趙 雪，周巧利，顧 威

南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210008

黏多糖Ⅵ型綜合征（mucopolysaccharidosis typeⅥ，MPS Ⅵ）又稱Maroteaux-Lamy 綜合征，是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾?。╝utosomal recessive，AR），常因芳基硫酸酯酶B（arylisulfatase B，ARSB）基因的致病性變異引起［1］。據(jù)估計(jì)，全球發(fā)病率約為1/320 000～1/248 000［2］，居住在德國(guó)的土耳其移民中患病率最高，為0.023‰（1/43 261），在瑞典為1/150萬(wàn)，中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)患病率為1/83萬(wàn)，中國(guó)大陸目前無(wú)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)［3］。人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（human gene mutation database，HGMD）可搜索到ARBS基因突變位點(diǎn)達(dá)200余種，大多為錯(cuò)義突變或無(wú)義突變，幾乎每種類型的突變都可引起ARSB 缺乏或缺失，導(dǎo)致部分分解的酸性黏多糖（glycosaminoglycan，GAG）、大分子物質(zhì)硫酸皮膚素（dermatan sulfate，DS）和硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）沉積積聚在組織內(nèi)，出現(xiàn)一系列隨著年齡不斷惡化的臨床癥狀［3］。MPS Ⅵ主要特征包括多發(fā)性發(fā)育不良、多種營(yíng)養(yǎng)不良，包括心臟損害、肝脾腫大、聽力損害及眼部異常，骨骼表型以身材矮小和生長(zhǎng)衰竭為特征［4-5］。根據(jù)臨床特征可做出初步診斷，但基因診斷仍是最有效的確診手段。本研究對(duì)1例臨床診斷的MPS Ⅵ患者進(jìn)行二代測(cè)序及家系驗(yàn)證，為進(jìn)一步探討臨床表型與基因型相關(guān)性提供依據(jù)。

1 病例資料

患者，男，生后3 月齡時(shí)出現(xiàn)腰部后凸，佩戴矯形器治療，3.5 歲發(fā)現(xiàn)前眼球進(jìn)行性突出，家長(zhǎng)自述“聽力異?！保F(xiàn)4.5 歲因“腰部后凸”于南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科診治。G1P1，足月順產(chǎn)，出生體重4.05 kg，7～8 個(gè)月能獨(dú)自坐穩(wěn)，1 歲左右能獨(dú)自走穩(wěn)，會(huì)喊“爸爸、媽媽”，現(xiàn)行走姿勢(shì)無(wú)明顯異常，無(wú)視力異常，無(wú)高代謝癥狀，口齒不清。母孕期無(wú)特殊，否認(rèn)相關(guān)疾病家族史。入院后查體：身高94.5 cm（＜P3），體重15 kg（＜P5），左膝伸側(cè)、背部，臀部見多塊青色胎記，特殊面容，眼球明顯突出，鼻梁低平，雞胸。臍疝，約1 元硬幣大小，恥骨聯(lián)合上4 cm 處見一2 cm 長(zhǎng)橫行手術(shù)瘢痕，愈合好，肝脾肋下2 cm，質(zhì)中，骨骺端肥大，關(guān)節(jié)僵硬，手掌大，X 型腿。余無(wú)特殊。

輔助檢查：胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）35.4 ng/mL；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3（insulin-like growth factor-binding protein-3，IGFBP-3）1.85 μg/mL；IGF-1/IGFBP-3 比值19.1 ng/μg。脊柱全長(zhǎng)正側(cè)位片：腰椎后凸，腰椎椎體前緣發(fā)育差，前下部呈魚嘴樣突出，雙側(cè)肋骨略寬，根部變細(xì)，呈飄帶狀，所及骨盆坐骨大切跡深凹，髖臼淺平，右側(cè)股骨頭扁平，密度偏高，雙側(cè)股骨頸略外翻狀。左腕關(guān)節(jié)正位片、四肢及骨盆平片：雙側(cè)尺橈骨干骺端增寬，邊緣可見刺狀突起，所及雙手掌骨近端不規(guī)則，變尖，指骨呈“子彈頭”樣改變，骨齡發(fā)育約相當(dāng)于4 歲；雙側(cè)髖臼頂扁平，股骨頭骨骺發(fā)育小，股骨頸短，下肢長(zhǎng)骨較短，干骺端增寬，脛腓骨顯著，且邊緣可見刺狀突起。頭顱側(cè)位片：頭顱外形增大，蝶鞍拉長(zhǎng)，諸骨皮質(zhì)光整。心臟彩超提示二尖瓣前葉輕度脫垂伴關(guān)閉不全（少量反流）、假性室隔膨出瘤（室間隔缺損自然閉合？）、主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全（少量反流）。鼻咽側(cè)位片提示腺樣體肥大腭扁桃體增大。眼科視力檢查因患者無(wú)法配合失敗，眼壓正常。聽力測(cè)試中聲阻抗右耳0.67 mL，左耳0.92 mL；耳聲發(fā)射中雙側(cè)瞬態(tài)聲誘發(fā)耳聲發(fā)射均未引出。韋氏智力測(cè)定：語(yǔ)言配合困難，圖片詞匯測(cè)試配合尚可，得分17，IQ 64，輕度弱智。

結(jié)合患者病史特征，臨床診斷考慮黏多糖貯積癥可能。建議完善基因檢測(cè)。獲得患者家長(zhǎng)知情同意后，抽取患者及其父母、弟弟、妹妹的靜脈血各2 mL（EDTA抗凝）。根據(jù)南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院相關(guān)流程規(guī)定，標(biāo)本統(tǒng)一送至北京邁基諾公司完成基因檢測(cè)。

基因檢測(cè)：二代測(cè)序可以同時(shí)兼顧敏感性和準(zhǔn)確性，被廣泛應(yīng)用于各個(gè)學(xué)科和領(lǐng)域，是目前常用的基因檢測(cè)方法［6］。研究使用標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（北京邁基諾自主研發(fā)）進(jìn)行基因組文庫(kù)構(gòu)建。采用目標(biāo)序列捕獲探針（GenCap）對(duì)812個(gè)已知的遺傳性骨骼疾病相關(guān)候選基因外顯子區(qū)域及其邊緣50 bp進(jìn)行捕獲，富集目標(biāo)區(qū)域DNA 片段。借助Illumina HiSeq X Ten 測(cè)序儀對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序。GenCap 相較于全基因組測(cè)序，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量更少，避免大量冗余數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，便于分析，降低成本。將原始測(cè)序數(shù)據(jù)去除污染和接頭序列，然后利用BWA 軟件（http：//bio-bwa.sourceforge.net/）將過(guò)濾后的序列比對(duì)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)人類基因組參考序列（hg19）［7］。利用GATK軟件（https：//software.broadinstitute.org/gatk/）分析得出單核苷酸變異（single nucleotide variation，SNV）和插入缺失突變（inserts and deletions，INDEL）的相關(guān)信息［8］。通過(guò)ANNOVAR軟 件（http：//annovar.openbio -informatics.org/en/latest/）對(duì)所有的SNV和INDEL進(jìn)行注釋［9］。篩選出正常人數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率小于0.05的突變位點(diǎn)，正常人數(shù)據(jù)庫(kù)包括千人基因組計(jì)劃和EXAC等。錯(cuò)義突變使用SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster 和GERP++等軟件進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)和保守性預(yù)測(cè)。結(jié)合疾病遺傳模式和患者臨床表征進(jìn)行綜合分析，篩選出可疑候選變異［10］。

使用預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行致病性分析，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)（ACMG）發(fā)布的變異解讀指南發(fā)現(xiàn)3 個(gè)可能致病基因位點(diǎn)：INPPL1、LRP5、ARSB（表1）。INPPL1 為常染色體隱性遺傳，其家系中未發(fā)現(xiàn)同一基因突變，且患者臨床特征與該基因突變表型不相符，故不考慮其致病可能。LRP5為常染色體顯性遺傳，與其相關(guān)的Van Buchem 病2型是一種硬化性骨發(fā)育不良疾病，臨床特征與患者部分重合，但家系驗(yàn)證中無(wú)同一突變。該患者ARSB 基因突變表型與患者臨床特征相符合，且家系驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)相關(guān)位點(diǎn)，證實(shí)為常染色體隱性遺傳，考慮為該患者致病基因。利用Primer 3.0 在線軟件（http：//primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)ARSB 基因PCR 引物（表2）。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用3130XL 測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序并在ABI 3130 Genetic Analyzer 上進(jìn)行分析。再對(duì)家系成員進(jìn)行共分離驗(yàn)證。使用貝克曼自動(dòng)化工作站預(yù)設(shè)程序，配制PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系，充分混勻、離心后置于已經(jīng)設(shè)置好的PCR 儀中：95 ℃預(yù)變性10 min，35 個(gè)循環(huán)（94 ℃30 s，58～64 ℃30 s，72 ℃45 s），72 ℃延伸5 min，4 ℃保存，每步對(duì)應(yīng)不同的退火溫度（表2）。由于大片段缺插入缺失序列結(jié)果讀取可能存在一定的局限性，實(shí)際操作中可采用一代PCR聯(lián)合Sanger 測(cè)序法進(jìn)行補(bǔ)充［11］。Sanger 驗(yàn)證可采用正向測(cè)序或反向測(cè)序，反向測(cè)序峰圖顯示的堿基有可能為被檢測(cè)堿基的反向互補(bǔ)序列。chr5-78251291突變導(dǎo)致部分序列移碼，正向測(cè)序得到的圖顯示左側(cè)亂峰，無(wú)法使用，故采用反向測(cè)序圖。

表1 可疑致病基因

表2 驗(yàn)證引物信息

最終確定致病的2個(gè)突變位點(diǎn)（圖1）：①第5位外顯子上c.979C＞T，導(dǎo)致氨基酸改變p.R327X，為無(wú)義突變，變異來(lái)源于母親；②第4位外顯子上c.724_725insCCCTTCAGGTCC，導(dǎo)致氨基酸改變 p.H242delinsPLQVH，為整碼突變，變異來(lái)源于父親，同時(shí)患者妹妹和弟弟相同位點(diǎn)也發(fā)生了雜合變異。

圖1 ARSB基因Sanger測(cè)序圖

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：將需要預(yù)測(cè)的蛋白序列導(dǎo)入在線軟件SWISS-model（https：//swiss-model.expasy.org/interactive），選擇覆蓋突變位點(diǎn)range 范圍的蛋白質(zhì)同源性模型［12-14］。模型的一致性和相似度不低于30%，可視化分析軟件Swiss-PdbViewer（http：//www.genebee.msu.su/spdbv/text/getpc.htm）［15］繪制蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖，分析預(yù)測(cè)該突變位點(diǎn)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響。既往研究證實(shí)與野生型相比，Mutant1（p.R327X）因提前終止轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生截短的蛋白，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不完整［16］；圖2 中Mutant2（p.H242delinsPLQVH）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可見小部分缺失，與野生型相比，插入4個(gè)新的堿基，氨基酸側(cè)鏈發(fā)生變化，原His242 與Tyr175 之間的氫鍵消失，His242 與Glu243 之間的氫鍵消失，取而代之的是Pro242 與Tyr175之間和Gln244與Glu247之間形成新的氫鍵，導(dǎo)致蛋白長(zhǎng)度發(fā)生改變（圖3）。

圖2 Mutant1、Mutant2與野生型蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)對(duì)比圖

圖3 Mutant2與野生型氨基酸結(jié)構(gòu)對(duì)比圖

2 討論

MPS Ⅵ常因第5 染色體（5q13～q14）上的ARSB基因突變引起，該基因由8個(gè)71～885 bp的外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子組成，轉(zhuǎn)錄合成了2 228 bp 的mRNA，編碼533個(gè)氨基酸的前體蛋白［17］。當(dāng)其編碼的參與黏多糖降解的溶酶體酶發(fā)生儲(chǔ)存障礙時(shí)，GAG、DS、CS不能降解，蓄積在溶酶體內(nèi)，引起細(xì)胞損害，造成不可逆的多器官功能障礙，一般無(wú)智力異常及神經(jīng)退行性變［18-19］。本研究為了進(jìn)一步明確臨床MPS 診斷，指導(dǎo)臨床治療及判斷預(yù)后，完善MPS 相關(guān)基因測(cè)序和家系驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)了尚未報(bào)道的復(fù)合雜合突變：母源性無(wú)義突變p.R327X 及父源性整碼突變p.H242delinsPLQVH。

2004 年p.R327X 首次作為新發(fā)位點(diǎn)出現(xiàn)在報(bào)道中，并被證實(shí)與嚴(yán)重的臨床表型存在相關(guān)性［16］。Suarez-Guerrero 等［20］在MPS Ⅵ的病理生理學(xué)、診斷和治療的相關(guān)研究中也指出p.R327X為病情快進(jìn)展突變，患者骨骼系統(tǒng)異常比較明顯，面部特征出現(xiàn)較早。本研究中患者生后3個(gè)月以脊柱發(fā)育異常為首發(fā)癥狀就診，癥狀出現(xiàn)在早期，骨骼系統(tǒng)異常明顯，與既往研究一致。患者同時(shí)存在語(yǔ)言發(fā)育障礙，智力測(cè)試提示輕度弱智，考慮因聽力受損及教育限制導(dǎo)致其語(yǔ)言及智力發(fā)育落后，盡管目前尚未發(fā)現(xiàn)ABSB 基因突變與智力發(fā)育之間的直接關(guān)系，但不能排除該患者另一突變位點(diǎn)的影響。通過(guò)SWISS-model 軟件建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，該無(wú)義突變導(dǎo)致ARSB多肽過(guò)早終止，產(chǎn)生無(wú)功能性截?cái)嗟鞍?，ARSB 基因編碼的溶酶體酶活性喪失，引起GAG 異常代謝，產(chǎn)生相關(guān)臨床表型［16］。結(jié)合ACMG 指南，c.979C＞T（p.R327X）初步判定為致病性變異（PVS1+PS1+PM2）。

His242 位于ARSB 蛋白具有α/β拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)并具有酶活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域內(nèi)，其變異可能影響ARSB酶活性［21］。本研究中p.H242delinsPLQVH與野生型相比，插入了4個(gè)新的堿基，導(dǎo)致氨基酸側(cè)鏈發(fā)生變化，原His242 與Tyr175、Glu243 之間的氫鍵消失，Pro242與Tyr175、Gln244與Glu247之間形成新的氫鍵，引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變。其可能的致病機(jī)制是氨基酸側(cè)鏈的變化引起非重復(fù)序列區(qū)域框內(nèi)小插入/缺失或終止密碼喪失引起蛋白長(zhǎng)度改變，導(dǎo)致溶酶體酶的缺陷，ARSB 酶活性較低，最終導(dǎo)致MPS Ⅵ。既往研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)伴隨同一染色體上的致病突變時(shí)，p.V358M 多態(tài)性可導(dǎo)致ARSB 活性的降低［22］。而已閱文獻(xiàn)中尚無(wú)p.H242R純合突變或單純雜合突變的病例報(bào)道，故推測(cè)p.H242delinsPLQVH 是否也可能同p.V358M 一樣，作為多態(tài)性位點(diǎn)與p.R327X 并存時(shí)致病。致病性分析表明c.724_725insCCCTTCAGGTCC（p.H242delinsPLQVH）為疑似致病性變異（PM2+PM3+PM4）。

本研究發(fā)現(xiàn)了1 例尚未報(bào)道過(guò)的復(fù)合雜合突變，其父源性突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，結(jié)合家系驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)該復(fù)合雜合突變?yōu)槌Ｈ旧w隱性遺傳，初步判定為可疑致病，但臨床表型與基因型間的相關(guān)性仍無(wú)法明確。本研究與既往大多ARSB基因突變位點(diǎn)研究相同，均止步于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)及相關(guān)軟件致病性預(yù)測(cè)，缺少進(jìn)一步功能驗(yàn)證，對(duì)臨床表型與基因型的相關(guān)性未能進(jìn)行確認(rèn)，基因突變的研究還需進(jìn)一步深入，探索基因治療的可能。但本研究新發(fā)現(xiàn)的復(fù)合雜合突變，擴(kuò)大了ARSB 的致病基因譜，指導(dǎo)患者臨床診治及預(yù)后判斷，基因診斷在罕見疾病診治中是不可或缺的手段。