鄧莎，董怡，任堯，鄧銳杰，何強(qiáng)

（四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610065）

重金屬具有毒性大、危害性持久及生物富集性強(qiáng)等特點(diǎn)，是土壤和水體的主要污染物[1,2]，并可以通過(guò)轉(zhuǎn)移到農(nóng)作物、牲畜和魚(yú)等食用動(dòng)植物體內(nèi)以及水源而轉(zhuǎn)移到食品中，成為食品安全領(lǐng)域的一大嚴(yán)重問(wèn)題。其中，鉛離子（Pb2+）、汞離子（Hg2+）和鎘離子（Cd2+）是三種廣泛存在的金屬污染物，其攝入會(huì)極大地危害人體健康，導(dǎo)致貧血、肌肉麻痹、腦神經(jīng)永久性損傷等健康問(wèn)題[3-5]。近年來(lái)，頻發(fā)的“血鉛”、“鎘米”等重金屬污染事件，造成了惡劣的社會(huì)影響。為防止攝入重金屬，痕量重金屬離子分析檢測(cè)技術(shù)的建立顯得尤為重要。傳統(tǒng)的重金屬分析方法包括原子吸收/發(fā)射光譜法[6]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[7,8]等，盡管它們具有高準(zhǔn)確性和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，但其樣品前處理過(guò)程復(fù)雜、儀器昂貴、運(yùn)行成本較高，難以實(shí)現(xiàn)食品樣品的臨場(chǎng)檢測(cè)[9]。因此，目前亟需開(kāi)發(fā)快速、可現(xiàn)場(chǎng)操作和可推廣的食品重金屬污染檢測(cè)方法。

近年來(lái)，以功能核酸為基礎(chǔ)的生物傳感及分析技術(shù)引起廣泛關(guān)注，在重金屬檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力[10,11]。功能核酸是一類通過(guò)篩選獲取的具備識(shí)別或者催化功能的核酸分子，主要包含核酸適配體、核酶及二者的復(fù)合物。核酸適配體是一類通過(guò)指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)篩選出的能高特異性結(jié)合靶分子的DNA或RNA分子[12]；核酶是通過(guò)SELEX技術(shù)篩選出的具有催化活性和結(jié)構(gòu)識(shí)別能力的DNA或RNA片段[13]。由于功能核酸分子對(duì)目標(biāo)分子具有高度的選擇性，以及其結(jié)構(gòu)的可預(yù)測(cè)性與可設(shè)計(jì)性，目前被廣泛用于包括真菌毒素和抗生素等食品污染物的檢測(cè)[14]，特別在重金屬分析領(lǐng)域得到了較廣泛應(yīng)用。例如，Pb2+特異性核酶能夠特異性地催化以Pb2+為輔因子的底物RNA裂解，比其它競(jìng)爭(zhēng)金屬離子的催化活性高40萬(wàn)倍[15]，可用于鉛污染檢測(cè)。功能核酸對(duì)其靶標(biāo)金屬離子具有極高的親和力，可被用于構(gòu)建靶標(biāo)金屬離子觸發(fā)的結(jié)構(gòu)響應(yīng)核酸探針，同時(shí)，可對(duì)核酸探針進(jìn)行化學(xué)修飾和標(biāo)記，通過(guò)結(jié)構(gòu)響應(yīng)輸出檢測(cè)信號(hào)，檢測(cè)多種金屬離子，包括Hg2+[16]、Pb2+[15]、Cd2+[17]、Mg2+[18]、Zn2+[19]和Cu2+[20]等。此外，由于核酸探針具備高的識(shí)別特異性，有望在復(fù)雜的食品樣品中實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)金屬離子的精準(zhǔn)識(shí)別和檢測(cè)。本文綜述了功能核酸用于重金屬（鉛、汞和鎘）污染檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，介紹了由功能核酸構(gòu)建的熒光傳感器和比色傳感器，及功能核酸與納米粒子復(fù)合構(gòu)建的檢測(cè)傳感器，突出了功能核酸與微流控技術(shù)、與便攜檢測(cè)設(shè)備整合的檢測(cè)平臺(tái)，為臨場(chǎng)的食品重金屬污染分析提供重要思路。

1 基于核酸探針的食品重金屬污染檢測(cè)

1.1 鉛污染

基于功能核酸的熒光傳感器具有靈敏度高、檢測(cè)快速的優(yōu)勢(shì)，在食品重金屬污染檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。Li等[21]分別在底物鏈5’端和核酶鏈3’端修飾熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，開(kāi)發(fā)了一種用于Pb2+檢測(cè)的熒光響應(yīng)探針。當(dāng)?shù)孜镦満汀?-17”脫氧核酶鏈雜交，由于熒光能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光基團(tuán)熒光信號(hào)淬滅。當(dāng)體系中加入Pb2+后，核酶鏈被激活，將底物鏈切割成兩個(gè)片段，降低底物鏈和核酶鏈的雜交穩(wěn)定性，導(dǎo)致底物鏈脫離核酶鏈，進(jìn)而恢復(fù)熒光信號(hào)。該熒光傳感器的動(dòng)態(tài)范圍為10 nM～4 μM，并在4 ℃下具備良好的選擇性。然而，該核酸探針存在較高的背景熒光信號(hào)，為降低背景信號(hào)，對(duì)底物鏈進(jìn)行了雙重修飾，分別在其5’端和3’端修飾熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，從而使背景熒光得到了顯著抑制[22]。為進(jìn)一步消除熒光背景，核酶底物鏈被設(shè)計(jì)成分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)。分子信標(biāo)是一類具有環(huán)狀區(qū)和莖干區(qū)的寡核苷酸鏈，無(wú)靶分子存在時(shí)，分子信標(biāo)兩端的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)相互靠近，發(fā)生猝滅。通過(guò)設(shè)計(jì)酶鏈結(jié)構(gòu)，使酶鏈與分子信標(biāo)的環(huán)狀區(qū)雜交，在Pb2+存在，核酶切割分子信標(biāo)的環(huán)截面，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分離并增強(qiáng)熒光型號(hào)，在過(guò)量的分子信標(biāo)存在下，核酶可多次催化分子信標(biāo)裂解，獲得放大的熒光信號(hào)（如圖1所示），該熒光傳感器對(duì)Pb2+的檢測(cè)限可達(dá)0.6 nM[23]，并應(yīng)用于自來(lái)水中鉛污染分析。

圖1 GR-5核酶-分子信標(biāo)探針用于Pb2+檢測(cè)[23]Fig.1 The mechanism of molecular beacon in Pb2+ detection[23]

納米材料由于獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)和磁學(xué)等性能，可作為優(yōu)異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件，廣泛應(yīng)用于新型傳感器的構(gòu)建。由于金納米顆粒（AuNPs）的高熒光淬滅能力，Kim等開(kāi)發(fā)了一種基于脫氧核酶和AuNPs的Pb2+檢測(cè)熒光傳感器[24]，底物鏈通過(guò)硫醇鍵固定于AuNPs表面。當(dāng)無(wú)Pb2+存在時(shí)，底物鏈與核酶鏈雜交吸附在AuNPs表面，熒光猝滅。加入Pb2+后，核酶鏈切割底物鏈導(dǎo)致其斷裂，使熒光基團(tuán)與AuNPs分離，顯示出增強(qiáng)的熒光信號(hào)，該法檢測(cè)限低至5 nM。利用單鏈DNA、雙鏈DNA與氧化石墨烯不同的相互作用，F(xiàn)an等構(gòu)建了氧化石墨烯（GO）與核酶復(fù)合的探針，其機(jī)理是修飾了熒光基團(tuán)的底物鏈與核酶鏈雜交形成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，其與GO相互作用弱，游離在溶液中，呈現(xiàn)強(qiáng)熒光信號(hào)；當(dāng)體系中添加Pb2+觸發(fā)核酶活性后，底物鏈被切割成兩段，吸附到GO表面上，熒光顯著猝滅。該氧化石墨烯（GO）/核酶復(fù)合探針的檢測(cè)限低至0.5 nM[25]。

除上述核酶外，G-四鏈體也被應(yīng)用于重金屬鉛離子污染的檢測(cè)中。Pb2+可穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)，利用Pb2+引發(fā)的G-四鏈體成型可構(gòu)建Pb2+的快速傳感分析。Xu等設(shè)計(jì)了一個(gè)雙鏈核酸探針，其中一條鏈為G-四鏈體，在無(wú)Pb2+時(shí)，兩條互補(bǔ)鏈雜交形成DNA雙鏈，添加Pb2+后，其中一條鏈與Pb2+結(jié)合形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步與鋅原卟啉相互作用，得到增強(qiáng)的熒光信號(hào)[26]。為輸出響應(yīng)信號(hào)，選用染料AMT作為熒光指示劑，該指示劑可與G-四鏈體形成絡(luò)合物，導(dǎo)致熒光猝滅，加入Pb2+后，由于親和力差異，導(dǎo)致指示劑被Pb2+置換出，顯示出增強(qiáng)的熒光信號(hào)[27]（如圖2所示），該分析方法的檢測(cè)限低至3.6 nM。

圖2 利用AMT染料與G-四鏈體結(jié)合誘導(dǎo)猝滅的熒光Pb2+生物傳感器示意圖[27]Fig.2 Schematic representation of the proposed fluorescent Pb2+biosensor utilizing the binding-induced quenching of AMT to G-quadruplex[27]

此外，比色分析法作為一種簡(jiǎn)單、低成本且易于肉眼觀察的檢測(cè)法，在一定程度上可避免對(duì)檢測(cè)設(shè)備的依賴。由于AuNPs具有高的消光系數(shù)和特殊的光學(xué)特性，常被用于比色分析[28]。Lu等使用核酶及其底物鏈與附著在AuNPs的DNA雜交，使AuNPs聚集成藍(lán)色納米顆粒組裝體，當(dāng)Pb2+存在時(shí)，底物鏈被核酶鏈切割，阻止AuNPs聚集，顏色從藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色[29]，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+的可視化檢測(cè)。這種底物鏈以“頭尾”方式與DNA雜交，涉及退火過(guò)程。為了簡(jiǎn)化操作流程，該課題組引入了“尾尾”雜交設(shè)計(jì)的思路[30]。此外，利用鹽誘導(dǎo)AuNPs聚集變色，構(gòu)建一種不依賴AuNPs修飾的方法[31,32]。GR-5及“8-17”脫氧核酶均可在Pb2+的協(xié)同作用下使底物鏈裂解，改變AuNPs的聚集狀態(tài)，導(dǎo)致體系顏色變化[33-35]。這種無(wú)標(biāo)記的策略保持高靈敏度和良好的選擇性，有助于臨場(chǎng)鉛污染可視化檢測(cè)分析。

1.2 汞污染

目前已構(gòu)建了一系列的Hg2+響應(yīng)型核酸探針，用于汞污染的檢測(cè)分析。Hg2+能特異性地連接兩個(gè)胸腺嘧啶堿基（T），在DNA雙鏈中形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T錯(cuò)配結(jié)構(gòu)[36,37]，這種錯(cuò)配堿基能穩(wěn)定DNA雙鏈，并且T-T堿基對(duì)只能由Hg2+穩(wěn)定，確保了其對(duì)Hg2+良好的選擇性。Ono和Togashi通過(guò)在富含T的寡核苷酸鏈兩端修飾熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，開(kāi)發(fā)了一種用于Hg2+檢測(cè)的熒光傳感器[38]。在添加Hg2+后，T-Hg2+-T錯(cuò)配使寡核苷酸鏈折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光猝滅。然而，這種“turn-off”熒光信號(hào)的模式，可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，為克服該問(wèn)題，提出了一種基于“turn-on”信號(hào)的熒光傳感器（如圖3所示），即在無(wú)Hg2+時(shí)，熒光標(biāo)記鏈與猝滅標(biāo)記鏈雜交使熒光猝滅；Hg2+存在時(shí)，T-Hg2+-T錯(cuò)配結(jié)構(gòu)導(dǎo)致非互補(bǔ)片段折疊成發(fā)夾狀，并從熒光基團(tuán)標(biāo)記的鏈釋放出猝滅基團(tuán)標(biāo)記鏈，從而增強(qiáng)熒光信號(hào)[39]?；诜肿有艠?biāo)的傳感器也被用于Hg2+分析，Hg2+可使分子信標(biāo)打開(kāi)，導(dǎo)致熒光團(tuán)與猝滅劑遠(yuǎn)離并恢復(fù)熒光信號(hào)[40]。

圖3 基于鏈置換核酸探針的Hg2+熒光傳感器[39]Fig.3 Schematic of the “turn-on” fluorescent mercury sensor[39]

上述熒光傳感器通常需采用熒光基團(tuán)或猝滅劑對(duì)核酸進(jìn)行化學(xué)修飾。為避免核酸探針的化學(xué)修飾，引入了特異性核酸染料[41]。Yu等開(kāi)發(fā)出一種基于靶向誘導(dǎo)的G-四鏈體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的無(wú)標(biāo)記Hg2+檢測(cè)傳感器[42]。在無(wú)Hg2+時(shí)，DNA探針在硫黃素T的輔助下折疊成G-四鏈體，并觀察到高熒光信號(hào)。加入Hg2+后，G-四鏈體被Hg2+介導(dǎo)的T-T錯(cuò)配分解，導(dǎo)致熒光變?nèi)酢４送?，利用AuNPs的熒光淬滅及與核酸探針的相互作用，構(gòu)建了Hg2+熒光傳感器[43]。為進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，復(fù)合納米粒子如量子點(diǎn)與AuNPs被用于構(gòu)建“turn-off”信號(hào)的熒光傳感器[44]，可檢測(cè)水中低至6 nM水平的汞污染。

與Pb2+比色傳感器類似，比色分析法在Hg2+檢測(cè)中廣泛使用。Lee等人報(bào)道了一種利用AuNPs顯色的比色傳感器[45]（如圖4）。AuNPs分別被兩種具有T-T錯(cuò)配的單鏈DNA修飾，Hg2+的加入可促成T-Hg2+-T錯(cuò)配，從而導(dǎo)致分散的AuNPs發(fā)生聚集，顏色發(fā)生變化。通過(guò)監(jiān)測(cè)溶液顏色的變化可測(cè)定Hg2+的濃度，該傳感器的檢測(cè)限為0.1 μM。但該方法對(duì)溫度控制精度要求比較高，隨后，通過(guò)引入適當(dāng)?shù)墓押塑账徭溡约翱刂芓-T錯(cuò)配的數(shù)量，使得該傳感器在室溫下實(shí)現(xiàn)可靠的檢測(cè)[46]。同時(shí)，多種無(wú)標(biāo)記比色傳感器也被用于Hg2+檢測(cè)，Willner報(bào)道[47]，富含T的單鏈DNA在無(wú)Hg2+時(shí)保持單鏈狀態(tài)，吸附在AuNPs的表面，靜電排斥使AuNPs處于穩(wěn)定分散狀態(tài)，當(dāng)加入Hg2+后，T-Hg2+-T形成誘導(dǎo)單鏈DNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從AuNPs表面脫去，導(dǎo)致AuNPs聚集，顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，其檢測(cè)限可達(dá)10 nM。

圖4 核酸探針功能化的AuNPs用于比色檢測(cè)Hg2+[45]Fig.4 Colorimetric detection of mercuric ion (Hg2+) using DNA-AuNPs[45]

1.3 鎘污染

Cd2+特異性核酶被廣泛應(yīng)用于Cd2+的檢測(cè)[48]，但基于核酶的Cd2+檢測(cè)傳感平臺(tái)可能存在一些缺點(diǎn)，由于DNA中功能基團(tuán)的限制，很難將Cd2+這樣的親硫金屬離子作為精準(zhǔn)靶點(diǎn)，選擇性較差。Liu等使用單一的硫代磷酸酯去修飾DNA以增強(qiáng)其對(duì)Cd2+的親和力，該方法采用商業(yè)化堿基，不會(huì)使篩選過(guò)程復(fù)雜化，且對(duì)Cd2+具有高度的選擇性。基于該核酶的傳感器在緩沖液中的檢測(cè)限為1.1 nM，在大米提取物中的檢測(cè)限為1.6 nM[49]。Pei等采用靶向誘導(dǎo)釋放鏈的方式構(gòu)建了一種快速、特異性強(qiáng)的Cd2+檢測(cè)發(fā)光生物傳感器，在無(wú)Cd2+的情況下，兩條標(biāo)記鏈形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，熒光猝滅，加入Cd2+后，熒光修飾鏈折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，不再與另一條帶猝滅基團(tuán)的鏈結(jié)合，依舊顯示熒光信號(hào)[50]。為避免熒光基團(tuán)、猝滅劑雙重標(biāo)記，Wang等報(bào)道了一種由Cd2+特異性適體構(gòu)成的單標(biāo)記多功能探針，Cd2+特異性適體能同時(shí)識(shí)別Cd2+并作為信號(hào)子。Cd2+可引起適體的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，從一個(gè)隨機(jī)的線性序列轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光強(qiáng)度發(fā)生變化，從而建立測(cè)定Cd2+的熒光分析方法，該方法的檢測(cè)限為2.15 nM[51]。

無(wú)標(biāo)記Cd2+檢測(cè)策略可以免除核酸探針的化學(xué)修飾，降低檢測(cè)成本提高檢測(cè)穩(wěn)定性[52-54]，Chen等開(kāi)發(fā)了一種類發(fā)夾結(jié)構(gòu)探針介導(dǎo)的頭尾結(jié)合與分支遷移的無(wú)酶DNA擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，以G-四鏈體為信號(hào)子，檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)限可達(dá)5 pm[55]。同樣，利用G-四鏈體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了一種超靈敏、無(wú)標(biāo)記的Cd2+探針。在無(wú)Cd2+時(shí)，Cd2+特異性適體鏈段處于無(wú)規(guī)狀態(tài)，加入Cd2+后，Gd2+適配體折疊成G-四鏈結(jié)構(gòu)，與血紅素相互作用使體系吸光度增加，檢測(cè)限為0.15 nM。該方法避免了探針的標(biāo)記且采用廉價(jià)的儀器直接定量分析，具有良好的動(dòng)態(tài)范圍[56]。類似地，通過(guò)Cd2+特異性適體誘導(dǎo)核酸適體的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，利用兩種未標(biāo)記的寡核苷酸，以熒光染料 SYBR Green I作為信號(hào)子（如圖5），構(gòu)建了無(wú)標(biāo)記核酸傳感器，其檢測(cè)限為0.34 μg/L，在湘江水，池塘水，自來(lái)水和礦井水檢測(cè)中的回收率在98.57%～102.49%之間。該熒光傳感器具有良好的選擇性，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行處理或靶向預(yù)富集便可檢測(cè)實(shí)際樣品中的Cd2+[57]。此外，納米粒子也被用于Cd2+檢測(cè)，Wang等通過(guò)構(gòu)建特定適體與還原氧化石墨烯（rGO）/石墨氮化碳（g-C3N4）的復(fù)合體系，研制了一種電化學(xué)生物Cd2+傳感器，檢出限低至0.337 nM[58]。Guo等采用基于AuNPs的無(wú)標(biāo)記比色法對(duì)Cd2+進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)計(jì)了一種在高鹽環(huán)境下利用AuNPs和谷胱甘肽（GSH）聯(lián)合檢測(cè)水和大米樣品中Cd污染的簡(jiǎn)單、無(wú)標(biāo)記比色法[59]。

圖5 以熒光染料 SYBR Green I作為信號(hào)分子的Cd2+檢測(cè)生物傳感器[57]Fig.5 The design principle for the Cd2+ determination with SYBR green I[57]

2 基于核酸探針的食品重金屬污染檢測(cè)

2.1 微流體芯片檢測(cè)

由于高通量、快速、易于操作及良好的可靠性，基于功能核酸的微流體芯片在重金屬離子檢測(cè)方面引起越來(lái)越多的關(guān)注[60-62]。Shaikh等通過(guò)Pb2+特異性核酶構(gòu)建了一種模塊化結(jié)構(gòu)的微流控芯片系統(tǒng)，該傳感器可以在1 nL的溶液中可檢測(cè)濃度低至500 nM的Pb2+[63]。Lu等介紹了一種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)Pb2+的微流體平臺(tái)，其通過(guò)微流體裝置表面的鏈霉親和素將熒光標(biāo)記的Pb2+特異性核酶固定在壁上，固定化的核酶保留了對(duì)Pb2+的檢測(cè)活性。僅在Pb2+存在時(shí)，核酶才切割其互補(bǔ)底物鏈，同時(shí)熒光標(biāo)記將切割事件轉(zhuǎn)化為與Pb2+濃度成比例的光學(xué)信號(hào)[64]?；赥-Hg2+-T錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，Liu等開(kāi)發(fā)了與微陣列技術(shù)兼容的熒光芯片傳感器，可在“turn-on”或“turn-off”模式下對(duì)Hg2+進(jìn)行無(wú)試劑、一步式的檢測(cè)，“turn-off”模式比“turn-on”模式的靈敏度稍高，檢測(cè)限分別為3.6 nM和8.6 nM，且通過(guò)檢測(cè)飲用水和鮮奶中的加標(biāo)Hg2+，證明了該芯片傳感器在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際檢測(cè)中具有巨大潛力[60]。利用微陣列結(jié)構(gòu)，Ye等通過(guò)將Cu2+/Pb2+依賴的核酶與固定于玻片表面的底物結(jié)合，構(gòu)建了一種多目標(biāo)檢測(cè)的微芯片傳感器。在無(wú)金屬離子的情況下，探針與底物雜交，產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào)；加入相應(yīng)金屬離子后，底物裂解，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度發(fā)生顯著變化，該傳感器可對(duì)整個(gè)微陣列直接成像[65]。Lu等使用“8-17”核酶和AuNPs構(gòu)建了用于檢測(cè)Pb2+的側(cè)向流動(dòng)裝置，檢出限為0.5 μM，且無(wú)需使用任何儀器便可達(dá)到可視化效果[66]。為提高靈敏度，Chen等在微流體芯片檢測(cè)技術(shù)中引入擴(kuò)增策略，Pb2+將底物鏈切割成兩個(gè)片段，釋放出的裂解產(chǎn)物充當(dāng)催化劑以觸發(fā)核酸雜交、分支遷移和置換，從而放大信號(hào)，達(dá)到對(duì)Pb2+的擴(kuò)增檢測(cè)。此策略無(wú)需使用儀器即可目測(cè)低至濃度為10 pM的Pb2+[67]?；谙嗨频乃悸?，一種通過(guò)核酸外切酶輔助信號(hào)放大的帶狀生物傳感器使用AuNPs作為示蹤劑（如圖6），被用于水溶液中的Hg2+可視化檢測(cè)，具有良好的回收率和準(zhǔn)確性[68]。基于紙基的微流控分析設(shè)備具有制備簡(jiǎn)單、所需樣品量少、可潤(rùn)濕性及易于存儲(chǔ)的優(yōu)點(diǎn)[69]。Zhang等報(bào)道了一種紙基微流控的電化學(xué)發(fā)光傳感器，能同時(shí)檢測(cè)Pb2+和Hg2+，首先將DNA鏈沉積到功能化的蠟紙上，通過(guò)Pb2+和Hg2+誘導(dǎo)功能核酸構(gòu)象轉(zhuǎn)變形成G-四鏈體和T-Hg2+-T錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，使Si@CNCs和Ru@AuNPs分別在陰極和陽(yáng)極上顯示出信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)紙工作區(qū)同時(shí)檢測(cè)兩種金屬離子[70]。

圖6 基于外切酶信號(hào)放大的膠體金試紙用于汞離子檢測(cè)[68]Fig.6 Schematic illustration of the strip biosensor for the visual detection of the formed ssDNA product[68]

2.2 基于小型便攜設(shè)備的檢測(cè)平臺(tái)

在食品重金屬離子檢測(cè)中，由于區(qū)域范圍廣、樣品數(shù)量多，迫切需要快速、經(jīng)濟(jì)有效且可進(jìn)行臨場(chǎng)檢測(cè)的便攜式檢測(cè)平臺(tái)。Lu等采用生活中廣泛使用的血糖儀作為檢測(cè)平臺(tái)對(duì)有毒金屬離子（如Pb2+和Uo2+）進(jìn)行檢測(cè)，此傳感器的機(jī)制是將具有特定識(shí)別功能的DNA-轉(zhuǎn)化酶結(jié)合物固定在磁珠上，添加相應(yīng)的金屬離子后，底物被切割釋放出侵入性DNA，與DNA-轉(zhuǎn)化酶偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)磁珠上的DNA，誘導(dǎo)DNA-轉(zhuǎn)化酶結(jié)合物從磁珠上釋放，用磁鐵除去磁珠后，含有結(jié)合物的溶液可以有效地催化蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。由于溶液中轉(zhuǎn)化酶的濃度與樣品中靶標(biāo)的濃度成正比，因此血糖儀的讀數(shù)可用于定量靶標(biāo)濃度[71,72]。Tang等開(kāi)發(fā)了兩種基于血糖儀的便攜式定量傳感器。一種是利用Pb2+特異性核酶封端裝載了葡萄糖的介孔二氧化硅納米顆粒（MSN）（如圖7所示），當(dāng)引入Pb2+后，底物鏈被切割，導(dǎo)致葡萄糖從MSN中釋放，通過(guò)檢測(cè)所得溶液中釋放的葡萄糖分子，可測(cè)定低至1 pM的Pb2+[73]。另一種設(shè)計(jì)是Pb2+特異性核酶固定在鏈霉親和素修飾的微板上，利用單鏈DNA和轉(zhuǎn)化酶標(biāo)記的AuNPs作為信號(hào)轉(zhuǎn)化載體，向微孔板中加Pb2+后，固定核酶的底物鏈被切割，微孔板中新生成的單鏈DNA，可再次與AuNPs上的單鏈DNA雜交，使微孔板攜帶上轉(zhuǎn)化酶，轉(zhuǎn)化酶可將蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，進(jìn)而使用血糖儀讀數(shù)，檢測(cè)Pb2+。該法具有高度重現(xiàn)性和對(duì)目標(biāo)Pb2+的高選擇性，可用于監(jiān)測(cè)加標(biāo)飲用水樣品中的Pb2+[74]。

圖7 基于MSN和便攜式血糖儀的DNA生物傳感器用于Pb2+檢測(cè)的示意圖[73]Fig.7 Schematic illustration of PGM-based Pb2+ sensor and measurement principle based on target-responsive release of glucose from DNAzyme-linked silica nanoparticles with a glucometer readout[73]

Chen等人提出了一種基于智能手機(jī)的比色傳感策略，主要是利用T-Hg2+-T錯(cuò)配和AuNPs聚集狀態(tài)不同所顯示出的顏色不同，為避免使用復(fù)雜的設(shè)備并最大程度地減少數(shù)據(jù)分析和對(duì)傳輸功率的要求，將多個(gè)檢測(cè)結(jié)果集中在基于纖維素的紙張分析設(shè)備上，隨后通過(guò)智能手機(jī)云端進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算、傳輸和存儲(chǔ)（如圖8）。該法所提出的平臺(tái)具有在資源受限的環(huán)境中進(jìn)行靈敏且高通量的現(xiàn)場(chǎng)汞污染監(jiān)測(cè)的能力，對(duì)于Hg2+加標(biāo)的池塘水和河水，檢測(cè)限為50 nM，且可在40 min的轉(zhuǎn)換時(shí)間內(nèi)同時(shí)執(zhí)行多個(gè)測(cè)試[75]。類似的智能手機(jī)比色系統(tǒng)被用于水樣中Cd2+的快速和高通量測(cè)定，Wang等基于適體功能化AuNPs開(kāi)發(fā)出一種智能手機(jī)比色系統(tǒng)可在10 min內(nèi)快速捕獲并分析比色變化，該法具有較高的選擇性和靈敏度，線性范圍為2-20 μg/L，檢出限為1.12 μg/L，實(shí)現(xiàn)Cd2+的定量檢測(cè)，為實(shí)際應(yīng)用中Cd2+的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定提供了參考[76]。此外，基于光盤的分析檢測(cè)平臺(tái)由于對(duì)不同場(chǎng)景的可擴(kuò)展性以及對(duì)數(shù)據(jù)記錄和讀取的強(qiáng)大能力受到關(guān)注。Zhang等將DNA分子信標(biāo)探針固定于數(shù)字視頻光盤上制備了探針陣列，用于定量Hg2+和Pb2+。被固定在光盤上的DNA探針最初呈折疊發(fā)夾狀，Hg2+和Pb2+的存在會(huì)導(dǎo)致發(fā)夾結(jié)構(gòu)的“打開(kāi)”形成穩(wěn)定的G-四鏈體和T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，末端生物素部分的暴露與AuNPs-鏈霉親和素絡(luò)合物結(jié)合，同時(shí)促使銀沉積而增強(qiáng)識(shí)別型號(hào)，最后使用計(jì)算機(jī)驅(qū)動(dòng)讀取可量化的數(shù)字信號(hào)。該方法對(duì)Hg2+和Pb2+顯示出較寬的響應(yīng)范圍和低檢測(cè)限，且實(shí)現(xiàn)了對(duì)大米中重金屬含量的測(cè)定[77]。小型便攜設(shè)備檢測(cè)平臺(tái)的開(kāi)發(fā)為重金屬離子臨場(chǎng)檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

圖8 基于智能手機(jī)的現(xiàn)場(chǎng)比色傳感策略[75]Fig.8 Schematic illustration of the proposed on-site Hg2+sensing strategy[75]

3 結(jié)論

功能核酸具備良好的穩(wěn)定性和對(duì)重金屬離子的強(qiáng)親和力，可以構(gòu)建重金屬傳感檢測(cè)平臺(tái)，在食品重金屬污染分析領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。與其他重金屬分析方法相比，核酸探針即使在復(fù)雜環(huán)境中也能保持對(duì)特定金屬離子的選擇性和檢測(cè)穩(wěn)定性，可應(yīng)用于實(shí)際食品樣品檢測(cè)。同時(shí)，功能核酸與重金屬離子的結(jié)合可引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生熒光、電化學(xué)和顏色變化等信號(hào)，實(shí)現(xiàn)高效快速的重金屬污染檢測(cè)。此外，將功能核酸和納米材料整合至生物傳感器中，利用納米材料的光、電、磁性能，可顯著提升檢測(cè)靈敏度和響應(yīng)速率，與血糖儀、智能手機(jī)等便攜式設(shè)備聯(lián)用開(kāi)發(fā)，在重金屬臨場(chǎng)檢測(cè)領(lǐng)域有一定的應(yīng)用潛力。盡管目前基于功能核酸檢測(cè)重金屬離子的相關(guān)產(chǎn)品離商業(yè)化還有距離，但隨著對(duì)功能核酸對(duì)靶點(diǎn)識(shí)別機(jī)制的研究以及核酸和納米材料合成技術(shù)的迅速發(fā)展，基于功能核酸的分析方法的可靠性、穩(wěn)定性和靈敏度將進(jìn)一步提升，必將促進(jìn)其在食品重金屬污染領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。