侯 景，申超超，張大俊，楊 博，史喜絹，張 婷，崔卉梅，袁興國，趙登率，陳學(xué)輝，張克山，鄭海學(xué)，劉湘濤

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

1921年，非洲豬瘟(African swine fever，ASF)首次在肯尼亞報(bào)道[1]，2018年，首次傳入中國，由于其高死亡率引起生豬大面積的死亡，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2-3]。非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是ASFV科的唯一成員，是線性雙鏈DNA病毒，呈直徑約為200 nm的正二十面體，其含有直徑70～100 nm的DNA核心，外周是直徑172～191 nm的衣殼和含類脂的囊膜，整個基因組大約含有151個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，可以編碼150～200種蛋白[4-10]。

ASFV基因組編碼5個解旋酶，分別被命名為D1133L、B962L、QP509L、Q706L、A859L，均屬于解旋酶超家族II家族成員。ASFV的5個解旋酶中，QP509L和Q706L屬于解旋酶超家族II DEXH/D-box家族中DEAD-box家族成員，通過基因序列分析間接證明D1133L為該家族成員[11]。DEAD-box家族解旋酶的最主要特征為含有D-E-A-D(天冬氨酸-谷氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)特定的氨基酸序列[12-13]，該家族Elf4A和Elf4B解旋酶發(fā)揮功能的氨基酸是谷氨酸，因谷氨酸為酸性氨基酸在R基團(tuán)的碳環(huán)上含有極鍵[14]，因此谷氨酸在DEAD-box家族中更加穩(wěn)定保守。在天然免疫領(lǐng)域中的DEAD-box家族解旋酶主要作用是促進(jìn)雙鏈DNA、雙鏈RNA解螺旋，與mRNA 結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而抑制翻譯，在蛋白水平上抑制宿主天然免疫應(yīng)答進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和炎癥形成[12]。研究證明D1133L和B962L位于ASFV的病毒基因組中心，兩者被40 kb堿基分開。D1133L和B962L類似于酵母“DEAH”前期mRNA 處理牛痘病毒ATP酶的D11L和D6R蛋白[15]。

本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)D1133L蛋白明顯抑制宿主天然免疫應(yīng)答(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，已報(bào)道單獨(dú)敲除D1133L、QP509L和Q706L后ASFV無法復(fù)制，說明解旋酶是ASFV的關(guān)鍵基因[11]。為進(jìn)一步明確ASFV D1133L基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，本研究使用Mega6.0軟件繪制了ASFV編碼的5個解旋酶基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，對D1133L蛋白進(jìn)行了二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，合成了D1133L基因，構(gòu)建了D1133L真核表達(dá)質(zhì)粒，研究了D1133L蛋白在宿主細(xì)胞的亞細(xì)胞定位。

1 材料與方法

1.1 材料

pCMV-N-flag真核表達(dá)載體、293T人源腎上皮細(xì)胞、PK-15豬源腎上皮細(xì)胞均由蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫與新發(fā)病流行性病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存；pCMV-N-flag-D1133L基因的真核表達(dá)質(zhì)粒由武漢金開瑞合成；大腸桿菌Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞購自全式金公司(CD201-02)；EcoR Ⅰ內(nèi)切酶(1040s)、BamH Ⅰ內(nèi)切酶(1010s)、PrimeSTAR?HS (Premix)(R040A)購于TaKaRa公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購于Invitrogen公司(11668019)；膠回收試劑盒(D2500-2)、質(zhì)粒小量提取試劑盒(D6943-02)均購于Omega公司；DMEM培養(yǎng)基(C11965500BT)、Opti-MEM(31985070)和0.25% EDTA胰酶(25200072)均購于Gibco公司；PBS溶液(pH7.4)購于Hyclone公司(SH30256.01)；鼠抗FLAG單抗(80010-1-RR)、HRP標(biāo)記Alexa山羊抗鼠IgG二抗(SA00001-1)均購于Proteintech公司；鼠抗β-Actin單抗(MA1-140)購于Thermo Scientific公司。3 cm玻底共聚焦專用小皿(801001)購自NEST公司。ASFV陽性滅活血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫與新發(fā)病流行病學(xué)團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 D1133L基因序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載ASFV 5個解旋酶的基因序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的7株不同基因型的D1133L基因序列，利用在線工具PRABI、GOR4、SWISS-MODEL、cNLS Mapper、EXPASY、Psort等和SnapGene 4.1.2、Mega 6、RasMol2.7、DNAman分析軟件對7株不同基因型的D1133L基因序列多基因序列比對、基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建、同源性結(jié)構(gòu)分析，并對5個解旋酶多基因序列比對、基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建、同源性結(jié)構(gòu)分析、跨膜區(qū)、NLS序列和二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測等。

1.3 D1133L真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

以GenBank公布的Georgia 2007/1(LR743116.1)基因組數(shù)據(jù)中D1133L基因序列為參考，全基因合成D1133L的基因序列，經(jīng)序列測定鑒定正確，將該基因正確插入到pCMV-N-flag表達(dá)質(zhì)粒中。

1.4 重組質(zhì)粒表達(dá)驗(yàn)證

以1×106293T細(xì)胞量鋪于6孔板，5%CO2，37 ℃，放置5～8 h，待細(xì)胞長至80%～90%時(shí)，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(參考說明書)，轉(zhuǎn)染量為1 μg·孔-1(DNA∶脂質(zhì)體2000=1 μg∶2 μL)。制備細(xì)胞蛋白樣品：轉(zhuǎn)染24 h后，收集轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMV-N-flag-D1133L的細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染空載的對照細(xì)胞，加入RAPI裂解液(含1 mmol·L-1PMSF)，充分裂解后，12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，加入5 ×SDS 蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮樣10 min。配制5%的濃縮膠和10%的分離膠，以鼠抗flag單抗為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體為二抗，Western blot驗(yàn)證pCMV-N-flag-D1133L的表達(dá)。

1.5 亞細(xì)胞定位觀察

以1×106PK-15細(xì)胞鋪于3 cm玻底培養(yǎng)皿，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染0.5 μg pCMV-N-flag-D1133L重組質(zhì)粒(參考說明書)，轉(zhuǎn)染12 h后，棄掉上清，PBS(pH 7.4)洗滌3次，每次10 min，再用4%多聚甲醛固定24 h，PBST(pH 7.4，含0.5%Tween 20)洗滌3次，Triton-X100處理10 min，2%BSA封閉1 h，PBST(同上)洗滌3次，加入ASFV陽性滅活血清(1∶100)，孵育18 h，PBS(pH 7.4)洗滌3次，再孵育偶聯(lián)熒光Alexa山羊抗鼠IgG二抗(1∶500)5 h，PBS(同上)洗滌3次，加入4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)對細(xì)胞核染色10 min，再用PBS(pH 7.4)洗滌3次，每次2 min，激光共聚焦顯微鏡63×油鏡下觀察熒光蛋白的亞細(xì)胞定位分布。此外，通過Image J軟件分別檢測了D1133L陽性蛋白在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的分布，并統(tǒng)計(jì)總分布(重復(fù)3次)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

將Image J檢測的3次數(shù)據(jù)求取平均值，以總分布作為對照，通過對照/對照，平均值/對照計(jì)算D1133L蛋白在PK-15細(xì)胞的分布比例，并利用Graph pad prism 8.0.1繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 ASFV 編碼的解旋酶基因序列比較分析

根據(jù)NCBI在線數(shù)據(jù)庫中公布的7株不同基因型的D1133L基因；以Georgia 2007/1(LR743116.1)序列，獲得5個解旋酶基因，各個解旋酶詳情見表1。7株不同基因型的D1133L核苷酸序列完全一致(圖1A)。在5個解旋酶基因中，D1133L與其他4個 解旋酶核苷酸同源性較低，且5個解旋酶均相對保守獨(dú)立，應(yīng)用Mega6構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)D1133L與Q706L在全基因組中距離較近(圖1B)。

表1 解旋酶基因相似性比較Table 1 Gene homology comparison of helicase genes

A.7株不同基因型的D1133L基因；B.獲得的5個解旋酶基因A.D1133L genes of 7 different genotypes;B.5 helicase genes obtained圖1 ASFV解旋酶基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of helicase genes

Georgia 2007/1為Ⅱ型強(qiáng)毒株，通過DNAMAN序列比對，7個不同的D1133L氨基酸序列[D1133L(NC_044959.1)、BA71V(NC_001659.)、BA71(NC044942.1)、Benin 97/1(NC_044956.1)、NHV(NC_044943.1)、L60(NC_044941.1)、OURT 88/3(NC_044957.1)]完全一致(結(jié)果略)。5個解旋酶基因在Georgia 2007/1毒株中僅有7個同源位點(diǎn)，5個解旋酶高度保守，通過相似性分析發(fā)現(xiàn)D1133L與QP509L在5個解旋酶當(dāng)中距離較近，詳見表2。

表2 5個解旋酶氨基酸同源性分析Table 2 Homology analysis of 5 helicase proteins

2.2 D1133L蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

7株D1133L基因一級結(jié)構(gòu)表明該基因全長均為3 402 bp，G+C含量為6.1%，A+T含量為10.6%(圖2A)；表達(dá)的蛋白為124.63 ku，通過GOR4網(wǎng)絡(luò)預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示α螺旋占48.90%，無規(guī)卷曲為33.27%，擴(kuò)展鏈占13.50% (圖2B)，氨基酸相似域曲線分析結(jié)果表明D1133L蛋白主要為組氨酸，其次是谷氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、甘氨酸和天冬氨酸(圖2C)。

A.一級結(jié)構(gòu)；B.二級結(jié)構(gòu)；C.氨基酸序列分析A.Primary structure;B.Secondary structure;C.Amino acid sequence analysis圖2 GOR4軟件分析并預(yù)測D1133L蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.2 Analysis and prediction of secondary structure of D1133L protein

將D1133L蛋白氨基酸序列提交在線工具Swiss-Model，獲得了三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果顯示預(yù)測的D1133L蛋白三級結(jié)構(gòu)與Ankyrin-1、Ankyrin-2結(jié)構(gòu)的QMQE為0.20，覆蓋率84%；證明了D1133L蛋白的高級結(jié)構(gòu)是α螺旋為主(圖3)。

A.骨架結(jié)構(gòu)；B.帶狀結(jié)構(gòu)；C.球形結(jié)構(gòu)A.Backbone structure;B.Ribbon structure;C.Spherical structure圖3 D1133L蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of tertiary structure of D1133L protein

將D1133L蛋白序列輸入在線工具NLS-Mapper中，預(yù)測得到D1133L蛋白可能包括28段NLS雙分型序列(無NLS單分型序列)，其Cut-off分?jǐn)?shù)均大于2.0，根據(jù)得分從高到低排序(表3)?；赟VM算法的預(yù)測方法LOCSVMPSI和基于PSI-BLAST數(shù)據(jù)的預(yù)測方法HSLpred均顯示D1133L蛋白可能定位于線粒體的概率為4.3%，分泌系統(tǒng)囊泡的概率為4.3%，真核細(xì)胞核內(nèi)的概率為43.5%，真核細(xì)胞質(zhì)的概率為43.5%。

表3 PCMV-D1133L蛋白序列的雙分型NLS預(yù)測Table 3 Prediction of the bimorphic NLS of PCMV-D1133L protein sequence

2.3 pCMV-N-flag-D1133L重組質(zhì)粒構(gòu)建和表達(dá)驗(yàn)證

轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，按照“1.4”對細(xì)胞樣品處理，WB驗(yàn)證pCMV-N-flag-D1133L真核質(zhì)粒的表達(dá)大小為124.63 ku，與預(yù)期一致。內(nèi)參為細(xì)胞骨架微絲肌動蛋白β-actin蛋白(42 ku)。結(jié)果證明，構(gòu)建的pCMV-N-flag-D1133L真核表達(dá)質(zhì)粒可以在293T人源腎上皮細(xì)胞中表達(dá)(圖4 A)，且β-actin正常表達(dá) (圖4B)。

A.pCMV-N-flag-D1133L表達(dá)驗(yàn)證(-.EV過表達(dá)產(chǎn)物；+.D1133L過表達(dá)產(chǎn)物)；B.內(nèi)參(-.EV過表達(dá)產(chǎn)物內(nèi)參；+.D1133L過表達(dá)產(chǎn)物內(nèi)參)A.pCMV-N-flag-d1133l expression verification (-.293T cell lysis product;+.D1133L overexpression product);B.Internal reference (-.Internal reference of lysis product of 293T cells;+.Internal reference of D1133L overexpressed product)圖4 293T細(xì)胞Western blot驗(yàn)證pCMV-N-flag-D1133L重組質(zhì)粒的表達(dá)Fig.4 Expression verification of pCMV-N-flag-D1133L recombinant plasmid by Western blot

2.4 PCMV-D1133L蛋白的亞細(xì)胞定位觀察

按照“1.5”對細(xì)胞樣品處理，轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，通過3 cm玻底小皿觀察DAPI染色細(xì)胞核可見呈藍(lán)色熒光(圖5A)，pCMV-N-flag-D1133L蛋白是紅色熒光(Alexa)(圖5B)定位在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中 (圖5C)。Graph pad prism 8.0.1統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，D1133L蛋白在PK-15細(xì)胞的細(xì)胞核中占1.58%，細(xì)胞質(zhì)中占7.5% (圖5D)。

A.細(xì)胞核(DAPI)；B.pCMV-N-flag-D1133L蛋白(Alexa)；C.A、B合并；D.D1133L蛋白在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的分布比例A.Nucleus (DAPI);B.pCMV-N-flag-D1133L (Alexa);C.Merge of A,B；D.D1133L protein ratio圖5 pCMV-N-flag-D1133L蛋白亞細(xì)胞定位觀察(PK-15細(xì)胞)Fig.5 Observation of subcellular localization of pCMV-N-flag-D1133L protein (in PK-15 cells)

3 討 論

根據(jù)NCBI已公布的ASFV序列數(shù)據(jù)，其基因組長度為170 ～190 kb，能夠編碼大約100多種非結(jié)構(gòu)蛋白和超過50種的結(jié)構(gòu)蛋白，ASFV入侵宿主后能夠快速激活天然免疫反應(yīng)、與先天性宿主天然免疫拮抗競爭，活化誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞、產(chǎn)生免疫抗體，在病毒不斷刺激下進(jìn)而擊潰天然免疫系統(tǒng)，最急性可在未發(fā)病期間直接導(dǎo)致生豬突然死亡[9,16-19]，推測可能由于病毒繁殖速度快，病毒核酸在細(xì)胞質(zhì)中包裝完整ASFV，部分蛋白介入細(xì)胞核對核內(nèi)IFN-β或NF-κB產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致天然免疫系統(tǒng)不能抵抗病毒，最終導(dǎo)致機(jī)體崩潰，但其機(jī)制尚未明確[20-23]。國內(nèi)外關(guān)于ASFV致病機(jī)制的研究仍未詳盡[24-25]。

解旋酶家族分為SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6六類，其SF1主要是原核類，SF2是哺乳動物類，SF3～6是昆蟲節(jié)肢類，數(shù)量相當(dāng)大，至今解旋酶家族全部成員也沒有完全統(tǒng)計(jì)出來[26-28]?，F(xiàn)已知ASFV的RNA解旋酶包括D1133L、B962L、QP509L、Q706L和A859L，其中D1133L、QP509L、Q706L已經(jīng)被報(bào)道為解旋酶超家族II DEXH/D-box家族中DEAD-box家族成員[11]，ASFV復(fù)制分為早期、中期和晚期[29]，研究發(fā)現(xiàn)D1133L在ASFV的晚期復(fù)制，D1133L的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與牛痘病毒的D6R和D11相似[15]。相關(guān)研究提出ASFV內(nèi)pE248R 參與病毒融合，pE248R與痘病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞融合復(fù)合物的某些成員具有序列相似性[30-34]。在此可以預(yù)測LD1133L的復(fù)制方式與pE248R具有相似性[35-37]。此外，本研究通過7株不同基因型的D1133L多基因型序列分析及多氨基酸序列分析，結(jié)果顯示完全一致。ASFV基因組中的5個解旋酶的生物信息學(xué)分析、多基因序列相似性分析和基因系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，ASFV 5個解旋酶同源性較低，氨基酸相似性分析發(fā)現(xiàn)，5個解旋酶不僅在基因序列上是相對保守的，在氨基酸水平上也相對保守，相比之下，D1133L與QP509L的氨基酸序列較為相似。通過預(yù)測分析和IFA檢測，D1133L定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。因此，D1133L可能是ASFV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵蛋白，本研究明確了ASFV解旋酶D1133L基因序列和氨基酸序列在不同毒株間相似性是100%，進(jìn)一步闡述了D1133L基因在同一毒株當(dāng)中與其他4個解旋酶的基因序列和氨基酸序列沒有同源性。此外，預(yù)測了D1133L蛋白的結(jié)構(gòu)與分布，同時(shí)過表達(dá)D1133L后通過IFA在PK-15細(xì)胞中證實(shí)了蛋白分布，在細(xì)胞核中占1.58%，細(xì)胞質(zhì)中占7.5%。研究報(bào)道，DEAD-box解旋酶或可成為疫苗研發(fā)的新途徑，在復(fù)合佐劑方面有著廣闊的開發(fā)空間[38-42]。本研究繪制了ASFV編碼的5個解旋酶基因的遺傳進(jìn)化圖，預(yù)測了其D1133L基因的二、三級結(jié)構(gòu)并明確了D1133L基因的亞細(xì)胞定位，研究結(jié)果為從ASFV編碼的解旋酶角度揭示ASFV致病機(jī)制積累了資料。

4 結(jié) 論

ASFV包含5個解旋酶，均屬于DEAD-box家族成員，其中D1133L蛋白在7株不同ASFV毒株中高度保守，其二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，與ASFV的另一解旋酶QP509L進(jìn)化關(guān)系較近。IFA結(jié)果表明，D1133L可同時(shí)分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核，預(yù)測顯示其可能還定位于線粒體、分泌系統(tǒng)囊泡中。D1133L蛋白在真核細(xì)胞中的分布比例為細(xì)胞核占1.58%，細(xì)胞質(zhì)占7.5%。這將為研究D1133L蛋白在ASFV自有的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中的功能提供參考。