗室//水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

近年研究發(fā)現(xiàn)，飲食對學習記憶的調(diào)節(jié)具有十分重要的作用[1]，飲食與大腦變化間存在關聯(lián)[2-3]，因此利用富含功效活性營養(yǎng)成分的食物作為飲食來源是一種具有潛在改善學習記憶功效作用的干預手段。許多陸生植物提取物已被證實具有顯著改善學習記憶的功效，核桃蛋白酶解物[4]、火麻仁提取液[5]可有效改善D-半乳糖誘導的學習記憶損傷小鼠對空間和有害刺激的學習記憶能力；枸杞子提取物[6]可顯著改善阿爾茨海默?。ˋD）小鼠的學習和記憶缺陷；日本當藥（Swertia japonica）[7]、金針菇（Flammulina velutipes）多糖[8]對東莨營堿誘導記憶功能損傷小鼠的空間學習和記憶能力均有顯著的修復作用。相對于陸生植物來源產(chǎn)物，來源于海洋的水產(chǎn)品因其生活環(huán)境的差異，使其含有獨特的天然活性物質(zhì)，呈現(xiàn)多樣的功效活性。近年的研究發(fā)現(xiàn)部分水產(chǎn)品的酶解產(chǎn)物也具有良好的改善學習記憶的作用。如海參（Cucumaria frondose）[9]和燈籠魚（Benthosema pterotum）[10]的酶解產(chǎn)物可改善D-半乳糖引起的早衰小鼠學習記憶障礙；鳳尾魚（Coilia mystus）酶解產(chǎn)物可改善東莨菪堿誘導的小鼠記憶損傷[11]，馬氏珠母貝（Pinctada martensii）酶解蛋白粉可改善自然衰老導致的斑馬魚學習記憶能力衰退[12]。利用海洋來源的水產(chǎn)品進行學習記憶功效作用的研究已成為當前研究熱點。

牡蠣富含蛋白質(zhì)、糖原、?；撬?、鋅、硒等營養(yǎng)物質(zhì)，素有“根之源”“海洋牛奶”等美稱[13]，是研究學習記憶改善功效作用富有潛力的原料。Wang 等[14]發(fā)現(xiàn)大連灣牡蠣（Crassostrea talienwhanensis）的酶解產(chǎn)物可縮短正常小鼠空間探索實驗中總游泳路程，提高小鼠目標象限時間，也能延長小鼠在黑白箱實驗中白箱停留時間；課題組前期發(fā)現(xiàn)香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）酶解產(chǎn)物對正常小鼠及D-半乳糖誘導記憶損傷小鼠學習記憶均有一定改善作用[15-16]。前期實驗結果均證實牡蠣酶解產(chǎn)物具有改善學習記憶的功效作用，但課題組前期使用的行為學評價方法不夠系統(tǒng)，僅采用單一的行為學實驗方法對小鼠行為學進行觀察，也沒有對牡蠣酶解產(chǎn)物灌胃劑量進行篩選，其所含的與該生物活性相關性較大的營養(yǎng)成分含量尚不清楚。因此，本研究采用跳臺實驗、避暗實驗、水迷宮實驗相結合，利用高、中、低三劑量牡蠣酶解產(chǎn)物灌胃小鼠，綜合考察牡蠣酶解產(chǎn)物提高正常小鼠學習記憶的能力，明確灌胃劑量及功效作用，同時測定其營養(yǎng)成分，了解其相關營養(yǎng)成分的含量，以期為未來利用牡蠣開發(fā)改善學習記憶的保健功效食品奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）購自廣東省湛江市東風市場；BALB/c 小鼠、C57BL/6 小鼠（6～8 周齡，雄性，無特性病原體SPF 級），許可證號SCXK（粵）2013-0002，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心；中性酶（5×104U/g），食品級，購自廣西南寧龐博生物工程有限公司；苯酚，AR，購自廣州化學試劑廠；葡萄糖，AR，購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司；吡拉西坦片，購自東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司。

1.2 儀器與設備

U410 超低溫冰箱：英國 New Brunswick Scientific；T18 高速分散機：德國IKA 公司；V-1100V-WB 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海埃朗儀器有限公司；MW800 VHP 微波消解系統(tǒng)：加拿大Aurora 公司；Thermo MKIIM6 原子吸收分光光度計：美國Thermo 公司；Flyde-maz 跳臺記錄儀：廣州飛迪公司；PAT-8 避暗實驗視頻分析系統(tǒng)：成都泰盟軟件有限公司；JL Behv-MWMG 水迷宮視頻分析系統(tǒng)：上海吉量軟件科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1牡蠣酶解產(chǎn)物的制備 牡蠣自然解凍后，組織均漿，然后按質(zhì)量（mg）體積（mL）比1∶3 加水，調(diào)節(jié)pH 至7.0，按質(zhì)量分數(shù)2%加入中性蛋白酶，50 ℃下酶解3 h，100 ℃下滅酶10 min，以10 000 r/min 離心20 min 取上清液，真空濃縮后冷凍干燥，-80 ℃ 超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2氨基酸組成測定 氨基酸組成采用氨基酸

1.3.5跳臺實驗[17]根據(jù)動物在封閉空間中，會在邊緣與角落里活動的生活特性而設計，在銅柵四處探索的小動物遭受電擊后會立即跳上平臺進行躲避，經(jīng)過多次電擊后的動物，會產(chǎn)生短暫的記憶。跳臺實驗分記憶鞏固與記憶消退實驗。

記憶獲得訓練：末次給藥后2 d 將小鼠單獨放到跳臺儀反應箱中（平臺上、下均讓動物熟悉），適應3 min 后，將動物放在銅柵上，立即通入36 V的交流電，動物受電擊后會立刻跳回平臺躲避傷害，訓練1 次后，將小鼠放在反應箱平臺上，記錄5 min 內(nèi)小鼠第一次跳下平臺的時間，即為潛伏期。并記錄跳下平臺的錯誤次數(shù)。

記憶鞏固實驗：末次給藥3 d 后進行重復實驗，將小鼠放在反應箱平臺上，記錄第一次跳下平臺的時間，即為潛伏期，記錄3 min 內(nèi)受電擊次數(shù)、受電擊的動物總數(shù)，計算出現(xiàn)錯誤反應的動物百分率分析儀按 GB5009.124-2016 測定。

1.3.3無機元素的測定 無機元素含量的測定采用火焰原子吸收法按GB/T 15337-2008 測定。

1.3.4動物分組、給藥及飼養(yǎng) BALB/c 小鼠用于跳臺實驗及避暗實驗，C57BL/6 小鼠用于水迷宮實驗；動物飼養(yǎng)在專用動物房，5 只/箱群養(yǎng)，采用12 h 晝∶12 h 夜的照明方式；期間動物按實驗要求喂給相應顆粒飼料，并且動物自由進食飲水。

給藥方法：動物分組后，受試樣品LG、MG、HG 組按20 mL/kg 的灌胃劑量以相應濃度的受試樣品液，PG 組需灌胃吡拉西坦陽性藥液，CT 組需灌胃純凈水，各組灌胃1 次/日。實驗開始前，跳臺實驗、避暗實驗和水迷宮實驗均灌胃30 d，但水迷宮實驗開始后訓練期間要求繼續(xù)給藥，故水迷宮實驗共計灌胃40 d。具體動物實驗劑量及分組見表1。（即受電擊動物總數(shù)占該組動物總數(shù)的百分率）。

表1 劑量設計與分組Table 1 Dose design and grouping

記憶消退實驗：末次給藥8 d 后進行一次記憶消退實驗，方法同記憶鞏固實驗。

1.3.6避暗實驗[18]利用動物趨暗避明生活習性而設計的裝置，喜歡呆在暗室的小鼠在遭受電擊后回到明室，當小鼠遭受多次電擊后會產(chǎn)生短暫的記憶。避暗實驗同樣分記憶鞏固與記憶消退實驗。

記憶獲得訓練：末次給藥24 h 后 開始訓練，小鼠放入避暗儀中適應3 min，后背向避暗儀洞口，放入明室，同時啟動計時器，暗室電壓調(diào)為3 檔，小鼠穿過洞口進入暗室受到電擊時，計時器自動停止，此時間即為潛伏期。訓練5 min，記錄5 min內(nèi)電擊次數(shù)。

記憶鞏固實驗：于記憶獲得訓練后24 h，小鼠不需要適應3 min，直接按記憶獲得訓練作實驗，記錄潛伏期、5 min 內(nèi)的電擊次數(shù)、進入暗室的動物數(shù)，計算出現(xiàn)錯誤反應的百分率（即進入暗室動物總數(shù)占該組動物總數(shù)的百分率）。

記憶消除實驗：記憶鞏固實驗結束5 d 后，進行記憶消退實驗，方法同記憶鞏固實驗。

1.3.7水迷宮實驗 水迷宮實驗可將實驗動物的學習障礙與感覺、運動缺陷等方面分開，減少其對空間學習記憶過程檢測的干擾[19-20]，能較準確地反映動物的空間參考記憶和工作記憶能力[21-22]。Morris 水迷宮是神經(jīng)生物學領域研究中最廣泛應用的迷宮實驗，包括定位航行和空間探索實驗。

定位航行實驗：實驗前1 d，小鼠自由游泳90 s適應環(huán)境，期間引導小鼠站上站臺5 s，次日開始實驗。實驗時，站臺設置在第二象限，水迷宮水面高出站臺0.5 cm，水溫控制在（23±2）℃，并沿泳池壁貼好黑色參照物，從1 個象限中將小鼠面向池壁放入水中，計時90 s，讓小鼠尋找站臺并在站臺上停留3 s，儀器自動記錄小鼠尋找并爬上站臺的游泳路線圖、總路程、所需時間（逃避潛伏期）。若小鼠90 s 內(nèi)不能找到平臺，則由實驗人員引導其到達站臺，并在站臺上逗留3 s，潛伏期記為90 s。每天4 個象限均訓練一次，每次間隔約10 min，訓練1 d 后，進行3 d 的定位航行實驗，期間無需引導上站臺，每天小鼠放入象限的順序應不相同。四個象限的平均成績?yōu)樽罱K的成績。訓練期間繼續(xù)給藥。

空間探索實驗：定位航行實驗結束5 d 后，將水下站臺撤除，水溫控制在（23±2）℃，并沿泳池壁貼好參照物，按定位航行實驗的方法，分別從四個象限將動物面朝池壁放入水中，記錄90 s 內(nèi)動物的游泳路線、路程、在原站臺處穿越的次數(shù)，在原站臺所在象限逗留的時間。四個象限的平均成績作為最終的成績。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差表示，并應用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計及分析；計量資料的數(shù)據(jù)方差齊，或數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后的方差齊，則采用單因素的方差分析（ANOVA）；若數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后方差仍不齊，采用秩和檢驗的方法進行統(tǒng)計分析。顯著性水平為α=0.05。

2 結果與分析

2.1 牡蠣酶解產(chǎn)物氨基酸的含量

牡蠣經(jīng)水解后獲得較高含量的總氨基酸及部分游離氨基酸，氨基酸的含量如表2 所示。18 種水解氨基酸中谷氨酸的含量最高，其次為天冬氨酸，分別占總氨基酸的質(zhì)量分數(shù)為15.7%、9.68%；游離氨基酸中則以蘇氨酸占比最高。牡蠣酶解產(chǎn)物中?；撬豳|(zhì)量分數(shù)較高，達2.85%，其含量遠高于魚類及甲殼類，是黃鯛（3.47 mg/g）及日本對蝦（1.99 mg/g）[23]所含牛磺酸的8 倍和14 倍。

表2 牡蠣酶解產(chǎn)物氨基酸組成及質(zhì)量分數(shù)（干基）Table 2 Composition of amino acids of enzymatic hydrolysis from oyster (dry matter basis) %

2.2 牡蠣酶解產(chǎn)物無機元素的含量

牡蠣酶解產(chǎn)物無機元素的含量如表3 所示，測定的8 種無機元素中Na、K 元素的質(zhì)量分數(shù)遠高于其他元素，分別為1 414 mg/100g 和1 045 mg/100g，Se 含量在測定的8 種無機元素中最低。Zn 質(zhì)量分數(shù)高達175 mg/100g。

表3 牡蠣酶解產(chǎn)物無機元素質(zhì)量分數(shù)(干基)Table 3 Composition of inorganic elements of enzymatic hydrolysis from oyster (dry matter biasis) %

2.3 基于跳臺實驗分析牡蠣酶解產(chǎn)物對小鼠學習記憶的影響

鞏固實驗結果（表4）顯示各組小鼠均沒有錯誤跳下平臺遭受銅柵電擊，潛伏期均為180 s（圖1_A），顯示各組小鼠的學習能力不存在差異性（P >0.05）。消退實驗CT 組出現(xiàn)4 只小鼠跳下平臺，樣品組LG、MG、HG 組分別有3、3、2 只小鼠跳下平臺，錯誤動物數(shù)及犯錯次數(shù)有所減少，但差異不顯著（P >0.05），而PG 組沒有出現(xiàn)小鼠錯誤跳下平臺的情況；相較于CT 組，喂食吡拉西坦可顯著延長小鼠的潛伏期（P <0.05），喂食牡蠣酶解產(chǎn)物

圖1 跳臺實驗逃生潛伏期Fig.1 Escape latency in step down test

表4 跳臺實驗錯誤動物數(shù)及錯誤次數(shù)Table 4 Number of errors of animal in step down test

2.4 基于避暗實驗分析牡蠣酶解產(chǎn)物對小鼠學習記憶的影響

鞏固實驗五組均有小鼠進入通電的暗室，各組錯誤動物數(shù)及潛伏期差異不明顯，小鼠間學習能力無差別（P >0.05）（表5、圖2_A）。記憶消退實驗結果發(fā)現(xiàn)，與CT 組相比，喂食吡拉西坦及牡蠣酶解產(chǎn)物均可減少小鼠進入暗室的數(shù)量（表5），延長小鼠進入暗室的潛伏期（P <0.05）（圖2_B），具有提高小鼠學習記憶能力的功效作用，喂食吡拉西坦全組小鼠沒有進入暗室。三個劑量樣品組錯誤動物數(shù)與空白對照組相比，分別減少4、3、5 只，潛伏期為（214±44）、（228±37）、（287±13），分別延長21、35、94 s（P <0.05）。高劑量牡蠣酶解產(chǎn)物延長小鼠的潛伏期接近吡拉西坦，具有相當于吡拉西坦提高小鼠的學習記憶能力的功效作用。

表5 避暗實驗錯誤動物數(shù)及錯誤次數(shù)Table 5 Number of errors of animal in through test

圖2 避暗實驗逃生潛伏期Fig.2 Escape latency in through test

2.5 基于水迷宮實驗分析牡蠣酶解產(chǎn)物對小鼠學習記憶的影響

定位航行實驗中，隨著測試時間的延長，各組小鼠上臺前的路程及潛伏期均呈現(xiàn)逐漸縮短的趨勢，至3 d，HG、LG 組及PG 組小鼠上臺前路程及潛伏期均顯著低于1 d（P <0.05）。與CT 組相比，2 d 時HG 組上臺前的路程及潛伏期也分別縮短1105 mm（P <0.05）、5.3 s（P <0.05），遠低于PG組；至3 d，LG 組上臺前的路程也比CT 組顯著縮短1 431 mm（P <0.05）（圖3）。

圖3 定位航行逃生路程及潛伏期Fig.3 Escape distance and lantency in place navigation trail

空間探索實驗發(fā)現(xiàn)，牡蠣酶解產(chǎn)物三劑量組小鼠在目標象限所停留時間及穿越平臺次數(shù)均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，HG 組小鼠目標象限停留時間及穿越平臺次數(shù)均最高，其穿越平臺次數(shù)顯著高于CT 組（P <0.05），與PG 組相當，但各組小鼠目標象限所停留時間不存在明顯差異（P >0.05）（圖4）。

圖4 空間探索實驗中目標象限時間比例及穿越平臺次數(shù)Fig.4 Percentage of target time and crossing times in spatial probe test

2.6 牡蠣酶解產(chǎn)物對實驗小鼠體質(zhì)量的影響

實驗過程中各組小鼠體質(zhì)量變化見表6-8。各組小鼠體質(zhì)量均呈現(xiàn)增長趨勢，且逐漸增加，不同處理組間小鼠體質(zhì)量增長無顯著差異（P >0.05），說明牡蠣酶解產(chǎn)物對實驗小鼠沒有毒副作用。

表6 跳臺實驗各組小鼠體質(zhì)量Table 6 Weight of mice in step down test g

表7 避暗實驗各組小鼠體質(zhì)量Table 7 Weight of mice in step through test g

表8 水迷宮實驗各組小鼠體質(zhì)量Table 8 Weight of mice in Morris water maze test g

3 討論

水產(chǎn)品酶解產(chǎn)物改善學習記憶的功效作用報道研究中，一些來源于水產(chǎn)品的活性肽[21]、多糖[21]、酶解產(chǎn)物[9-11]及酶解蛋白粉[12]均呈現(xiàn)出良好的學習記憶改善作用。這些來源于海洋的水產(chǎn)品蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)含量豐富，多糖生物活性強。蛋白質(zhì)經(jīng)酶解發(fā)生降解釋放生物活性肽及氨基酸，氨基酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中具有廣泛的生理病理作用。部分氨基酸通過提高空間記憶作用[24]、神經(jīng)細胞的增殖作用[25]，海馬區(qū)的長時程增強[26]，干擾神經(jīng)細胞的凋亡通路[27-28]，促進神經(jīng)細胞的分化、生成，提高認知功能[29]，降低缺氧環(huán)境對人類認知功能的損害[30]等方式參與多方面正常腦功能，包括認知、記憶及學習。無機元素K、Ca2+、Mg2+等離子能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[31-33]。給予小鼠長期飲用含Mg2+的水，可增強其腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達，能增強大鼠的空間學習記及工作憶能力[33]；鋅是許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)突觸的共同傳遞因子且參與突觸的可塑性[34-35]，是神經(jīng)元轉(zhuǎn)運過程中必不可少的金屬元素[36]。富含?；撬?、鋅等無機元素且氨基酸種類齊全的牡蠣酶解產(chǎn)物具有改善學習記憶功效的潛在價值。

跳臺實驗、避暗實驗、迷宮實驗等行為學實驗近年已成為神經(jīng)藥理學、神經(jīng)生理學、神經(jīng)心理學、老年病學等的常用研究手段[37-38]。跳臺實驗和避暗實驗均屬于被動回避反應實驗，聯(lián)合運用可以更準確地反應藥物對動物長時期記憶的作用。牡蠣酶解產(chǎn)物能顯著延長避暗消退實驗小鼠的潛伏期，降低錯誤動物數(shù)，且高劑量樣品延長小鼠的潛伏期接近吡拉西坦。吡拉西坦是目前臨床上用于治療退行性神經(jīng)性疾病的有效藥物，牡蠣酶解產(chǎn)物延長避暗消退實驗小鼠的潛伏期與吡拉西坦的效果相當，說明牡蠣酶解產(chǎn)物具有相當于吡拉西坦提高學習記憶能力的功效作用。牡蠣酶解產(chǎn)物也能一定程度延長跳臺消退實驗的潛伏期，但差異不顯著，可能與樣品劑量較低有關。水迷宮實驗屬主動動物反應實驗，實驗小鼠在喂食牡蠣酶解產(chǎn)物后縮短了逃避潛伏期及上臺前路程（上臺前潛伏期及路程），并提高了穿越平臺的次數(shù)，證明牡蠣酶解產(chǎn)物能夠提高小鼠空間記憶和工作記憶能力，使小鼠能清晰辨識出迷宮原平臺位置，從而采取更直線的游泳路徑，快速找到水下平臺逃生。

與林海生等[14]僅采用單一劑量進行水迷宮實驗探究牡蠣酶解產(chǎn)物改善小鼠學習記憶的功效作用不同，本研究采用高、中、低三劑量進行灌胃劑量的篩選，結合跳臺、避暗及水迷宮進行綜合評價。在跳臺實驗、避暗實驗和水迷宮實驗中，牡蠣酶解產(chǎn)物改善小鼠學習記憶的功效作用均呈現(xiàn)出劑量依賴性，小鼠在跳臺實驗及避暗實驗的逃生潛伏期均隨著灌胃劑量的提高而延長，而水迷宮實驗中定位航行逃生潛伏期及逃生路程隨著灌胃劑量的提高而縮短，其穿越平臺次數(shù)隨著灌胃劑量的提高而提高。高、中、低三個灌胃劑量對小鼠的學習記憶均有一定的改善作用，但高劑量組改善作用最好。對灌胃劑量的篩選有利于選擇合適劑量的牡蠣酶解產(chǎn)物，使其發(fā)揮最優(yōu)的功效作用。

利用被動與主動實驗相結合也已成為動物行為學實驗行之有效的評價方法。Gong 等[39]在研究蓮蓬原花青素對D-半乳糖引起的早衰小鼠認知功能障礙的改善作用時采用Y-迷宮和跳臺實驗相結合進行評價；Su 等[11]采用Morris 水迷宮和跳臺實驗評價鳳尾魚酶解產(chǎn)物及其美拉德反應物改善東莨膽堿引起的小鼠記憶損傷；Jeon 等[40]采用避暗實驗和Y-迷宮研究齊墩果酸對東莨菪堿引起的大鼠認知功能障礙的改善作用。通過四項行為實驗（跳臺實驗、避暗實驗、穿梭箱實驗及水迷宮實驗）中任二項實驗結果陽性來判定一種受試樣品具有輔助改善功能，本研究中牡蠣酶解產(chǎn)物可顯著延長小鼠進入避暗箱的潛伏期（避暗實驗陽性），也顯著縮短小鼠定位航行上臺前路程及潛伏期，提高小鼠穿越平臺的次數(shù)（水迷宮實驗陽性），從而可以判定牡蠣酶解產(chǎn)物具有提高小鼠學習記憶能力的功效作用。

4 結論

牡蠣酶解產(chǎn)物牛磺酸、鋅含量豐富，氨基酸種類齊全；三種劑量牡蠣酶解產(chǎn)物飼喂小鼠30 d 后，高劑量牡蠣酶解產(chǎn)物顯示最好的功效作用，能顯著延長避暗消退實驗小鼠逃生潛伏期，縮短定位航行實驗小鼠上臺前路程及潛伏期，并提高空間探索實驗小鼠穿越平臺的次數(shù)，具有顯著提高小鼠學習記憶能力的功效作用。