歐雋瀅,江楷煜,高瑜悅,張延杰,黃才歡
(1.暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院,廣東廣州 510632)(2.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系,廣東廣州 510632)(3.中山洪力健康食品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司,廣東中山 528430)
熱加工是食品制作的一種主要加工方式,但過(guò)度熱加工不僅破壞營(yíng)養(yǎng)素,而且產(chǎn)生有害物質(zhì),如5-羥甲基糠醛(HMF)、丙烯酰胺、雜環(huán)胺、氯丙醇、活潑羰基化合物、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)等[1-5]。食品添加劑是為改善食品品質(zhì)和色、香、味,以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或者天然物質(zhì)?;诎踩紤],食品添加劑對(duì)有害物質(zhì)形成的影響近年報(bào)道較多。研究發(fā)現(xiàn),食鹽影響油脂產(chǎn)生氯丙醇:當(dāng)添加量較低時(shí),隨著其濃度的增加,氯丙醇形成量增加;進(jìn)一步增加氯化鈉濃度,氯丙醇反而下降。在油酸甘油酯、豬油和雞油的模擬反應(yīng)體系中,食鹽促進(jìn)氯丙醇生成的最有效劑量分別是7.00%、20.00%和10.00%[6,7]。活潑羰基化合物如乙二醛、丙酮醛是丙烯酰胺和晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)形成的前體,膨松劑碳酸氫銨促進(jìn)面包、曲奇等焙烤食品中乙二醛和丙酮醛的形成[8],并顯著增加丙烯酰胺含量:當(dāng)面包中碳酸氫銨添加量分別為0.40和1.60 g/100.00 g時(shí),丙烯酰胺含量分別增加17.00和88.00倍[9]。碳酸氫鈉同樣促進(jìn)丙烯酰胺的形成。在擠壓膨化食品中(含水量22.00%~26.00%),添加0.10 g/100.00 g的碳酸氫鈉使丙烯酰胺含量增加2.00~3.50倍[10]。
鑒于一些食品添加劑可能產(chǎn)生負(fù)面作用,國(guó)家對(duì)食品添加劑的管理越來(lái)越嚴(yán)格。如2014年,國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委等5部門(mén)聯(lián)合印發(fā)的《關(guān)于調(diào)整含鋁食品添加劑使用規(guī)定的公告》,限制了硫酸鉀鋁、硫酸鋁銨等膨松劑的應(yīng)用范圍。主要原因是長(zhǎng)期攝入鋁會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生慢性毒作用,包括神經(jīng)毒性、生殖毒性和肝臟毒性[11],影響人的神經(jīng)系統(tǒng)和人的腦細(xì)胞等代謝,以及兒童生長(zhǎng)和智力發(fā)育[12]。但是,基于食品添加劑影響有害物質(zhì)形成而被限制使用的例子在國(guó)內(nèi)還不多見(jiàn)。但歐洲要求更為嚴(yán)格,如歐洲食品安全局經(jīng)過(guò)10多年的評(píng)估,2017年出臺(tái)了食品中丙烯酰胺控制法規(guī)(Commission Regulation (EU) 2017/2158),要求食品企業(yè)減少碳酸氫銨等膨松劑用量或采用其替代品[13]。
5-羥甲基糠醛(HMF)是熱加工食品中含量較高的一種內(nèi)源有害物,廣泛存在于焙烤食品、干果和焦糖制品中[1,14]。高劑量的HMF對(duì)人體橫紋肌、內(nèi)臟、基因和神經(jīng)等具有毒副作用,對(duì)皮膚、眼睛、上呼吸道及粘膜具有刺激和損傷作用,并通過(guò)醛基與人體蛋白(DNA)的氨基或巰基反應(yīng),影響細(xì)胞功能和生長(zhǎng),影響正常代謝[15,16]。但低劑量的HMF卻具有抗氧化、抗腫瘤細(xì)胞增殖、改善血液流變學(xué)、抗心肌缺血、調(diào)節(jié)Ca2+平衡、抗酪氨酸酶等生物活性[15]。10年前Monien等發(fā)現(xiàn),磺基轉(zhuǎn)移酶可將HMF轉(zhuǎn)化為具有致癌活性和基因毒性的5-亞磺酰甲基糠醛[17],該酶廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)。因此,攝入高劑量的HMF可能導(dǎo)致人體產(chǎn)生各種癌變,如肝癌、結(jié)腸癌等[18]。2015年歐洲食品安全局正式確認(rèn)了5-亞磺酰甲基糠醛的致癌活性[19]。因此,近年來(lái),食品中HMF的安全性問(wèn)題成為國(guó)際研究熱點(diǎn)。
焙烤、油炸、膨化等高溫加工食品因其食用量大,HMF含量高而成為人體HMF的重要來(lái)源。目前人們對(duì)HMF的形成途徑已基本清楚,主要來(lái)自己糖脫水,或丙酮醛和甘油醛通過(guò)羥醛縮合反應(yīng)后產(chǎn)生HMF[20]。其形成受糖類、加工溫度、pH、水分活度、二價(jià)或三價(jià)陽(yáng)離子以及酚類物質(zhì)等的影響[20],但有關(guān)食品?化劑等添加物的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。
碳酸氫銨、碳酸氫鈉是焙烤、膨化食品中常用的膨松劑;食鹽可使面筋質(zhì)地變細(xì)密,增強(qiáng)面筋的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),易于擴(kuò)展延伸,并作為咸味劑而廣泛添加到面團(tuán)中[21]。因此,本研究以焙烤、膨化食品的主要內(nèi)源化學(xué)污染物HMF為對(duì)象,采用形成HMF的不同前體物質(zhì)(葡萄糖、果糖和蔗糖)構(gòu)建模擬反應(yīng)體系,考察膨松劑碳酸氫銨和碳酸氫鈉、食鹽對(duì)HMF形成的影響,并以餅干為代表在食品中進(jìn)行驗(yàn)證。硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨過(guò)去一直作為膨松劑允許在小麥粉及其制品、蝦味片、焙烤食品、膨化食品等(GB2760-2011)或焙烤食品、油炸面制品、面糊、蝦味片等(GB2760-2014)食品中使用[22,23],但國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委等5部門(mén)聯(lián)合印發(fā)的《關(guān)于調(diào)整含鋁食品添加劑使用規(guī)定的公告》(2014年第8號(hào))已禁止其在小麥粉及其制品(除油炸面制品、面糊、裹粉、煎炸粉外)中使用。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)這兩種含鋁膨松劑的負(fù)面效果,為國(guó)家的規(guī)定提供更多依據(jù),本研究一并將其納入進(jìn)行研究。
低筋面粉(五得利面粉集團(tuán)有限公司)、起酥油,購(gòu)于廣州市暨南大學(xué)興安超市;葡萄糖、果糖、蔗糖、甘氨酸、食鹽、碳酸氫鈉、碳酸氫銨、硫酸鋁鉀、硫酸鋁銨,分析純,百靈威科技有限公司;羥甲基糠醛(HMF),99%純度,百靈威科技有限公司;甲醇,色譜純,Mallinckrodt Baker公司;不銹鋼試管(25.00 mL)為實(shí)驗(yàn)室定制品。
LC-20AT高效液相色譜儀(配備SPD-M20A光電二極管陣列檢測(cè)器),日本島津有限公司;磁力加熱攪拌器(DF-Ⅱ型集熱式),江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;離心機(jī)(KDC-12),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。
1.2.1 5種添加物對(duì)不同前體物質(zhì)形成HMF的影響
按照Z(yǔ)hang等的方法設(shè)置4個(gè)模擬反應(yīng)體系[24]:葡萄糖/甘氨酸(美拉德反應(yīng)體系)、葡萄糖、果糖、蔗糖(各成分濃度均為1.00 mM),研究不同濃度的碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽(2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/mL),以及硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL)對(duì)HMF形成的影響。將總體積為5.00 mL的反應(yīng)混合物置于不銹鋼試管中,在160 ℃油浴中反應(yīng)15 min,冰水浴冷卻后用去離子水定容至10.00 mL,經(jīng)0.45 μm水相微孔濾膜過(guò)濾,采用HPLC法測(cè)定HMF含量[25]。
HPLC色譜條件:色譜柱為ZORBAX SB-Aq(4.60×250.00 mm, 5.00 μm),流動(dòng)相為甲醇-水(5:95,V/V),0.60 mL/min流速等度洗脫40 min,檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量10.00 μL。并以去離子水配制6.25~100.00 mg/L的HMF系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,外標(biāo)法定量。
1.2.2 五種添加物對(duì)餅干中HMF形成的影響
餅干制作:參考Van Der Fels-Klerx等[26]的方法制作餅干。面團(tuán)配方:小麥面粉80.00 g,精煉棕櫚油20.00 g,蔗糖35.00 g,水17.60 g。碳酸氫鈉、碳酸氫銨、食鹽、硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨的添加量見(jiàn)表1。首先在不銹鋼盆中將蔗糖和添加物用水分別溶解,再與起酥油充分混合,加入面粉和剩余水制成面團(tuán),用壓面機(jī)壓面5次后,切成3.00 cm×5.00 cm×0.30 cm形狀面餅片,190 ℃烘烤10 min后,將餅干取出置于干燥器中冷卻。根據(jù)Zou等的方法[27]提取餅干中的HMF。取5.00 g餅干粉末,用20.00 mL 80%甲醇水溶液連續(xù)超聲強(qiáng)化提取。每次提取30 min,樣品液在3000.00 g下離心20 min,收集上清液;對(duì)沉淀進(jìn)行第二次提取,重復(fù)三次后,合并上清液。在60 ℃下減壓濃縮,除去水和甲醇,得殘留物;加入2.00 mL蒸餾水溶解殘留物,用0.45 μm濾膜過(guò)濾,按1.2.1中的方法,采用HPLC法檢測(cè)HMF含量。
表1 餅干配方Table 1 Biscuit formulations
1.2.3 餅干水提液pH的測(cè)定
按Huang等[28]的方法獲得餅干水提液。稱取1.00 g餅干粉末于離心管中,加入5.00 mL水,超聲提取20 min,3000.00 g離心20 min,取上清液,再加2.00 mL水重復(fù)提取2次,合并上清液,用pH計(jì)測(cè)定提取液樣品的pH。
以上各項(xiàng)測(cè)試均重復(fù)3次,采用SPSS 17.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SD表示。在5.00%水平下,采用Duncan多重比較分析處理間顯著性差異。
由圖1可知,在美拉德和果糖反應(yīng)體系中,碳酸氫鈉顯著抑制HMF形成,添加量為2.00 mg/mL時(shí),體系中的的HMF的生成量分別為5.01、3.02 mg/L,與對(duì)照組相比分別下降3.06和8.68倍;隨著添加量的增大,HMF生成量進(jìn)一步降低。其原因可能是由于碳酸氫鈉的水解,提高了體系的pH,不利于美拉德反應(yīng)中間體薛夫堿的形成和3-脫氧奧蘇糖脫水轉(zhuǎn)化為HMF[29]。同時(shí),碳酸氫鈉的鈉離子可能和鉀離子相似,抑制HMF形成[21]。對(duì)于果糖體系,呋喃果糖陽(yáng)離子是產(chǎn)生HMF的關(guān)鍵步驟,酸性條件下有利于其形成,而堿性的碳酸氫鈉則抑制了呋喃果糖陽(yáng)離子的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致HMF含量下降。
在葡萄糖體系中,隨著碳酸氫鈉添加量的增加,HMF的生成量增加。碳酸氫鈉添加量為6.00 mg/mL時(shí)HMF達(dá)到最高值17.23 mg/L,為對(duì)照(無(wú)添加物)的3.31倍。進(jìn)一步增加碳酸氫鈉添加量,HMF含量開(kāi)始下降。當(dāng)碳酸氫鈉添加量為10.00 mg/mL時(shí),HMF形成量與對(duì)照相當(dāng)(圖1)。其原因可能是在弱堿性環(huán)境下,有利于葡萄糖異構(gòu)化為果糖,而果糖形成HMF的能力顯著高于葡萄糖[21]。如前所述,如果碳酸氫鈉添加過(guò)量,則使pH增高,從而抑制呋喃果糖陽(yáng)離子的形成和3-脫氧奧蘇糖的脫水,導(dǎo)致HMF形成下降。而蔗糖的水解需要在酸性條件下才能進(jìn)行,堿性的碳酸氫鈉不能促進(jìn)蔗糖水解為果糖和葡萄糖,因而碳酸氫鈉對(duì)蔗糖形成HMF無(wú)影響(圖1)。
圖1 碳酸氫鈉對(duì)4個(gè)模擬反應(yīng)體系中HMF形成的影響Fig.1 Effects of sodium bicarbonate on HMF formation in four model reaction systems
與無(wú)添加物的對(duì)照組相比,碳酸氫銨降低所有模擬反應(yīng)體系中HMF含量(圖2)。當(dāng)添加量為2.00 mg/mL時(shí),碳酸氫銨在美拉德、葡萄糖和果糖反應(yīng)體系中都顯著抑制HMF形成,HMF含量分別3.30、1.61和17.52 mg/L,下降4.64、3.28和1.49倍。碳酸氫銨對(duì)果糖體系中HMF的抑制效果呈劑量效應(yīng)。但在美拉德和葡萄糖反應(yīng)體系中,添加量為4.00~6.00 mg/mL時(shí),碳酸氫銨會(huì)略微促進(jìn)HMF形成(與2.00 mg/mL的添加量相比),而后含量下降。蔗糖體系中形成的HMF量很低,碳酸氫銨抑制其形成(圖2)。碳酸氫銨水解后呈弱堿性,有利于葡萄糖烯醇化進(jìn)而轉(zhuǎn)化為果糖,促進(jìn)HMF形成;但是,NH4+對(duì)HMF形成的抑制效果[29]可能發(fā)揮了主要作用,從而導(dǎo)致美拉德反應(yīng)、葡萄糖和果糖模擬反應(yīng)體系中的HMF含量下降。
圖2 碳酸氫氨對(duì)4個(gè)模擬反應(yīng)體系中HMF形成的影響Fig.2 Effects of ammonium bicarbonate on HMF formation in four model reaction systems
由圖3可知,在美拉德、葡萄糖與果糖反應(yīng)體系中,食鹽的添加均抑制HMF的生成,且呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)添加量為4.0 mg/mL時(shí),HMF生成量分別為7.21、1.52和9.03 mg/L,分別比對(duì)照組下降52.88%、70.77%和65.40%。在蔗糖體系中,其pH值趨于中性,酸水解難以發(fā)生,因此該體系中HMF的生成量是四個(gè)體系中最低的(圖3)。以上結(jié)果表明,食鹽在焙烤食品中除改善口感和面團(tuán)結(jié)構(gòu)外,還具有抑制HMF形成的作用。
圖3 食鹽對(duì)4個(gè)模擬反應(yīng)體系中HMF形成的影響Fig.3 Effects of table salt on HMF formation in four model reaction systems
由圖4可知,硫酸鋁鉀在4個(gè)模擬反應(yīng)體系中均顯著促進(jìn)HMF形成。在蔗糖模擬體系中,硫酸鋁鉀的促進(jìn)效果最明顯,且呈劑量效應(yīng);當(dāng)添加量達(dá)到1.00 mg/mL時(shí),HMF形成量為348.30 mg/L,是對(duì)照組的696.60倍。在其它3個(gè)反應(yīng)體系中(美拉德、葡萄糖和果糖反應(yīng)體系),HMF形成量在硫酸鋁鉀添加量為0.60 mg/mL時(shí)達(dá)到峰值,分別為80.52、13.00和265.03 mg/L,是對(duì)照組的5.26、2.50和10.15倍。硫酸鋁銨也顯著促進(jìn)HMF的形成,且對(duì)蔗糖形成HMF的促進(jìn)效應(yīng)最強(qiáng)。當(dāng)添加量為1.00 mg/mL時(shí),HMF形成量是161.41 mg/L,是對(duì)照組的322.82倍。在其它3個(gè)反應(yīng)體系中(美拉德、葡萄糖和果糖反應(yīng)體系),HMF在硫酸鋁銨添加量為0.60 mg/mL時(shí)達(dá)到峰值,分別為50.92、9.94和139.31 mg/L,是對(duì)照組的3.33、1.91和5.34倍。
圖4 硫酸鋁鉀(a)和硫酸鋁銨(b)對(duì)4個(gè)模擬反應(yīng)體系中HMF形成的影響Fig.3 Effects of potassium aluminium sulphate (top) and ammonium aluminium sulphate on HMF formation in four model reaction systems
與碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽處理組比較,硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨大幅增加HMF生成量。在最低劑量組(2.00/0.20 mg/mL),硫酸鋁鉀處理組的HMF含量分別是碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽的4.22、6.39、2.05倍(美拉德反應(yīng)體系),1.24、4.19、1.31倍(葡萄糖反應(yīng)體系),29.00、4.97、8.13倍(果糖反應(yīng)體系),300.60、250.50、250.50倍(蔗糖反應(yīng)體系)。在最高劑量組(10.00/1.00 mg/mL),硫酸鋁鉀處理組的HMF含量分別是碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽處理組的46.55、11.64、14.22倍(美拉德反應(yīng)體系),2.21、3.88、2.58倍(葡萄糖反應(yīng)體系),64.28、48.70、27.71倍(果糖反應(yīng)體系),696.60、1161.00、248.79倍(蔗糖反應(yīng)體系)。在最低劑量組,硫酸鋁銨處理組的HMF含量分別是碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽處理組的3.34、5.06、1.62倍(美拉德反應(yīng)體系),1.00、3.38、1.06倍(葡萄糖反應(yīng)體系),14.47、2.48、4.06倍(果糖反應(yīng)體系),90.00、75.00、75.00倍(蔗糖反應(yīng)體系)。在最高劑量組,硫酸鋁銨處理組的HMF量分別是碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽處理組的22.18、5.55、6.78倍(美拉德反應(yīng)體系),1.50、2.63、1.75倍(葡萄糖反應(yīng)體系),38.96、29.52、16.79倍(果糖反應(yīng)體系),322.80、538.00、115.29倍(蔗糖反應(yīng)體系)。
硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨對(duì)HMF的促進(jìn)機(jī)理可能源于兩方面。一是它們都為強(qiáng)酸弱堿鹽,水解后pH降低,而較低pH有利于HMF的形成且促進(jìn)蔗糖在高溫下水解[20]。二是Al3+的催化效果。由于三價(jià)陽(yáng)離子鋁比二價(jià)陽(yáng)離子鈣、鎂對(duì)HMF的催化效率更高[20],因此Al3+的催化可能發(fā)揮更重要的作用。硫酸鋁銨對(duì)HMF形成的促進(jìn)效應(yīng)小于硫酸鋁鉀,主要原因可能是NH4+對(duì)HMF形成的抑制作用[30]。
圖5 的結(jié)果表明,與無(wú)添加物的對(duì)照相比,食鹽、碳酸氫銨和碳酸氫鈉處理組的HMF含量都降低。其中,1.00g食鹽+0.40 g碳酸氫銨與1.00 g食鹽+0.80 g碳酸氫銨+0.80 g碳酸氫鈉的處理降低最多,其含量分別為0.88和0.86 mg/kg,分別下降35.34%和33.83%。在硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨處理組中,盡管添加了對(duì)HMF具有抑制效果的食鹽、碳酸氫銨和碳酸氫鈉,HMF含量還是大幅升高。當(dāng)硫酸鋁鉀添加量為0.05 g和0.10 g時(shí),HMF含量分別2.11和2.16 mg/kg,增加58.65%和62.41%。在低添加劑量下(0.05 g),硫酸鋁銨僅略微增加HMF含量,但高劑量(0.10 g)下HMF含量增加了55.64%。因此,從HMF形成角度看,限制含鋁膨松劑在食品中的使用非常合理。添加0.10 g硫酸鋁鉀與硫酸鋁銨后,餅干水提液的pH從9.60下降至6.50左右,pH的降低促進(jìn)了己糖直接脫水形成HMF[20]。不過(guò),鋁鹽中三價(jià)鋁離子的催化效應(yīng)可能是鋁鹽促進(jìn)HMF形成的主要原因。研究表明,樣品中的HMF 含量與配方有著重要的關(guān)系,由于不同的膨松劑的使用,使食品體系的pH值有著明顯的差異,從而影響HMF 的含量。Kukurova′證實(shí),若用碳酸氫銨(1.00 g/80.00 g面粉)作為膨松劑制作曲奇時(shí),體系的pH值約在7.82,其HMF含量在焙烤過(guò)程中出現(xiàn)明顯上升;若只采用碳酸氫鈉(2.00 g/80.00 g面粉)作為膨松劑時(shí),可使食品中HMF的含量從2.96 mg/kg降至1.30 mg/kg,降低了56.08%;主要是因?yàn)樘妓釟溻c可使體系的pH控制在8.10~10.00,從而抑制蔗糖形成呋喃果糖陽(yáng)離子和3-脫氧奧蘇糖[31];但碳酸氫鈉添加過(guò)多會(huì)使制品中堿味較大[32]。
圖5 五種添加物對(duì)餅干中HMF形成的影響Fig.5 Effect of five additives on HMF formation in biscuits
探討添加物對(duì)食品有害物形成的影響是目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn),焙烤食品的添加物食鹽和膨松劑碳酸氫鈉、碳酸氫銨在模擬反應(yīng)體系中能顯著降低HMF含量,當(dāng)碳酸氫鈉添加量為2.00 mg/mL時(shí),美拉德(葡萄糖/甘氨酸)和果糖反應(yīng)體系中HMF的生成量分別為5.01、3.02 mg/L,較對(duì)照組下降3.06和8.68倍;加入相同量的碳酸氫銨時(shí),美拉德、葡萄糖和果糖反應(yīng)體系中HMF含量分別為3.30、1.61和17.52 mg/L,分別比對(duì)照組下降4.64、3.28和1.49倍;當(dāng)食鹽添加量為4.00 mg/mL時(shí),HMF生成量分別為7.21、1.52和9.03 mg/L,降幅達(dá)52.88%、70.77%和65.40%。而被禁用的膨松劑硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨,則顯著增加HMF含量,最高可達(dá)310.13和139.31 mg/L,增幅達(dá)620.26和197.00倍。該結(jié)果在餅干中得到驗(yàn)證:添加食鹽、碳酸氫鈉和碳酸氫銨降低餅干中HMF含量,濃度在0.86~0.88 mg/kg之間,降幅為33.83%~35.34%。但是,即使在添加了食鹽、碳酸氫鈉和碳酸氫銨的情況下,硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨仍使餅干中HMF含量為2.11和2.16 mg/kg,增幅為58.65%和62.41%。由于HMF在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)5-亞磺酰甲基糠醛,而焙烤、油炸食品食用量大,HMF含量高而成為人體HMF的重要來(lái)源,本研究結(jié)果進(jìn)一步支持了國(guó)家限制含鋁膨松劑使用的合法性。