陳慧，郝錦亨，袁志濤，羅佳偉，陳胤熹，鄭少鵬，黎佩瑜，呂詠鍶，梁世濠，賴(lài)林浩,3，曹詩(shī)林,3

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東佛山 528000）（2.可持續(xù)生物化學(xué)與合成生物工程中心,佛山無(wú)遠(yuǎn)生物科技有限公司，廣東佛山 528000）（3.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

食品生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，包括了對(duì)食品中常見(jiàn)的成分進(jìn)行定量分析的教學(xué)內(nèi)容。食品中糖類(lèi)物質(zhì)與蛋白質(zhì)的含量檢測(cè)是食品檢測(cè)的常見(jiàn)項(xiàng)目，也是食品生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的一個(gè)重要的部分?？梢?jiàn)分光光度法是根據(jù)郎伯比爾定律[1]，根據(jù)顏色深淺變化，在特定波長(zhǎng)處測(cè)定被測(cè)物質(zhì)的吸光度，可對(duì)其物質(zhì)進(jìn)行定量分析，具有應(yīng)用廣泛，靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)。在這個(gè)方法中，需要使用分光光度計(jì)來(lái)進(jìn)行定量檢測(cè)。然而，普通的分光光度計(jì)不便攜帶、便攜式分光光度計(jì)價(jià)格昂貴。因此，設(shè)計(jì)一種簡(jiǎn)單可行的分析方法，并考察其是否有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為便攜設(shè)備的可能，是一個(gè)很有意思的研究課題。

基于3,5-二硝基水楊酸(DNS)[2]，苯酚硫酸法[3]，是經(jīng)典的還原糖的檢測(cè)方法。DNS法的原理是：3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖溶液共熱后被還原成棕紅色氨基化合物，顏色隨濃度變化而變化，隨著濃度增大，顏色加深。

由于以上兩種方法中，待測(cè)溶液顏色隨待測(cè)樣品濃度變化而呈現(xiàn)一定的規(guī)律，因此，待測(cè)溶液的顏色數(shù)據(jù)有可能與待測(cè)樣品的濃度具有相關(guān)性。如何提取待測(cè)溶液的顏色數(shù)據(jù)是建立上述相關(guān)性的一個(gè)難點(diǎn)，其主要在于獲得待測(cè)樣品的圖像，并從中提取出數(shù)據(jù)。RGB色彩體系是一種應(yīng)用極其廣泛的顏色系統(tǒng)，利用紅（R）、綠（G）、藍(lán)（B）三個(gè)顏色通道數(shù)據(jù)來(lái)表征所有的顏色特征[4]。通過(guò)數(shù)碼成像方法，可以獲得RGB數(shù)據(jù)。數(shù)碼成像[5]的原理是通過(guò)電荷耦合原件（CCD[6]）將色彩信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。CCD的色彩信號(hào)由紅綠藍(lán)（RGB[7]）三色信號(hào)混合而成。因此，在分析過(guò)程中，通過(guò)讀取被染色溶液中的RGB數(shù)據(jù)，并進(jìn)行進(jìn)一步處理，可望在不進(jìn)行分光的情況下，對(duì)樣品的濃度進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)量。在本課題組前期研究中，利用python腳本建立了在圖片中批量讀取樣品RGB顏色數(shù)據(jù)的方法。因此，本文在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了以下研究：（1）進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出了基于RGB的在線分析平臺(tái)；（2）進(jìn)而研究了還原糖待測(cè)樣品濃度與RGB數(shù)據(jù)的關(guān)系；（3）研究了還原糖最適圖片分辨率、吸光度和RGB向量三者之間的關(guān)系。最后建立了基于RGB色彩體系的食品中還原糖快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

無(wú)水葡萄糖為上海伯奧生物科技有限公司產(chǎn)品；3,5-二硝基水楊酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；酒石酸鉀鈉為天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀為BioTek Instruments，Inc公司產(chǎn)品；水浴鍋為鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；電子天平為上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司產(chǎn)品；掃描儀為精工愛(ài)普生公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基于python的RGB色彩分析模塊的思路

本文自行設(shè)計(jì)了一個(gè)用于自動(dòng)批量抓取顏色數(shù)據(jù)的腳本，具體的設(shè)計(jì)思路如下：先本研究利用96孔板作為裝載待測(cè)溶液的容器。由于96孔板中每一個(gè)圓孔中心與相鄰圓孔中心距離相同，在圖像中圓孔中心與相鄰圓孔中心的距離以像素來(lái)計(jì)算也是一定的。因此，通過(guò)python腳本程序讀取特定中心點(diǎn)像素區(qū)域的RGB值，可獲得待測(cè)液顏色數(shù)據(jù)。

首先設(shè)置兩個(gè)字符集，分別命名為Charset X和CharsetY。Charset X用于記錄酶標(biāo)板短板的像素位置（8列），CharsetY用于記錄酶標(biāo)板長(zhǎng)板的像素位置（12行）。以每個(gè)中心點(diǎn)為基準(zhǔn)，±n個(gè)像素的x和y的區(qū)域?yàn)閿?shù)據(jù)讀取區(qū)域。

數(shù)據(jù)讀取的順序是先讀中心點(diǎn)（x1，y1）至（x1，y12），再按順序讀x2的y1-y12，如此類(lèi)推讀至x8的y1-y12。故每次最多能讀取96組樣品數(shù)據(jù)。

利用skimage數(shù)字圖片處理包抓取每個(gè)數(shù)據(jù)區(qū)域平均的RGB數(shù)據(jù)值，輸出后進(jìn)行分析。

利用1.3.1中的python腳本對(duì)掃描得到的圖片進(jìn)行分析，通過(guò)運(yùn)行該程序一次性讀取所有樣品的RGB顏色數(shù)據(jù)，最后將所得的RGB顏色數(shù)據(jù)與待測(cè)溶液的濃度、吸光度進(jìn)行整合、分析，建立其三者之間的內(nèi)在聯(lián)系，同時(shí)探究出最適的樣品取樣量以及最適圖片分辨率。

1.3.2 在線分析平臺(tái)的建立

在線分析平臺(tái)上，由圖1可知，RGB模塊的工作流程為：(1)客戶(hù)端通過(guò)網(wǎng)絡(luò)界面上傳需要讀取的圖片文件（tiff格式）與XY軸坐標(biāo)文件（csv格式），隨后提交計(jì)算請(qǐng)求。(2)服務(wù)器收到請(qǐng)求后通過(guò)Thinkphp框架調(diào)用RGB腳本進(jìn)行計(jì)算，最后通過(guò)Linux自帶的壓縮打包命令來(lái)實(shí)現(xiàn)輸出文件的整理壓縮。本分析平臺(tái)已部署在互聯(lián)網(wǎng)，用戶(hù)可登陸以下網(wǎng)址使用：https://atomevo.com/。

圖1 RGB分析模塊流程圖Fig.1 The flow-process diagram of RGB analysis module

1.3.3 DNS試劑的制備

用電子天平精確稱(chēng)取1 g 3,5-二硝基水楊酸于100 mL燒杯中，加入20 mL 1 mol/L NaOH溶液和50 mL蒸餾水，再加30 g酒石酸鉀鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至100 mL，貯于棕色瓶中備用。

1.3.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和稀釋

將無(wú)水葡萄糖充分溶解于蒸餾水，配制成1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)曲溶液。隨后各取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL于10個(gè)相同的比色管中，編號(hào)0～9（葡萄糖含量分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg），向其中補(bǔ)充蒸餾水至2 mL。

1.3.5 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

向上述的每支比色管中均加入1.5 mL DNS，充分搖勻后在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5 min，隨后冷卻至室溫，用蒸餾水定容至10 mL，加塞后顛倒混勻.依次取各葡萄糖濃度的待測(cè)溶液200、150、100 μL于96孔板，使用酶標(biāo)儀在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖濃度與吸光度之間的關(guān)系。

1.3.6 數(shù)碼成像

將上述裝載好待測(cè)溶液的96孔板放置在掃描儀中，分別在150、300、600、1200 dpi下進(jìn)行掃描，使樣品成像。

1.3.7 探究不同掃描樣品量以及不同圖片分辨率對(duì)對(duì)RGB顏色分析法檢測(cè)效果的影響

利用1.3.2中在線分析平臺(tái)上的RGB分析模塊對(duì)上述掃描所得的tiff格式圖片進(jìn)行快速檢測(cè)分析，獲取葡萄糖濃度、葡萄糖吸光度與RGB向量數(shù)據(jù)，在不同條件下建立三者之間的內(nèi)在聯(lián)系，探究不同掃描樣品量以及不同圖片分辨率對(duì)對(duì)RGB顏色分析法檢測(cè)效果的影響，從而得到最適樣品取樣量和最適圖片分辨率。

1.3.8 樣品前處理

樣品處理：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g蘋(píng)果放置在研缽中，充分研磨。隨后轉(zhuǎn)移至燒杯，加入100 mL蒸餾水并混勻，將待測(cè)樣品溶液在3000 r/min條件下離心5 min之后，上清液置于陰暗干燥處備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 Magical-RGB計(jì)算平臺(tái)的構(gòu)建及使用說(shuō)明

在RGB模塊中，首先需要準(zhǔn)備輸入文件，包括圖片（***.tiff）與圖片的坐標(biāo)（***.csv），選擇文件之后點(diǎn)擊上傳到服務(wù)器，之后點(diǎn)擊執(zhí)行計(jì)算等待輸出的文件。任務(wù)完成之后可以在處理結(jié)果一欄對(duì)輸出文件（allFile.zip）進(jìn)行下載以獲得輸出的結(jié)果，界面與結(jié)果可見(jiàn)圖2。

圖2 Magical-RGB模塊Fig.2 The module between magical and RGB

2.2 利用在線分析平臺(tái)進(jìn)行葡萄糖的快速檢測(cè)

由圖3可知，葡萄糖濃度與葡萄糖在波長(zhǎng)為520 nm下吸光度值呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。因此接下來(lái)需要驗(yàn)證在何種條件下，其葡萄糖濃度或吸光度與RGB向量之間的關(guān)系也呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，從而建立三者之間的內(nèi)在聯(lián)系，嘗試更加便捷，高通量的檢測(cè)方法。

圖3 葡萄糖濃度-葡萄糖吸光度之間的關(guān)系Fig.3 The relationship between glucose concentration and glucose absorbance

2.2.1 樣品取樣量對(duì)RGB顏色分析法檢測(cè)效果的影響

在探究具體條件對(duì)RGB顏色數(shù)據(jù)的影響之前，將裝載待測(cè)樣品的96孔板放置在掃描儀中，通過(guò)改變不同掃描條件可得到類(lèi)似如圖4所示的圖片，隨后用Python程序腳本對(duì)該圖片進(jìn)行讀取和分析RGB顏色數(shù)據(jù)，探究出最適的成像條件。

圖4 掃描樣品圖Fig.4 Scanning sample map

根據(jù)表1可知，在葡萄糖濃度相同，圖片分辨率為150 dpi，而樣品取樣量不同的條件下，葡萄糖濃度與RGB向量可以呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，但擬合系數(shù)R2因樣品取樣量的不同而有所差異，結(jié)果表明，當(dāng)樣品取樣量為100 μL時(shí)，所得曲線擬合系數(shù)最大，達(dá)0.9858。根據(jù)表2可知，在上述相同的條件下，葡萄糖吸光度與RGB向量也能呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。同樣在100 μL條件下擬合系數(shù)最大，達(dá)0.9870。

表2 葡萄糖吸光度-RGB向量之間的關(guān)系Table 2 The relationship between Glucose absorbance and RGB vectors

2.2.2 最適圖片分辨率對(duì)RGB顏色分析法檢測(cè)效果的影響

在探究出最適樣品取樣量為100 μL后，只改變掃描時(shí)的圖片分辨率，分析數(shù)據(jù)可得表1。由此可知，葡萄糖濃度與RGB向量仍然可呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且當(dāng)圖片分辨率為1200 dpi時(shí)，所得曲線擬合系數(shù)最大，達(dá)0.9957。

表1 葡萄糖濃度-RGB向量之間的關(guān)系Table 1 The relationship between Glucose concentration and RGB vectors

在上述條件不變情況下，分析葡萄糖吸光度與RGB向量之間的關(guān)系，從表2中可以看出兩者之間能呈線性關(guān)系，同樣在1200 dpi時(shí)擬合系數(shù)最大，達(dá)0.9953。

通過(guò)以上兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的相互對(duì)比，可以得出在樣品取樣量為100 μL，圖片分辨率為1200 dpi時(shí)，葡萄糖濃度、吸光度、RGB向量三者之間均能呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。通常，圖片分辨率越大，通過(guò)掃描儀掃描得到的圖片清晰度更高，更能準(zhǔn)確的反映待測(cè)樣品溶液的顏色，因此所得到的RGB顏色數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。

2.2.3 平行實(shí)驗(yàn)的探究

為了增強(qiáng)本研究方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，在探究出最適成像條件后，同時(shí)進(jìn)行了7組平行實(shí)驗(yàn)。將各測(cè)點(diǎn)RGB向量分別取平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)，按下式計(jì)算合并變異系數(shù)MCV%[8]。

式中：j為測(cè)定點(diǎn)數(shù)，n為測(cè)定次數(shù)。

表3 平行實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)Table 3 Coefficient of variation in parallel experiments

2.2.4 RGB色彩數(shù)據(jù)分析法與紙上熒光數(shù)碼成像法的比較

對(duì)本文研究的RGB色彩數(shù)據(jù)分析法與紙上熒光數(shù)碼成像法[9]。進(jìn)行了比較，經(jīng)過(guò)對(duì)比可知，紙上熒光數(shù)碼成像法具有試劑消耗量少，成本低廉的特點(diǎn)。但RGB色彩數(shù)據(jù)分析法檢測(cè)所需的材料更少，RGB色彩數(shù)據(jù)法只需要一張圖片即可對(duì)其進(jìn)行RGB快速檢測(cè)。因此在追求快速檢測(cè)的測(cè)定中，RGB色彩數(shù)據(jù)分析法更具有優(yōu)勢(shì)。

2.2.5 RGB色彩數(shù)據(jù)分析法與紫外分光光度法法在實(shí)際應(yīng)用中的比較

蘋(píng)果中還原糖的測(cè)定：分別吸取0.2 mL樣品待測(cè)液于兩個(gè)10 mL比色管中，用蒸餾水補(bǔ)齊至2 mL，隨后各加入1.5 mL DNS，充分搖勻后在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5 min，隨后冷卻至室溫，用蒸餾水定容至10 mL，加塞后顛倒混勻。吸取待測(cè)溶液100 μL于96孔板，使用酶標(biāo)儀在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。將上述裝有待測(cè)樣品的96孔板在1200 dpi條件下掃描得到tiff格式圖片。利用在線分析平臺(tái)分析得到葡萄糖濃度并與紫外分光光度法測(cè)得的葡萄糖濃度進(jìn)行對(duì)比，如表4所示。

表4 RGB分析方法與分光光度法測(cè)定蘋(píng)果中還原糖含量的比較Table 4 Comparison of reducing sugar content in appledetermined by RGB analysis method and spectrophotometry

3 結(jié)論

本文探討了食品生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中還原糖分析的新方法，利用RGB色彩空間原理，建立了一個(gè)基于RGB色彩體系中的食品中還原糖的快速檢測(cè)方法。該方法在RGB-PYTHON檢測(cè)方法中已經(jīng)取得一定的成果，包括獲得2020年廣東省大學(xué)生生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技能大賽一等獎(jiǎng)、2020年第五屆全國(guó)大學(xué)生生命科學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽創(chuàng)新組一等獎(jiǎng)。本研究嘗試了在不同檢測(cè)的條件下，使用在線分析平臺(tái)的RGB分析模塊分析葡萄糖濃度，吸光度和RGB向量三者之間的關(guān)系。結(jié)果表明，葡萄糖濃度和RGB向量呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)，說(shuō)明本研究用RGB向量表征物質(zhì)的濃度的設(shè)想是可行的。目前，該方法仍然有進(jìn)一步改進(jìn)的空間，比如通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)方法降低數(shù)據(jù)區(qū)域選取時(shí)由于圖像色澤不均勻帶來(lái)的檢測(cè)不確定性、通過(guò)設(shè)計(jì)更好的用戶(hù)圖形界面（GUI）增加該分析平臺(tái)的易用性。相關(guān)技術(shù)還有進(jìn)一步拓展的空間，可以通過(guò)顯色反應(yīng)或者分光光度法進(jìn)行檢測(cè)的物質(zhì)比如蛋白質(zhì)，也使用本方法和分析模塊，從而開(kāi)發(fā)出更多簡(jiǎn)便、靈敏的食品檢測(cè)方法。