采前苯丙噻重氮噴灑抑制采后雙孢菇的軟化

魏亞楠，Esrat Mahmud SILVY，彭 慧，楊 乾，王 霆，贠建民，畢 陽

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

雙孢菇是全球種植范圍最廣、產(chǎn)量最大的食用菌[1]。但雙孢菇在采后貯藏、運(yùn)輸和銷售期間極易軟化，對銷售品質(zhì)影響很大[2]。針對雙孢菇采后軟化的問題，前人開發(fā)了多種控制措施，除控制采后溫度和氣調(diào)包裝外，一些化學(xué)藥物也表現(xiàn)出一定的控制效果[3]。但由于采后雙孢菇對浸泡處理非常敏感，遇水后會加速褐變。因此，亟需開發(fā)有效控制雙孢菇軟化的非采后浸泡方法。有報(bào)道表明，1-甲基環(huán)丙烯熏蒸可抑制雙孢菇中蛋白質(zhì)的分解，維持蛋白質(zhì)含量，有效延緩軟化[4]。薄荷精油熏蒸能減少雙孢菇采后質(zhì)量損失，維持可溶性蛋白質(zhì)和總糖含量，保持較高的白度、硬度和感官特性[5]。O3熏蒸可抑制雙孢菇代謝，推遲呼吸高峰的出現(xiàn)，延緩采后軟化[6]。苯丙噻重氮（benzothiadiazole，BTH）是水楊酸（salicylic acid，SA）的類似物，也是第一個(gè)人工合成并商業(yè)化的誘抗劑，可誘導(dǎo)多種果蔬的采后抗病性[7]。除了誘導(dǎo)抗性的作用外，BTH處理可維持厚皮甜瓜果實(shí)的采后硬度，提高果實(shí)采后品質(zhì)[8]。采前BTH噴灑可有效維持采后桃果實(shí)硬度[9]。采前使用SA和乙酰水楊酸噴灑可有效保持甜櫻桃的采后硬度[10]。BTH結(jié)合不同包裝材料能有效降低金針菇呼吸強(qiáng)度、抑制丙二醛的產(chǎn)生、減少質(zhì)量損失，提高貯藏品質(zhì)[11]。另有研究結(jié)果表明，采前茉莉酸甲酯噴灑可有效減輕采后雙孢菇的質(zhì)量損失，保持質(zhì)地，提高外觀品質(zhì)，延長貨架期[12]。因此推測采前BTH處理對維持雙孢菇采后品質(zhì)具有積極的作用。盡管已有采后BTH處理維持金針菇貯藏品質(zhì)以及采前茉莉酸甲酯噴灑控制雙孢菇采后軟化的報(bào)道，但采前BTH噴灑對采后雙孢菇質(zhì)地的影響尚鮮見報(bào)道。本研究采用BTH在雙孢菇生長的原基期（雙孢菇菌蓋為針頭大小時(shí)）進(jìn)行噴灑，分析采收時(shí)及低溫貯藏期間的質(zhì)地，測定細(xì)胞壁組分含量及相關(guān)酶活力，以期為維持雙孢菇采后質(zhì)地提供方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試‘A15’雙孢菇（Agaricus bisporuscv. A15）種植于甘肅省金沃森生物有限公司，田間管理措施參照工廠化生產(chǎn)的雙孢菇種植規(guī)程。

BTH（純度≥98%） 美國Sigma-Aldrich公司；微生物纖維素試劑盒、微生物幾丁質(zhì)試劑盒、微生物總蛋白試劑盒、微生物纖維素酶試劑盒、微生物幾丁質(zhì)酶試劑盒、微生物中性蛋白酶試劑盒、微生物堿性蛋白酶試劑盒、微生物酸性蛋白酶試劑盒 上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

美工刀 日本OLFA SAC-1公司；A 11 basic S025研磨機(jī) 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；TA.XT plus型質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；DW-HL388型超低溫冷凍儲存箱 中國中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；1510型酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 雙孢菇采前BTH處理及采后貯藏

參照Zhang Zhengke等[13]的方法。將BTH直接溶于自來水中，制備成200 mg/L溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.05%Tween-80）。在一潮菇的原基期進(jìn)行噴灑，每2 L藥液處理1 塊菇床（1.3 m×1.6 m）。每組處理噴灑1 個(gè)菇床，重復(fù)3 次，以自來水（含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80）作為對照。

噴灑后7 d開始采收。采摘后隨即放入預(yù)冷庫－10 ℃預(yù)冷0.5 h后，轉(zhuǎn)移至4 ℃冷庫。揀選大小均勻（菌蓋直徑3 cm左右）、色澤一致、朵型完整、菇蓋圓潤、無病害無損傷的雙孢蘑菇子實(shí)體裝至保鮮盒（15 cm×10 cm×8 cm），每盒裝蘑菇7 個(gè)，將每個(gè)保鮮盒用聚乙烯保鮮膜（厚20 μm）完全密封后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃下貯藏，分別于貯藏的0、2、4、8、12、16、20 d取樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 質(zhì)量損失率的測定

質(zhì)量損失率的測定采用稱質(zhì)量法[14]。在貯藏過程中將雙孢菇從冷庫中取出稱質(zhì)量，按下式計(jì)算質(zhì)量損失率。每處理用雙孢菇8 盒，重復(fù)3 次。

1.3.2.2 菌蓋質(zhì)構(gòu)特性的測定

參照Kotwaliwale等[15]的方法，將雙孢菇菌蓋（1 cm×1 cm×1 cm）置于質(zhì)構(gòu)儀臺面，選用P/36R探頭進(jìn)行質(zhì)地多面剖析（texture profile analysis，TPA）實(shí)驗(yàn)。參數(shù)設(shè)置：預(yù)壓速率、下壓速率、壓后上行速率均為5 mm/s，兩次壓縮中間停頓10 s，試樣壓縮比為40%，觸發(fā)力為5 N。測定參數(shù)包括硬度、彈性、咀嚼性和膠著性。每處理用雙孢菇7 個(gè)，重復(fù)3 次。

1.3.2.3 菌蓋生化指標(biāo)的測定

將雙孢菇從冷庫中取出，用美工刀取垂直于菌蓋表皮1 cm深的組織，液氮冷凍后用研磨機(jī)研成粉末裝在離心管中，在－80 ℃超低溫冷凍儲存箱中保存，用于測定生化指標(biāo)。

纖維素、幾丁質(zhì)、總蛋白含量和纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶活力均采用按照相應(yīng)酶聯(lián)免疫試劑盒說明書進(jìn)行測定。結(jié)果均以組織鮮質(zhì)量計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

各指標(biāo)測定至少重復(fù)3 次。所有數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Duncan’s差異顯著性分析和Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05表示差異顯著，使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前BTH噴灑對冷藏期間雙孢菇質(zhì)量損失率的影響

質(zhì)量損失是影響雙孢菇質(zhì)地的重要因素。由圖1可知，貯藏期間，BTH處理組和對照組雙孢菇質(zhì)量損失率均逐漸升高，BTH處理組雙孢菇的質(zhì)量損失率在貯藏中期（4～12 d）顯著低于對照組，第8天時(shí)比對照組低34.22%（P＜0.05）。質(zhì)量損失率的分析結(jié)果表明，采前BTH噴灑顯著降低了冷藏期間雙孢菇的質(zhì)量損失。

圖1 采前BTH噴灑對冷藏期間雙孢菇質(zhì)量損失率的影響Fig. 1 Effect of pre-harvest BTH spraying on mass loss rate of A. bisporus during cool storage

2.2 采前BTH噴灑對冷藏期間雙孢菇菌蓋質(zhì)地的影響

硬度、彈性、咀嚼性和膠著性是反映質(zhì)地的重要指標(biāo)，剛采收時(shí)雙孢菇菌蓋緊實(shí)，隨著貯藏時(shí)間的延長，菌蓋逐漸自溶軟化。由圖2可知，與對照組相比，采前BTH噴灑顯著提高了采收時(shí)（0 d）的雙孢菇菌蓋硬度、彈性、咀嚼性和膠著性（P＜0.05）。貯藏的前8 d，BTH處理組和對照組的菌蓋硬度、咀嚼性和膠著性迅速降低，但BTH處理組菌蓋硬度、咀嚼性和膠著性均顯著高于對照組（P＜0.05）。貯藏8 d后BTH處理組和對照組的菌蓋硬度、咀嚼性和膠著性下降速度趨于平緩，且兩組之間無顯著差異。貯藏期間，BTH處理組和對照組的菌蓋彈性緩慢降低，在前8 d，BTH處理組菌蓋彈性顯著高于對照組（P＜0.05），8 d后BTH處理組與對照組間無顯著差異。上述結(jié)果表明，采前BTH處理有效延緩了采收時(shí)以及冷藏期間雙孢菇菌蓋的硬度、彈性、咀嚼性和膠著性的下降。

圖2 采前BTH噴灑對冷藏期間雙孢菇菌蓋硬度（A）、彈性（B）、咀嚼性（C）和膠著性（D）的影響Fig. 2 Effect of pre-harvest BTH spraying on firmness (A), flexibility (B),chewiness (C) and gumminess (D) of A. bisporus caps during cool storage

2.3 采前BTH噴灑對冷藏期間雙孢菇菌蓋幾丁質(zhì)酶、纖維素酶活力以及幾丁質(zhì)、纖維素含量的影響

纖維素和幾丁質(zhì)是雙孢菇細(xì)胞壁的主要成分，纖維素酶和幾丁質(zhì)酶分別是這兩種成分的降解酶。采收時(shí)，BTH處理組菌蓋的幾丁質(zhì)酶活力顯著低于對照組（P＜0.05）；貯藏期間，BTH處理組和對照組菌蓋的幾丁質(zhì)酶活力均逐漸上升，BTH處理組菌蓋的幾丁質(zhì)酶活力在貯藏中后期顯著低于對照組，第16天時(shí)比對照組低23.37%（P＜0.05）（圖3A）。采收時(shí)，BTH處理組菌蓋的幾丁質(zhì)含量略高于對照組，但無顯著差異；貯藏期間，BTH處理組和對照組的幾丁質(zhì)含量逐漸降低，BTH處理組菌蓋的幾丁質(zhì)含量除第4天外均顯著高于對照組（P＜0.05）（圖3B）。采收時(shí)，BTH處理組菌蓋的纖維素酶活力顯著低于對照組（P＜0.05）；貯藏期間，BTH處理組和對照組菌蓋的纖維素酶活力均逐漸上升，BTH處理組菌蓋的纖維素酶活力除第20天外均顯著低于對照組（P＜0.05）（圖3C）。采收時(shí)，BTH處理組菌蓋的纖維素含量顯著高于對照組（P＜0.05）；貯藏期間，BTH處理組和對照組菌蓋的纖維素含量逐漸下降，除4 d和8 d外，BTH處理組菌蓋的纖維素含量均顯著高于對照組（P＜0.05）（圖3D）。上述結(jié)果表明，采前BTH噴灑有效抑制了采收時(shí)和冷藏期間雙孢菇的幾丁質(zhì)酶和纖維素酶活力，延緩了幾丁質(zhì)和纖維素的降解。

圖3 BTH采前噴灑對冷藏期間雙孢菇菌蓋幾丁質(zhì)酶活力（A）、幾丁質(zhì)含量（B）、纖維素酶活力（C）和纖維素含量（D）的影響Fig. 3 Effect of pre-harvest BTH spraying on chitinase activity (A),chitin content (B), cellulase activity (C) and cellulose content (D)in A. bisporus caps during cool storage

2.4 采前BTH噴灑對冷藏期間雙孢菇中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶活力以及總蛋白含量的影響

蛋白質(zhì)是雙孢菇細(xì)胞壁的主要成分，蛋白酶則參與蛋白質(zhì)的降解。采收時(shí)，BTH處理組菌蓋的中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力顯著低于對照組（P＜0.05），堿性蛋白酶活力與對照組無顯著差異。貯藏期間，BTH處理組和對照組菌蓋的中性蛋白酶活力基本穩(wěn)定，BTH處理組在貯藏后期中性蛋白酶活力顯著低于對照組（P＜0.05）（圖4A）。貯藏期間，BTH處理組和對照組菌蓋的堿性蛋白酶活力呈雙峰型變化，BTH處理組總體顯著低于對照組，第8天時(shí)，比對照組低20.58%（P＜0.05）（圖4B）。BTH處理組和對照組菌蓋的酸性蛋白酶活力隨貯藏時(shí)間的延長呈先升高后降低的趨勢，BTH處理組顯著低于對照組，第16天時(shí)比對照組低38.94%（P＜0.05）（圖4C）。采收時(shí)，BTH處理組菌蓋的總蛋白含量顯著高于對照組，貯藏期間，BTH處理組和對照組菌蓋的總蛋白含量逐漸減少，BTH處理組均顯著高于對照組（P＜0.05）（圖4D）。上述結(jié)果表明，與對照組相比，采前BTH噴灑有效降低了采收時(shí)和冷藏期間雙孢菇中性、堿性和酸性蛋白酶活力，延緩了蛋白質(zhì)的降解。

圖4 BTH采前噴灑對冷藏期間雙孢菇菌蓋的中性蛋白酶（A）、堿性蛋白酶（B）和酸性蛋白酶（C）活力以及總蛋白含量（D）的影響Fig. 4 Effect of pre-harvest BTH spraying on the activity of neutral protease (A), alkaline protease (B) and acid proteinase (C), and total protein content (D) in A. bisporus caps during cool storage

2.5 雙孢菇菌蓋質(zhì)構(gòu)指標(biāo)與幾丁質(zhì)、纖維素和總蛋白含量以及質(zhì)量損失率之間的相關(guān)性分析結(jié)果

為了驗(yàn)證與雙孢菇軟化相關(guān)的8 個(gè)指標(biāo)（菌蓋硬度、彈性、咀嚼性、膠著性4 個(gè)質(zhì)構(gòu)指標(biāo)與幾丁質(zhì)含量、纖維素含量、總蛋白含量、質(zhì)量損失率）之間的關(guān)系，對其進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析。由表1可知，這8 個(gè)指標(biāo)間均呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）。其中硬度、彈性、咀嚼性、膠著性與幾丁質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.840、0.957、0.849、0.876，與纖維素含量呈極顯著正相關(guān)，r分別為0.784、0.888、0.772、0.812，與總蛋白含量呈極顯著正相關(guān)，r分別為0.644、0.783、0.633、0.678，與質(zhì)量損失率呈極顯著負(fù)相關(guān)，r分別為－0.855、－0.939、－0.853、－0.881。上述分析表明，雙孢菇采后質(zhì)地軟化是細(xì)胞壁各組分共同降解的結(jié)果，質(zhì)量損失會加速軟化。

表1 雙孢菇菌蓋質(zhì)構(gòu)指標(biāo)與幾丁質(zhì)、纖維素和總蛋白含量以及質(zhì)量損失率之間的相關(guān)性Table 1 Correlations between texture properties of A. bisporus caps and the contents of chitin, cellulose and protein, as well as mass loss rate

3 討 論

軟化是雙孢菇采后的典型質(zhì)地變化現(xiàn)象，表現(xiàn)為菌蓋組織松散、硬度明顯降低[4]。雙孢菇的細(xì)胞壁主要由幾丁質(zhì)、纖維素和蛋白質(zhì)組成，大多數(shù)幾丁質(zhì)靠近細(xì)胞質(zhì)膜，β-葡聚糖穿插于整個(gè)細(xì)胞壁[16]，蛋白質(zhì)緊緊地交織在幾丁質(zhì)和葡聚糖基結(jié)構(gòu)基質(zhì)中[17]。分布在細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)通常與多糖交聯(lián)形成糖蛋白[18]。雙孢菇采后體內(nèi)幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和蛋白酶活化，相應(yīng)的細(xì)胞壁組分水解，最終導(dǎo)致軟化[19]。

幾丁質(zhì)是由多個(gè)N-乙?；咸烟菃卧M成的長鏈聚合物[20]，為真菌細(xì)胞壁提供支撐與保護(hù)[21]。幾丁質(zhì)在幾丁質(zhì)酶和β-N-乙酰己糖胺酶協(xié)同作用下降解[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，采前BTH噴灑降低了雙孢菇采收時(shí)和冷藏期間的幾丁質(zhì)酶活性，增加了幾丁質(zhì)含量。有報(bào)道表明，乙烯可誘導(dǎo)菠蘿幾丁質(zhì)酶的合成[23]和柿子果實(shí)細(xì)胞壁的降解，加速果實(shí)軟化[24]。由于BTH處理可以抑制厚皮甜瓜的乙烯釋放[8]。因此，BTH可能通過抑制乙烯的生成來減少幾丁質(zhì)酶對雙孢菇細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的降解。纖維素是葡萄糖通過1,4-糖苷鍵連接而成的直鏈高分子化合物[25]，纖維素在纖維素酶的作用下進(jìn)行水解[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，采前BTH噴灑顯著降低了采收時(shí)和冷藏期間雙孢菇的纖維素酶活性，減緩了纖維素的分解。該結(jié)果與SA處理顯著抑制香梨果實(shí)纖維素酶活性、減緩纖維素含量的下降的結(jié)果[27]類似。由于纖維素酶的活性也受乙烯的調(diào)控[28]，因此，BTH可能通過抑制乙烯的合成來減少纖維素酶對雙孢菇細(xì)胞壁纖維素的降解。蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鏈酶的總稱，按其反應(yīng)的最適pH值分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶3 類，酸性蛋白酶的活性中心通常含有2 個(gè)天冬氨酸殘基，屬于天冬氨酸蛋白酶，最適pH值為2.5～5.0，最適反應(yīng)溫度為30～50 ℃[29]。中性蛋白酶的活性中心往往含有Zn2＋，屬于金屬蛋白酶，活性依賴于其含有的二價(jià)金屬陽離子[30]。已發(fā)現(xiàn)的微生物堿性蛋白酶活性中心大多含有絲氨酸，屬于絲氨酸蛋白酶，大多數(shù)堿性蛋白酶的最適pH值在9.0～11.0之間[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，采前BTH噴灑顯著降低了采收時(shí)和冷藏期間雙孢菇酸性、中性和堿性蛋白酶的活性，增加了蛋白質(zhì)的含量。該結(jié)果與BTH處理增加甜瓜葉片可溶性蛋白含量的結(jié)果[32]類似。由于蛋白酶的活性也受乙烯的調(diào)控[33]，因此，BTH可能通過抑制乙烯的合成來減少蛋白酶對雙孢菇細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的降解。至于BTH如何通過調(diào)控乙烯產(chǎn)生來抑制雙孢菇幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和蛋白酶的活性尚有待進(jìn)一步研究。

質(zhì)量損失影響雙孢菇的軟化，質(zhì)量損失率越大，軟化越嚴(yán)重[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，采前BTH噴灑顯著降低了冷藏期間雙孢菇的質(zhì)量損失率，該結(jié)果與BTH處理抑制厚皮甜瓜質(zhì)量損失率的結(jié)果[8]類似。蒸騰失水和呼吸消耗是導(dǎo)致雙孢菇采后質(zhì)量損失的主要原因[29,35]。有報(bào)道表明，采前BTH處理會增加甜瓜果實(shí)表面保護(hù)組織的厚度，從而減少水分蒸騰[36]。BTH處理會抑制金針菇的呼吸強(qiáng)度，從而減少底物的消耗[11]。因此，推測采前BTH噴灑可能通過增加雙孢菇表面保護(hù)組織的厚度以及抑制雙孢菇的呼吸強(qiáng)度來降低冷藏期間的質(zhì)量損失率。至于BTH處理如何影響雙孢菇表面保護(hù)組織以及菇體呼吸強(qiáng)度尚有待進(jìn)一步揭示。

本實(shí)驗(yàn)中，與對照相比，采前BTH噴灑能顯著降低采后雙孢菇冷藏期間的質(zhì)量損失率，提高采收時(shí)以及冷藏期間雙孢菇的硬度、彈性、咀嚼性和膠著性，降低冷藏期間雙孢菇的幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和蛋白酶活性，延緩細(xì)胞壁組分幾丁質(zhì)、纖維素和蛋白質(zhì)的降解，維持冷藏期間雙孢菇的質(zhì)地。鑒于BTH的安全性以及原基期噴灑簡便的特點(diǎn)，該方法可作為一種有效維持雙孢菇采后質(zhì)地的措施。