林 歡，馮旰珠

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210011

2019年12月，中國湖北省武漢市出現(xiàn)了病因不明的肺炎暴發(fā)。一種新型冠狀病毒被確認(rèn)為病原體，該病毒可影響下呼吸道，并在人類中表現(xiàn)為肺炎，2020 年2 月世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）將該病命名為新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 19，COVID-19），同年3 月國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）冠狀病毒研究小組正式將該病毒命名為“SARS-CoV-2”。盡管全球進(jìn)行了嚴(yán)格的控制和隔離，該病仍在世界各地迅速蔓延。SARSCoV-2 隸屬于冠狀病毒種屬，此病毒因在電子顯微鏡下呈現(xiàn)出包膜上有形狀類似日冕的棘突而得名。目前，研究者發(fā)現(xiàn)病毒顆粒由4種蛋白組成，包括刺突蛋白（spike，S）和膜蛋白（membrane，M）兩種主要的糖蛋白、非糖基化的包膜蛋白（envelope，E）及負(fù)責(zé)病毒RNA 復(fù)制的核衣殼蛋白（nucleocapsid，N）（圖1［1］）。S蛋白在SARS-CoV-2與宿主細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin-convertingenzyme2，ACE2）受體結(jié)合、膜融合、病毒內(nèi)化、組織嗜性及其致病性方面至關(guān)重要，因此成為疫苗研制及中和抗體開發(fā)抗體主要靶標(biāo)。

圖1 冠狀病毒結(jié)構(gòu)Figure 1 The coronavirus structure

1 S蛋白的結(jié)構(gòu)

2012 年ICTV 根據(jù)冠狀病毒的基因組結(jié)構(gòu)將其分成4個屬：α屬轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（transcription regulating sequences，TRS）均為CUAAAC，具有2個蛋白酶位點；β屬A群TRS為CUAAAC，而其他群為ACGAAC和非結(jié)構(gòu)蛋白3（non-structural protein 3，NSP3），但β屬只有1個蛋白酶位點；γ屬TRS為CUUAACAA，都缺少NSP7；δ屬是已知最小基因組，其結(jié)構(gòu)類似其他病毒。21 世紀(jì)以來，造成重癥急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）的SARS-CoV、中東呼吸綜合征（middle east respiratory syndrome，MERS）的MERS-CoV 及SARS-CoV-2 病毒均屬于β屬。研究發(fā)現(xiàn)，同屬于冠狀病毒的SARS-CoV-2 與SARS-CoV 具有很高的序列同源性（約79.5%）［2］。SARS-CoV-2 的基因組編碼pp1ab（從ORF 1ab 進(jìn)行翻譯），4 個結(jié)構(gòu)蛋白（S、E、M 和N）和6 個輔助蛋白（3a、6、7a、7b、8 和10），與SARS-CoV 和MERS-CoV相同，SARS-CoV-2也沒有血凝素-酯酶（HE）基因［3］。

冠狀病毒的S 蛋白是高度糖基化的糖蛋白，相對分子質(zhì)量約2×105，由1 200～1 500 個氨基酸殘基組成。盡管4個種類冠狀病毒的S蛋白氨基酸序列不同，但在結(jié)構(gòu)上卻具有一些共同特征：皆由較長的膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)組成，屬Ⅰ類病毒融合蛋白［4］。像其他Ⅰ類病毒融合蛋白一樣，S蛋白在翻譯后會折疊成亞穩(wěn)態(tài)的預(yù)融合構(gòu)象。運用冷電鏡（Cryo-EM）對SARS-CoV-2的S蛋白研究后發(fā)現(xiàn)，S蛋白存在封閉和開放兩種結(jié)構(gòu)狀態(tài)（圖2A）［5］。S蛋白呈三聚體結(jié)構(gòu)，在封閉狀態(tài)時，具有3個受體結(jié)合域（receptor-binding domain，RBD），呈“向下”構(gòu)象，而在開放狀態(tài)時，則僅有1 個呈“向上”構(gòu)象的RBD。最近在S蛋白三聚體的其他穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)中也能觀察到這兩種狀態(tài)，且開放狀態(tài)是SARS-CoV-2 與宿主細(xì)胞膜融合的前提［6］。S 蛋白在功能上分為S1、S2 兩個亞基：S1 亞基參與受體識別，S2 亞基促進(jìn)膜融合并將S蛋白錨定在宿主細(xì)胞膜上（圖2B）。β冠狀病毒S 蛋白的S1 亞基呈現(xiàn)多域結(jié)構(gòu)，分布在A～D 4 個不同的結(jié)構(gòu)域中，其中域A 和B 可充當(dāng)受體結(jié)合域。域A的核心結(jié)構(gòu)呈半乳糖凝集素樣的β夾心折疊，域B 則呈反向平行的β折疊，域B 在病毒膜遠(yuǎn)端有1 個延伸環(huán)，該環(huán)在β冠狀病毒屬的不同種類間，其大小與結(jié)構(gòu)存在很大不同，因此也稱為高變區(qū)（hypervariable region，HVR）［7-8］。S1 的C-末端結(jié)構(gòu)域C 和D 由初級蛋白序列的非連續(xù)部分構(gòu)成，并直接與S2 亞基的莖核心相連形成β折疊結(jié)構(gòu)，而整個S1 結(jié)構(gòu)域則通過覆蓋在S2 表面的環(huán)相互連接［9］。S1亞基在冠狀病毒不同屬間的序列長度差異很大，表明不同冠狀病毒屬S 蛋白結(jié)構(gòu)不同，S2 亞基則高度保守，但它包含了促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞融合的重要區(qū)域，包括融合肽（fusion peptide，F(xiàn)P）、2個七肽重復(fù)區(qū)（HR1 和HR2）以及跨膜結(jié)構(gòu)域［10］。在預(yù)融合狀態(tài)下，HR1 區(qū)形成4 個螺旋作為S2 主干的一部分，HR2區(qū)則無序，F(xiàn)P形成短螺旋和環(huán)，疏水性殘基埋在FP內(nèi)部。位于HR1下游的長為75 ?的中心螺旋沿著S2三聚體的三重軸延伸，HR1基序本身沿S2亞基折疊為4個單獨的α螺旋，融合肽則形成1個短螺旋，其保守的疏水殘基與S2亞基其他部分掩埋在1個邊緣區(qū)域［11］。

圖2 SARS-CoV-2S蛋白的結(jié)構(gòu)分析Figure 2 Structural analysis of S protein of SARS-CoV-2

2 冠狀病毒S蛋白入侵過程

2.1 與受體結(jié)合

對冠狀病毒S 蛋白的結(jié)構(gòu)研究表明，其N 端結(jié)構(gòu)域（N-terminal region，NTR）及S1的C端結(jié)構(gòu)域（Cterminal region，CTR）可與宿主受體結(jié)合，發(fā)揮RBD作用［12］。SARS-CoV-2通過其S1亞基CTR結(jié)構(gòu)域的RBD識別宿主細(xì)胞ACE2受體并與之結(jié)合［13］。ACE2可在人類肺、心、腎、睪丸等組織器官表達(dá)，以鼻前庭、鼻咽部鱗狀上皮、口腔黏膜、肺泡上皮細(xì)胞及動靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)普遍，尤以肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)［14-15］；而脾臟、骨髓、淋巴結(jié)以及Kupffer細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞皆不表達(dá)ACE2。盡管SARS-CoV-2與MERS-CoV RBD同源域的結(jié)構(gòu)相似，但SARS-CoV-2 RBD 所誘導(dǎo)的抗體與MERS-CoV 沒有交叉中和活性［16］；在與受體結(jié)合的過程中，MERSCoV是通過RBD（CTR）區(qū)域識別受體的二肽基肽酶4（DPP4）并與之結(jié)合，而SARS-CoV-2 則是通過S1亞基CTR 結(jié)構(gòu)域RBD 與ACE2 的受體結(jié)合。所以，盡管SARS-CoV-2 和MERS-CoV RBD 的同源域結(jié)構(gòu)相似，但它們結(jié)合的受體結(jié)合基序（receptor binding motif，RBM）區(qū)域不同，這就解釋了它們識別不同受體的原因［17］。

2.2 S蛋白的蛋白水解切割和構(gòu)象變化

冠狀病毒入侵宿主細(xì)胞的基本過程，包括S 蛋白與受體結(jié)合及其水解，最終形成病毒-細(xì)胞融合。它首先通過S 蛋白S1 亞基的NTR 或CTR（或兩者）與宿主受體相互作用完成病毒體附著，繼而通過網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白依賴性途徑經(jīng)受體介導(dǎo)內(nèi)吞后進(jìn)入宿主細(xì)胞，而在內(nèi)吞攝取前，S蛋白則被相應(yīng)蛋白酶水解［18］。S 蛋白水解切割點有2 個，其一位于S1和S2亞基之間的邊界（S1/S2切割位點），其二則位于第一融合肽的上游（S2′切割位點）［19］。盡管未得到實驗證實，但多數(shù)研究者認(rèn)為，所有冠狀病毒-宿主細(xì)胞融合都依賴于S2′或接近S2′的蛋白水解切割來完成，且該過程實現(xiàn)主要取決于S 蛋白與受體結(jié)合后的構(gòu)象變化［20］。冠狀病毒S預(yù)融合構(gòu)象分析表明，S1亞基重定位（或脫落）改變S2構(gòu)象，S2′切割位點進(jìn)入預(yù)融合S 結(jié)構(gòu)上的α-螺旋內(nèi)，在此基礎(chǔ)上S2′位點的二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為可切割的柔性環(huán)。在S2′位點蛋白水解切割激活后，融合肽與相鄰S2螺旋之間的疏水相互作用受到干擾，這使得4 個α-螺旋和HR1 區(qū)的連接區(qū)域重新折疊成1 個長三聚體螺旋，該三聚體螺旋作為中央螺旋的N 端延伸，將融合肽插入宿主細(xì)胞內(nèi)吞區(qū)的膜中。接下來，由于S2 重排，2個HR區(qū)域相互作用，形成1個反向平行、能量穩(wěn)定的六螺旋束，使病毒和宿主脂質(zhì)雙分子層完成融合［21］。

3 針對S蛋白的抗體和疫苗

3.1 抗體

抗體介導(dǎo)的體液反應(yīng)對于抗病毒感染至關(guān)重要。中和抗體（neutralizing antibody，NAB），通過與這些病毒顆粒的表面表位結(jié)合阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，降低病毒的傳染性［22］。NAB 通過3 個主要途徑發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)：首先，NAB 通過與病毒顆粒的結(jié)合阻止后者與靶細(xì)胞受體的結(jié)合；其次，通過抗體介導(dǎo)的調(diào)理作用或補(bǔ)體激活效應(yīng)使病毒裂解；第三，NAB 還可對病毒感染提供特異性免疫防御［23］。近年來開發(fā)了多種抗病毒NAB，其中部分已用于臨床，如單克隆抗體4C2、Mersmab1、LCA60 等［24-25］。冠狀病毒S蛋白，尤其是S1亞基RBD是開發(fā)NAB最關(guān)注的靶點，NAB 可以通過與該靶點的結(jié)合阻斷RBD與宿主細(xì)胞ACE2受體的相互作用［26］。研究顯示，中和抗體80R、CR3014、CR3022、M396均可阻斷S1 的RBD與ACE2結(jié)合，且80R和M396對冠狀病毒的中和效應(yīng)已在動物模型上得到證實（表1）［27-33］。日前，研究者從59 例COVID-19 康復(fù)期患者血漿中分離出中和抗體COVA1-18，以其干預(yù)SARS-CoV-2感染的hACE2 小鼠模型后發(fā)現(xiàn)，COVA1-18 能使模型鼠肺中的SARS-CoV-2 病毒載量顯著減少，且這種干預(yù)效果在3種不同的臨床前模型也得到驗證，提示COVA1-18有望成為臨床治療的候選藥物［34-35］。先前有關(guān)埃博拉病毒和SARS 抗體的研究表明，多種NAB 的混合治療比單一表位抗體顯示出更強(qiáng)的中和效果，即雞尾酒抗體法對付SARS-CoV-2 是值得嘗試的一種策略［36］。新近報道，由兩種非競爭性人體中和抗體IgG1 組成的雞尾酒NAB REGN-COV2能夠靶向SARS-CoV-2 S蛋白的受體RBD，阻止病毒進(jìn)入人體細(xì)胞，Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗結(jié)果顯示，REGNCOV2能顯著增強(qiáng)機(jī)體對SARS-CoV-2的清除，尤其在內(nèi)源性免疫應(yīng)答尚未啟動（即血清抗體陰性）以及高病毒載量的初期患者，且與之相關(guān)的過敏反應(yīng)或嚴(yán)重不良事件發(fā)生率極低，表明其安全性令人滿意［31-38］。因此，制備針對SARS-CoV-2的NAB 時，多種有效NAB的組合在降低病毒逃逸概率、提高對病毒的中和效果方面會更有前景［39］。

表1 抗SARS-CoV中和抗體Table 1 Neutralizing antibody of anti-SARS-CoV

3.2 滅活疫苗

盡管早先已開發(fā)出多種針對SARS-CoV 和MERS-CoV 的疫苗，但僅有少數(shù)幾種在臨床上得到測試（表2、3）［40-53］，目前尚無批準(zhǔn)用于人類的SARS、MERS 疫苗［48-54］。Sinovac 公司開發(fā)出的SARS-CoV-2滅活疫苗CoronaVac（前身為PiCoVacc），將病毒用丙醇酸丙酯滅活，并以明礬作佐劑增強(qiáng)，Ⅱ期臨床試驗（NCT04383574）包括600 例18～59 歲的健康志愿者，分別在第0、14天或第0、28天接受了2次3 μg、6 μg CoronaVac免疫或安慰劑注射。與第0、14天組相比，第28 天二次免疫后，志愿者NAB 滴度增加更顯著，且滴度隨年齡的增長逐漸下降，提示老年人群可能需要更高劑量或多次免疫才能得到更好的保護(hù)效果。該研究中，沒有觀察到3 級以上的不良事件，且疫苗組和安慰劑組之間不良事件發(fā)生率也沒有顯著差異，表明其可靠的安全性［55-56］。北京生物制品研究所與中國國藥集團(tuán)聯(lián)合研制的丙醇酸丙酯滅活疫苗BBIBP-CorV（ChiCTR2000034780）也以明礬作為佐劑，Ⅰ～Ⅱ期試驗（ChiCTR2000032459）報告，在所有接種BBIBP-CorV 的人群中，SARS-CoV-2的抗體滴度顯著高于安慰劑組，最常見局部反應(yīng)是注射部位疼痛（16%的疫苗接種者），全身不良反應(yīng)則是短時間發(fā)熱（2%的疫苗接種者），但均未報告嚴(yán)重不良事件，目前該疫苗已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗階段，試驗設(shè)計為雙盲、隨機(jī)及安慰劑對照，擬納入15 000 名健康志愿者［57，58］。此外，武漢生物制品研究所和國藥控股聯(lián)合開發(fā)的另一SARS-CoV-2滅活疫苗，其Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗（ChiCTR2000031809）結(jié)果顯示，初次與第2 次加強(qiáng)接種之間間隔時間較長者比較短者能誘導(dǎo)更高的抗體水平，亦無嚴(yán)重不良事件報道［59］。該疫苗的Ⅲ期臨床試驗已獲批準(zhǔn)，試驗設(shè)計擬采用雙盲、安慰劑及隨機(jī)對照（ChiCTR2000034780），樣本量將擴(kuò)大到15 000 名18 歲以上的健康人群。

滅活和減毒活病毒的疫苗是開發(fā)疫苗最傳統(tǒng)的方法，通常這類疫苗能誘導(dǎo)高效免疫反應(yīng)與保護(hù)效應(yīng)，但仍存在病毒不完全滅活或毒力恢復(fù)的可能，因此疫苗生產(chǎn)企業(yè)在此類安全隱患的消除上負(fù)有特別重大的責(zé)任［60］；另外需要關(guān)注的是，這種傳統(tǒng)疫苗可能會像SARS感染一樣誘導(dǎo)抗體依賴性增強(qiáng)（antibody-dependent enhancement，ADE）效應(yīng)，即非中和特異性抗體與病毒結(jié)合后，抗體的Fc段與表達(dá)Fc 受體的細(xì)胞結(jié)合從而介導(dǎo)了病毒進(jìn)入這些宿主細(xì)胞，促進(jìn)病毒感染［61］。

3.3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是基于合成肽或重組蛋白開發(fā)的疫苗，與滅活或減毒活病毒和病毒載體疫苗不同，這種疫苗類型主要包含特定的病毒抗原片段，但不包含傳染性病毒的成分，從而消除了不完全滅活或毒力恢復(fù)的擔(dān)憂，通常是安全的［62］。然而，研究也發(fā)現(xiàn)基于全長S蛋白的亞單位疫苗在誘導(dǎo)有效免疫反應(yīng)與保護(hù)效應(yīng)的同時，其誘導(dǎo)的一些抗體在體外介導(dǎo)了病毒感染的增強(qiáng)，即上述的ADE 現(xiàn)象。因此，有學(xué)者對基于SARS-CoV和MERS-CoV全長S蛋白的亞單位疫苗的安全性問題表示擔(dān)憂［63］。而基于S蛋白RBD的亞單位疫苗，包含了主要的中和域，能誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的中和抗體，對病毒感染顯現(xiàn)較強(qiáng)的保護(hù)效應(yīng)（表2、3）。因此，就安全性和有效性而言，RBD 或S 蛋白的S1/S2 亞基可以作為開發(fā)針對SARS-CoV、MERS-CoV、SARSr-CoV 和MERSr-CoV的亞單位疫苗的重點靶標(biāo)［64］。Novavax 公司正在開發(fā)一種SARS-CoV-2 重組蛋白亞單位疫苗NVXCoV2373，該疫苗主要是基于SARS-CoV-1、MERSCoV的全長、重組、預(yù)融合穩(wěn)定的S糖蛋白，輔以基質(zhì)金屬蛋白酶納米顆粒。有關(guān)該疫苗的Ⅰ、Ⅱ期試驗的報告已經(jīng)發(fā)布，首次接種后，NAB的滴度加佐劑組顯著高于未加佐劑組，而第2次接種后，佐劑組的NAB滴度比單劑無佐劑的NVX-CoV2373 高出100 倍［65-66］。有關(guān)該疫苗的Ⅲ期臨床試驗（NCT04583995）正在進(jìn)行中，擬采用安慰劑對照、雙盲的隨機(jī)研究，以評估其在18～84 歲成年志愿者中的安全性和有效性，總樣本量為15 000名受試者。

表2 基于S蛋白的抗MERS-CoV的疫苗Table 2 S protein-based vaccines against MERS-CoV

3.4 RNA疫苗及其他疫苗

基于RNA 疫苗的技術(shù)相對較新。目前主要有兩種RNA 疫苗：mRNA（mRNA）和自我擴(kuò)增RNA（saRNA）。mRNA 疫苗的制造與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的過程相似，這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從細(xì)胞核傳遞到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行翻譯。然而，疫苗中的mRNA 經(jīng)歷了預(yù)先的純化、修飾，以增加其穩(wěn)定性和翻譯效率，并提高疫苗的效果。疫苗的輸送方式也會影響其壽命和吸收。一些疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗，最常用的傳遞介質(zhì)是脂基納米顆粒（LNP），因為它們易于生產(chǎn)，為mRNA提供保護(hù)，并協(xié)助將mRNA傳遞到細(xì)胞中［67-68］。Moderna 公司與美國國家過敏和傳染病研究所合作，基于SARS-CoV-2預(yù)融合穩(wěn)定的S三聚體結(jié)構(gòu)開發(fā)了mRNA-1273，這是一種經(jīng)脂基納米顆粒封裝、核苷修飾的mRNA疫苗。前期用小鼠和恒河猴模型進(jìn)行的研究顯示，在mRNA-1273的初次、二次疫苗接種后，所有模型都出現(xiàn)了劑量依賴性抗S 蛋白抗體及以Th1 細(xì)胞為主的免疫誘導(dǎo)效應(yīng)，Ⅰ期臨床試驗（NCT04283461）顯示，100 μg mRNA-1273 比250 μg更安全、有效，且未觀察到嚴(yán)重不良事件［69-70］。目前，BioNTech 與輝瑞和復(fù)星制藥聯(lián)合開發(fā)LNP BNT162b1 和BNT162b2 疫苗，其中BNT162b1 編碼SARS-CoV-2T4 纖維蛋白三聚體化的RBD，BNT162b2編碼全長SARS-CoV-2 S蛋白的預(yù)融合構(gòu)象。其Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗（NCT04368728）結(jié)果顯示，志愿者的抗體滴度呈劑量依賴效應(yīng)，且其血清對SARS-CoV-2 S數(shù)種變異株也具有顯著的中和效應(yīng)，且未見嚴(yán)重不良事件［39］。此外，腺病毒載體疫苗、納米疫苗及貼片疫苗等也都處于開發(fā)研究中，如匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心開發(fā)了一種針對SARS-CoV-2的微針皮膚貼片疫苗，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體［71］，但其安全性及有效性尚需檢驗。

表3 抗SARS-CoV亞單位疫苗Table 3 Subunit vaccines against SARS-CoV

4 小結(jié)與展望

冠狀病毒S 蛋白是膜上基本結(jié)構(gòu)蛋白之一，其主要功能是與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合，引起自身構(gòu)象變化，使疏水性的融合肽與細(xì)胞膜接近并融合介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。所有冠狀病毒的S蛋白都具有保守的功能區(qū)，分別位于S1和S2結(jié)構(gòu)域，兩者在受體結(jié)合和膜融合方面起重要作用。研究S蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，尤其是與受體的相互作用關(guān)系，有助于開發(fā)新的抗冠狀病毒藥物、單克隆抗體、疫苗等，預(yù)防和治療相關(guān)疾病。

目前，對于SARS-CoV-2的臨床治療，主要是抑制病毒或降低病毒所引起的炎癥風(fēng)暴（如干擾素、糖皮質(zhì)激素）［72］。與這些治療策略相比，NAB 顯然對病毒粒子更具特異性，開發(fā)針對SARS-CoV-2 的治療性NAB在未來一個時期將成為熱點，而深入了解NAB的作用機(jī)制無疑會對SARS-CoV-2抗體開發(fā)提供有價值的啟示。

鑒于目前SARS-CoV-2 全球大流行的形勢，開發(fā)安全有效的疫苗迫在眉睫。一種理想的SARSCoV-2疫苗應(yīng)具備：既能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞免疫，活化細(xì)胞毒性T 細(xì)胞及記憶性T 細(xì)胞，又能針對SARSCoV-2產(chǎn)生持久的中和抗體，且不良反應(yīng)少或無、易保存，對SARS-CoV-2 具有高靶向性與高精確性。我們相信，經(jīng)過全球科學(xué)研究者的共同努力，這樣的SARS-CoV-2疫苗一定會出現(xiàn)。