人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法優(yōu)化保護(hù)劑提高羅伊氏乳桿菌抗凍性能

潘海博，覃璐琪，黃燕婷，梁曉琳，黃國(guó)宏，聶夢(mèng)琳，饒川艷，梅麗華，李全陽(yáng),

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530226）

羅伊氏乳桿菌是脊椎動(dòng)物腸道的天然共生菌[1]，可分泌非蛋白的羅伊氏素[2]、B族維生素[3]和抗炎性組胺[4]等多種物質(zhì)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制病原體，增強(qiáng)與腸上皮細(xì)胞的黏附調(diào)節(jié)宿主免疫能力[5-7]，已成為全世界消費(fèi)較高的膳食補(bǔ)充劑菌種之一[8]。目前國(guó)內(nèi)外益生菌的主要載體有發(fā)酵乳、活性乳飲料和凍干粉[9-10]。前兩者由于其豐富的營(yíng)養(yǎng)和獨(dú)特的口感受到眾多消費(fèi)者的青睞，但保質(zhì)期短且受冷藏儲(chǔ)運(yùn)的限制。真空冷凍干燥技術(shù)基于微生物的生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)，通過(guò)提高真空度使處于冰晶狀態(tài)的菌體在低溫條件下升華成干粉狀態(tài)，抑制代謝活性的同時(shí)維持了菌株原有特性[11]，制品不僅體積小、質(zhì)量輕，而且可以在常溫下較長(zhǎng)時(shí)間保持菌體的益生活性。物流和倉(cāng)儲(chǔ)價(jià)格低廉、菌株活力保持較好的特性，使其在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[12]。而凍干的瞬時(shí)低溫和高真空度的失水環(huán)境會(huì)使菌體活性呈現(xiàn)數(shù)量級(jí)下降甚至死亡[13]，經(jīng)濟(jì)損失和資源浪費(fèi)程度高。如何降低菌體在真空冷凍干燥過(guò)程中的損傷程度已成為目前亟待解決的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。

相關(guān)研究表明，導(dǎo)致乳酸菌凍干后失活死亡的主要原因有胞內(nèi)酶及相關(guān)蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞膜通透性增加、膜流動(dòng)性降低和核糖核酸結(jié)構(gòu)變化等[14]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)乳酸菌真空冷凍干燥過(guò)程的優(yōu)化主要集中在菌體的凍干存活率[15-17]，而提高抗凍性能的報(bào)道較少。Shekh等[18]發(fā)現(xiàn)，由菊粉、低聚果糖、乳果糖和脫脂乳組成的保護(hù)劑，對(duì)植物乳桿菌GP的保護(hù)效果最好，凍干存活率達(dá)（98±2.8）%。蔣文鑫等[19]發(fā)現(xiàn)，山梨糖醇、棉子糖與膠原蛋白以質(zhì)量比3∶3∶2組成，菌泥與保護(hù)劑質(zhì)量比為1∶1.2時(shí)，短雙歧桿菌的凍干存活率接近80%。譚莎莎等[20]發(fā)現(xiàn)，低聚糖較單糖、二糖、多糖、蛋白質(zhì)和聚合物而言，對(duì)羅伊氏乳桿菌的保護(hù)效果最為顯著，但不同低聚糖間差異不顯著。當(dāng)菌泥與保護(hù)劑干物質(zhì)的最優(yōu)質(zhì)量比為1∶1.2時(shí)，凍干存活率可達(dá)93.02%。何宗柏等[21]發(fā)現(xiàn)，在MRS培養(yǎng)基中添加0.1 g/L的油酸可維持細(xì)胞膜的完整性，降低β-半乳糖苷酶泄漏量和促進(jìn)脂肪酸合成，提高植物乳桿菌LIP-1的凍干存活率。通過(guò)添加不同類型的保護(hù)劑可有效改善菌體凍干微環(huán)境，緩解菌株凍干損傷，提高抗凍性能。研究表明，提高乳酸菌凍干抗逆性的保護(hù)劑類型有糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸和醇類等，將上述類型的保護(hù)劑進(jìn)行合理復(fù)配可使保護(hù)效率顯著提升。但保護(hù)劑成分復(fù)雜且與菌株存活率之間存在非線性關(guān)系，再加不同菌株對(duì)凍干的反應(yīng)特性不盡相同，所以常規(guī)回歸模型[22]篩選效果難盡人意。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)通過(guò)先自主學(xué)習(xí)試驗(yàn)結(jié)果、再進(jìn)行預(yù)測(cè)的方式為解決非線性函數(shù)關(guān)系的問(wèn)題提供了更好的選擇。而人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)缺少具體數(shù)學(xué)模型，多與模擬“自然選擇”壓力的遺傳算法結(jié)合求解最優(yōu)值[23-26]。

為此，本研究以提高羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）LTR1318在冷應(yīng)激下的抗凍性能為指標(biāo)，擬通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)保護(hù)劑的類型和添加量進(jìn)行優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法擬合出羅伊氏乳桿菌LTR1318的最佳凍干保護(hù)劑配方，并對(duì)使用該配方凍干后的菌體關(guān)鍵代謝酶活力和抗凍基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，以評(píng)價(jià)上述策略制備的保護(hù)劑對(duì)菌體抗凍性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅伊氏乳桿菌LTR1318分離自廣西巴馬健康百歲老人糞便，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號(hào)：CCTCC M 2019017）。

TPY培養(yǎng)基（水解酪蛋白10.0 g/L，大豆蛋白胨5.0 g/L，酵母粉2.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，L-半胱氨酸0.5 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgCl20.5 g/L，ZnSO40.25 g/L，CaCl20.15 g/L，F(xiàn)eCl30.000 001 g/L，瓊脂15.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L） 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蔗糖、海藻糖、低聚果糖、谷氨酸、天冬氨酸、抗壞血酸、大豆蛋白、谷胱甘肽、山梨糖醇 廣東康達(dá)生物科技有限公司；脫脂乳 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；細(xì)菌總RNA提取試劑盒、SYBR qPCR Master Mix 南京諾唯贊生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī) 上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司；LightCycler?96實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 上海羅氏制藥有限公司；Infinite MP200連續(xù)波長(zhǎng)多功能微孔檢測(cè)器瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的真空冷凍干燥及活菌數(shù)的測(cè)定

羅伊氏乳桿菌LTR1318經(jīng)TPY固體培養(yǎng)基活化后接種于TPY液態(tài)培養(yǎng)基中，接種量為2%。37 ℃恒溫培養(yǎng)14 h后，4 000 r/min、4 ℃離心15 min獲得濕菌泥并稱質(zhì)量。保護(hù)劑與菌泥按10∶1混合均勻后立即用自封帶封裝并于－80 ℃預(yù)凍4 h。預(yù)凍結(jié)束后立即放入真空冷凍干燥機(jī)凍干24 h，凍干條件為溫度－50 ℃，真空度＜15 Pa。將凍干粉復(fù)水于生理鹽水并進(jìn)行10 倍梯度稀釋，取100 μL由高到低3 個(gè)梯度下的稀釋液分別涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)基后計(jì)數(shù)。凍干存活率計(jì)算如下式所示：

式中：A1為冷凍干燥前的活菌數(shù)；A2為樣品冷凍干燥后的活菌數(shù)。

1.3.2 保護(hù)劑的單因素篩選

保護(hù)劑可按照類型分為糖類、氨基酸類、蛋白質(zhì)類和醇類。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)初步得到的結(jié)果，選取每個(gè)大類中凍干存活率最高的3 種保護(hù)劑為單因素篩選的因素。確定糖類為蔗糖2.0%、海藻糖2.0%和低聚果糖1.75%，氨基酸類為谷氨酸0.8%、天冬氨酸1.0%和抗壞血酸1.5%，蛋白質(zhì)為脫脂乳12%、大豆蛋白12%和谷胱甘肽4%，醇類為山梨糖醇1.0%、甘油1.0%和甘露醇1.25%。

1.3.3 徑向基函數(shù)（radial basis function，RBF）人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立

采用MATLAB R2019a中Neural Network Tool構(gòu)建RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。模型由一個(gè)輸入層、單隱含層和一個(gè)輸出層構(gòu)成。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的4 個(gè)因素低聚果糖、谷氨酸、脫脂乳和山梨糖醇添加量作為模型的輸入層，凍干結(jié)束后的菌株存活率為輸出層。隨即選取Box-Behnken試驗(yàn)組合中的23 個(gè)試驗(yàn)結(jié)果構(gòu)成模型的訓(xùn)練集，剩余6 個(gè)作為測(cè)試集樣本，以完成人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的自我學(xué)習(xí)訓(xùn)練和預(yù)測(cè)。本研究對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)的29 個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)劃分，數(shù)據(jù)集中的80%為訓(xùn)練集，20%為測(cè)試集。最大訓(xùn)練次數(shù)為100 次，學(xué)習(xí)步長(zhǎng)為0.05，學(xué)習(xí)目標(biāo)精度為10－5。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.4 遺傳算法尋優(yōu)設(shè)計(jì)

通過(guò)MATLAB的遺傳算法工具箱模擬物種的繁殖、雜交、變異、競(jìng)爭(zhēng)和選擇等自然現(xiàn)象以進(jìn)行遺傳算法尋優(yōu)。對(duì)凍干過(guò)程中的低聚果糖、谷氨酸、脫脂乳和山梨糖醇4 個(gè)因素在各自添加量范圍內(nèi)進(jìn)行人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬運(yùn)算，以模型擬合值建立個(gè)體適應(yīng)度函數(shù)進(jìn)行全局尋優(yōu)。菌株存活率越高，個(gè)體適應(yīng)度值越大。初始種群數(shù)、交叉概率、變異概率和進(jìn)化代數(shù)的取值根據(jù)實(shí)際進(jìn)行選取，其他參數(shù)選擇默認(rèn)值。

1.3.5 關(guān)鍵酶活力的測(cè)定

乳酸脫氫酶活力的測(cè)定參照李寶坤[27]的方法。具體如下：反應(yīng)體系3 mL，含有0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.3）、30 mmol/L丙酮酸鈉及6.6 mmol/L NADH，加入0.1 mL無(wú)細(xì)胞提取液進(jìn)行催化反應(yīng)，每0.5 min讀取一次，連續(xù)5 min，以吸光度對(duì)時(shí)間作圖，取初始的線性范圍，計(jì)算每分鐘降低的吸光度。以每分鐘降低1 個(gè)吸光度為1 個(gè)酶活力單位，以U表示。

β-半乳糖苷酶的測(cè)定采用崔樹(shù)茂[28]的方法并改進(jìn)。具體操作如下：取0.25 mL粗酶液，添加1.75 mL 0.05 mol/L鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenylβ-D-galactopyranoside，ONPG）溶液，混勻后在37 ℃條件下孵育5 min，添加1 mL Na2CO3溶液（濃度0.5 mol/L）終止反應(yīng)。然后測(cè)定420 nm波長(zhǎng)吸光度，反應(yīng)生成的鄰硝基酚（o-nitrodiphenol，ONP）通過(guò)ONP濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。每分鐘每克蛋白質(zhì)分解ONPG生成1 μmol ONP的量為1 個(gè)β-半乳糖苷酶活力單位。

1.3.6 冷脅迫應(yīng)激相關(guān)功能基因的挖掘

課題組前期已完成了羅伊氏乳桿菌LTR1318的全基因組測(cè)序，基因組序列已上傳美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI），登錄號(hào)為CP045049。根據(jù)文獻(xiàn)[29]的報(bào)道尋找與冷脅迫應(yīng)激壓力相關(guān)的編碼基因并注釋。

1.3.7 冷休克蛋白基因表達(dá)量的測(cè)定

使用細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取總RNA，具體操作按說(shuō)明書(shū)。根據(jù)基因組比對(duì)結(jié)果，利用Primer Premier 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)real-time PCR的特異性引物（F：5’-G TGTAGCGGTGGAATGCGTAGA AGGCACTGAAGGG CGGAAAC-3’），real-time PCR引物和16S rRNA內(nèi)參基因引物（R：5’-GTGAAAGTGGCGATGATGACGACAT TTGCTGCTTGA-3’）均由北京擎科生物有限公司合成。采用SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）試劑盒real-time PCR。反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR qPCR Master Mix10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，去離子水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。real-time PCR在StepOneTMreal-time PCR儀上進(jìn)行。以室溫下的表達(dá)量為空白對(duì)照，根據(jù)2－ΔΔCt法[30]測(cè)定冷脅迫下該基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)與圖像處理

Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)軟件用于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練和測(cè)試數(shù)據(jù)集的建立；OriginPro 2020和Graphpad Prism 7.0用于顯著性分析和作圖；MATLAB 2019a數(shù)學(xué)軟件進(jìn)行人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法尋優(yōu)代碼的實(shí)現(xiàn)。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保護(hù)劑對(duì)羅伊氏乳桿菌的保護(hù)效果

不同類型保護(hù)劑的復(fù)配可大幅度提高保護(hù)劑對(duì)菌株的保護(hù)作用。由圖1可知，低聚果糖1.75%、谷氨酸0.8%、脫脂乳12%和山梨糖醇1.0%對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318的凍干保護(hù)效果最好。菌株存活率較未添加保護(hù)劑顯著提高，存活率分別達(dá)到（38.47±3.63）%、（35.66±2.66）%、（44.68±4.35）%和（39.89±4.55）%。據(jù)此選擇低聚果糖、谷氨酸、脫脂乳和山梨糖醇作為進(jìn)一步優(yōu)化的試驗(yàn)因素。

圖1 不同保護(hù)劑對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318的凍干保護(hù)效果Fig.1 Effect of different protectants on the freeze-drying survival rate of L.reuteri LTR1318

2.2 RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有最佳逼近和全局最優(yōu)的性能，可將在低維空間內(nèi)的線性不可分問(wèn)題在高維空間內(nèi)線性可分[31]。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練和測(cè)試數(shù)據(jù)集見(jiàn)表2，模型的訓(xùn)練和預(yù)測(cè)效果見(jiàn)圖2。

表2 RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型訓(xùn)練和測(cè)試樣本數(shù)據(jù)集Table 2 Training and test set data of RBF artificial neural network

圖2A反映對(duì)訓(xùn)練樣本的訓(xùn)練情況，實(shí)際值和預(yù)測(cè)值重合度越高說(shuō)明訓(xùn)練效果越好。本研究訓(xùn)練集經(jīng)過(guò)50 次的學(xué)習(xí)訓(xùn)練后，R2達(dá)到0.984 4，說(shuō)明該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的擬合度較高，可以用于后續(xù)的測(cè)試；圖2B反映測(cè)試結(jié)束后程序自動(dòng)將剩余的測(cè)試集帶入模型進(jìn)行測(cè)試的結(jié)果，除第5個(gè)樣本出現(xiàn)較大偏離外，整體預(yù)測(cè)趨勢(shì)良好，可以用來(lái)進(jìn)行菌株凍干存活率的后續(xù)模擬。

圖2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練樣本（A）與測(cè)試樣本（B）中的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值對(duì)比結(jié)果Fig.2 Comparison of actual (A) and predicted (B) values for training and test sets of artificial neural network

2.3 遺傳算法尋優(yōu)

遺傳算法通過(guò)計(jì)算機(jī)程序模擬優(yōu)勝劣汰的自然法則，對(duì)目的函數(shù)進(jìn)行計(jì)算。本研究設(shè)定的最大遺傳代數(shù)50，變量的二進(jìn)制位數(shù)為8。遺傳算法對(duì)RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全局尋優(yōu)的過(guò)程見(jiàn)圖3，模型預(yù)測(cè)最優(yōu)條件下的結(jié)果驗(yàn)證見(jiàn)表3。

圖3 遺傳算法50 次迭代尋優(yōu)結(jié)果Fig.3 Results of optimization with 50 iterations of genetic algorithm

表3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法與響應(yīng)面優(yōu)化模型下的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值比較Table 3Comparison of optimization results of ANN-GA and RSM for protectants

圖3縱坐標(biāo)為每代變異存活率最優(yōu)值。適應(yīng)度曲線經(jīng)歷了向下數(shù)次的迭代尋優(yōu)，個(gè)體適應(yīng)度所處平臺(tái)時(shí)間逐步延長(zhǎng)。這表明個(gè)體的適應(yīng)能力隨著適應(yīng)度函數(shù)的減小而增強(qiáng)。通過(guò)運(yùn)行遺傳算法程序，模擬生物進(jìn)化過(guò)程中的選擇、交叉、變異等自然選擇壓力，在經(jīng)過(guò)近40 代的遺傳模擬后，適應(yīng)度曲線最終趨于平穩(wěn)，尋得最優(yōu)值，最終得到模型擬合預(yù)測(cè)的最大存活率為100.78%，此存活率下的保護(hù)劑組成為：脫脂乳10.93%，谷氨酸1.20%，低聚果糖1.29%和山梨糖醇0.80%。實(shí)際驗(yàn)證選擇保護(hù)劑的添加量分別為10.90%、1.20%、1.30%和0.80%，測(cè)得凍干存活率為（95.74±5.07）%。響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的最大預(yù)測(cè)凍干存活率為96.64%，最優(yōu)條件下的實(shí)測(cè)凍干存活率為（86.87±5.06）%。就最大值預(yù)測(cè)和實(shí)際值而言，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法優(yōu)化的凍干存活率較響應(yīng)面模型分別提高了4.14%和8.87%。

2.4 保護(hù)劑對(duì)低溫脅迫下關(guān)鍵酶活力的影響

乳酸脫氫酶是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，該酶活力大小直接影響菌株的產(chǎn)酸能力和代謝能力，該酶的失活是凍干過(guò)程菌株存活率降低的主要原因。β-半乳糖苷酶作為乳酸菌分解乳糖的重要酶，其活力可以直接反映乳酸細(xì)胞膜的通透性的變化情況。如圖4所示，乳酸脫氫酶和β-半乳糖苷酶在無(wú)保護(hù)劑下活力分別為（11.58±1.65）U和（2.67±0.56）U，加入保護(hù)劑的酶活力分別達(dá)到（17.74±2.85）U和（12.10±2.19）U。無(wú)保護(hù)劑的菌株在凍干后，乳酸脫氫酶和β-半乳糖苷的酶活力分別只有常溫下的51.08%和19.07%。與未添加保護(hù)劑相比，保護(hù)劑的加入使得菌體的乳酸脫氫酶和β-半乳糖苷酶活力顯著增加，分別提升53.19%和3.53 倍。加入保護(hù)劑凍干后，與常溫下酶活力相比，菌體的酶活力分別是原來(lái)的78.25%和86.43%。蔣艾廷等[32]也通過(guò)優(yōu)化噴霧干燥過(guò)程中的德氏乳桿菌保護(hù)劑，提高了ATP酶、己糖激酶與乳酸脫氫酶的活力，降低了噴霧干燥對(duì)德氏乳桿菌的損傷作用。結(jié)果表明，本研究復(fù)配的保護(hù)劑有效降低了冷應(yīng)激對(duì)菌體關(guān)鍵代謝酶活力的影響。

圖4 保護(hù)劑對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318關(guān)鍵酶活力的影響Fig.4 Effects of protectants on key enzyme activities of L.reuteri LTR1318

2.5 冷脅迫應(yīng)激相關(guān)功能基因的挖掘

環(huán)境溫度驟降會(huì)導(dǎo)致微生物生理代謝異常，此時(shí)細(xì)胞會(huì)自發(fā)響應(yīng)冷脅迫產(chǎn)生冷應(yīng)激蛋白和蛋白酶，從而提高酶活力、穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、維持DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄、翻譯功能，降低冷凍干燥對(duì)乳酸菌的損傷[33]。通過(guò)羅伊氏乳桿菌LTR1318的全基因組序列挖掘與冷脅迫應(yīng)激相關(guān)的同源蛋白，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 與冷脅迫應(yīng)激相關(guān)的功能基因注釋結(jié)果Table 4 Results of functional annotation of genes related to cold stress

由表4可知，羅伊氏乳桿菌LTR1318的基因組上存在2 個(gè)冷休克蛋白和3 個(gè)熱休克蛋白的編碼基因。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)F9294_RS08130編碼的冷休克蛋白與同菌屬的羅伊氏乳桿菌DSM 20016的休克蛋白一致性較高（99%），屬于目前已知的冷休克蛋白。DEAD-Box蛋白是RNA解旋酶中的一種，所需活化能較低，在低溫下更加活躍，與冷脅迫密切相關(guān)[34]。3 個(gè)預(yù)測(cè)到的熱休克蛋白分別是低分子質(zhì)量熱休克蛋白、熱休克蛋白X和熱誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白。相關(guān)研究表明，熱激處理可以降低細(xì)胞膜透性，提高自身抗冷性[35]。

2.6 冷休克蛋白基因表達(dá)量的變化

根據(jù)基因組對(duì)冷脅迫相關(guān)基因的挖掘結(jié)果設(shè)計(jì)冷休克蛋白real-time PCR的特異性引物，將編碼基因在凍干前后表達(dá)量作為保護(hù)劑對(duì)菌體保護(hù)效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，室溫下表達(dá)量作為空白對(duì)照。由圖5可知，實(shí)驗(yàn)組中冷休克蛋白基因的表達(dá)量在凍干前后均有顯著性差異，較室溫對(duì)照分別上調(diào)18.35 倍和16.90 倍。保護(hù)劑的加入可小幅上調(diào)冷休克蛋白的基因表達(dá)量（上調(diào)8.29%），但與不含保護(hù)劑組相比無(wú)顯著差異。

圖5 不同保護(hù)劑對(duì)菌體冷休克蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of the optimized protectant on relative expression of Cold shock protein gene

3 討 論

真空冷凍干燥過(guò)程雖然會(huì)引起菌體的失活甚至死亡，但仍是目前乳酸菌應(yīng)用和貯藏的主要方式。本研究先選定預(yù)凍條件和凍干工藝等其他影響因素，著重探討保護(hù)劑對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318抗凍性能的影響。

細(xì)胞失水是乳酸菌凍干過(guò)程中經(jīng)歷的主要過(guò)程。以糖類為代表的多羥基化合物能夠代替原有水分子的位置并包裹在蛋白表面，維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[36]。譚莎莎等[20]以分子質(zhì)量為篩選依據(jù)，發(fā)現(xiàn)低聚糖較單糖、二糖、多糖、蛋白質(zhì)和聚合物對(duì)羅伊氏乳桿菌的保護(hù)效果更為顯著，而不同低聚糖間差異不顯著，優(yōu)化后的菌體凍干存活率為93.02%。本研究低聚果糖顯示了比經(jīng)典保護(hù)劑蔗糖和海藻糖更高的保護(hù)效率，與譚沙沙等[20]的結(jié)論一致。擴(kuò)培羅伊氏乳桿菌LTR1318時(shí)發(fā)現(xiàn)，低聚果糖的增菌效果強(qiáng)于其他碳源。這種低聚果糖的高代謝活性可能會(huì)加速其在細(xì)胞內(nèi)的積累，從而更高效地保護(hù)菌體。同時(shí)，低聚果糖作為一種效果明確的益生元[37]，可與菌體協(xié)同增強(qiáng)益生菌在宿主菌群的定植[38]。研究表明，凍干時(shí)的細(xì)胞失水速率對(duì)其活性有顯著影響。氨基酸可通過(guò)維持冰點(diǎn)下水的表面張力平衡細(xì)胞內(nèi)外的水交換速率，降低冰晶對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷[39]。與天冬氨酸和抗壞血酸相比，谷氨酸保留小部分水維持細(xì)胞活性的特點(diǎn)可能提高了氨基酸對(duì)LTR1318的保護(hù)作用。該結(jié)果也與李冰等[40]通過(guò)谷氨酸聚合物提高蛋白質(zhì)凍干穩(wěn)定性的研究結(jié)論一致。目前有關(guān)蛋白質(zhì)增強(qiáng)凍干存活率的報(bào)道表明[41-43]，蛋白質(zhì)可通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、減少?gòu)?fù)水對(duì)細(xì)胞膜的沖擊，提高乳酸菌凍干存活率；也有報(bào)道表明大分子保護(hù)劑并不能滲透進(jìn)細(xì)胞壁[20]，無(wú)法有效保護(hù)細(xì)胞膜功能和完整性。而本研究的脫脂乳作為蛋白質(zhì)類保護(hù)劑，對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318有較好的保護(hù)效果。本研究確定的保護(hù)劑配方能夠有效提高乳酸菌降低低溫和真空等不利環(huán)境對(duì)細(xì)胞膜的損傷，達(dá)到保護(hù)菌體的作用。

合理的復(fù)配方式有助于保護(hù)劑間的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，更大程度地發(fā)揮保護(hù)效果。目前在發(fā)酵領(lǐng)域應(yīng)用較多的回歸模型和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分別是響應(yīng)面和誤差逆向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，而RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用較少。與響應(yīng)面通過(guò)回歸分析預(yù)測(cè)的方式相比，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)不需使用數(shù)學(xué)模型，而是通過(guò)已有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行自我學(xué)習(xí)、訓(xùn)練，從而得出結(jié)果。有研究表明，RBF模型比BP模型有更快的收斂速度且更能逼近函數(shù)的最優(yōu)值[44]。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通常需要較大訓(xùn)練數(shù)據(jù)量，而本研究29 組RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練數(shù)據(jù)仍然使模型的擬合度接近0.98。較響應(yīng)面模型而言，經(jīng)過(guò)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法優(yōu)化的預(yù)測(cè)凍干存活率提高了4.14%，實(shí)際凍干存活率提高近9%，在工業(yè)生產(chǎn)中有實(shí)際意義。

除從外部環(huán)境干預(yù)菌株的抗凍能力，菌體適應(yīng)環(huán)境驟變時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)對(duì)自身的存活也起到關(guān)鍵作用。針對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318個(gè)體冷應(yīng)激的耐受性，本研究結(jié)合乳酸菌基因組學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，與LTR1318適應(yīng)冷脅迫相關(guān)的應(yīng)激蛋白有冷休克蛋白和熱休克蛋白兩種。目前報(bào)道的通過(guò)熱休克蛋白影響抗凍性能的研究主要與植物耐冷有關(guān)，而對(duì)乳酸菌抗凍性能影響的研究相對(duì)缺乏。郭麗紅等[45]發(fā)現(xiàn)熱激處理能夠提高冷脅迫條件下玉米幼苗的主要抗氧化酶活性，減少質(zhì)膜透性的增加程度，提高玉米幼苗的抗冷性能；黃上志等[46]發(fā)現(xiàn)萌發(fā)的水稻種子經(jīng)42 ℃熱激處理后，幼苗耐冷性明顯增強(qiáng)，并且熱激誘導(dǎo)萌發(fā)的水稻胚合成的熱休克蛋白與水稻幼苗耐寒性的提高有關(guān)。另外，無(wú)保護(hù)劑添加的羅伊氏乳桿菌LTR1318在經(jīng)過(guò)冷凍干燥后，冷休克蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量較高，表明該菌株個(gè)體擁有較強(qiáng)的冷脅迫適應(yīng)能力。

4 結(jié) 論

本研究以高活性羅伊氏乳桿菌凍干菌粉為制備目標(biāo)，采用RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與遺傳算法結(jié)合的新手段，獲得了一種可以有效提高菌株活性和抗凍能力的工藝配方：脫脂乳10.90%、谷氨酸1.20%、低聚果糖1.30%和山梨糖醇0.90%。結(jié)合菌株抗凍的表型和基因型，對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318抗凍的遺傳學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行初步探索。經(jīng)過(guò)與國(guó)內(nèi)外報(bào)道對(duì)比，本研究通過(guò)人工網(wǎng)絡(luò)模型提高乳酸菌抗凍性能并從基因組學(xué)角度給出菌株自身抗凍性能的遺傳基礎(chǔ)，這些技術(shù)和理論對(duì)乳酸菌凍干制劑的制備和真空冷凍干燥技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)作用和參考價(jià)值。