廣西甘蔗白條病的初步鑒定與病原菌分離

黃冬梅，李秋芳，周先瑤，顏梅新，宋修鵬，梁永檢，王澤平，雷敬超，潘如科，張小秋

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點實驗室/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530007；2.荔浦市經(jīng)濟(jì)作物站，廣西 荔浦 546600；3.廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 崇左 532415；

4.平果市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，廣西 平果 531400）

0 引言

甘蔗白條病是一種由白條黃單胞桿菌（Xanthomonasalbilineans（Ashby）Dowson）引起的細(xì)菌性維管束病害。蔗株染病后可引起全株甘蔗死亡，嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量。病發(fā)生嚴(yán)重時可使甘蔗產(chǎn)量損失10%~30%，且30%以上的蔗汁質(zhì)量嚴(yán)重下降。該病害主要通過帶菌種莖和砍收工具傳播，蔗地一旦有植株發(fā)病，該病菌即可迅速傳播蔓延［1-2］。據(jù)報道該病菌可用以下特異性引XAF：15'-CCTGGTGATGACGCTGGGTT-3'和XAR：15'-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3'；進(jìn)行PCR擴增，得到片段長度為600bp的產(chǎn)物［3］。中國是世界第三大糖料蔗生產(chǎn)國，廣西是我國第一產(chǎn)糖大省，年產(chǎn)糖量占全國65%以上［4］。2017年，Zhanget al.首次報道廣西蔗區(qū)發(fā)生甘蔗白條病為害，在廣西的北海、來賓和百色地區(qū)部分甘蔗品種（系）發(fā)生嚴(yán)重，高感品種桂糖46號和桂糖06-2081感病率達(dá)到18%～50%，甘蔗白條病的發(fā)生在廣西蔗區(qū)有擴大趨勢［5］。近年來，廣西隆安縣蔗區(qū)也出現(xiàn)疑似感染白條病的甘蔗植株，為了明確廣西隆安縣蔗區(qū)甘蔗植株是否感染白條病，本研究采集了該蔗區(qū)的疑似蔗株樣品，進(jìn)行PCR鑒定及病原菌分離培養(yǎng)，再回接至健康甘蔗植株，對發(fā)病情況進(jìn)行觀察和鑒定，旨在為今后深入研究甘蔗白條病病原菌及其與甘蔗互作奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

于2019年11月，在廣西隆安縣廣西農(nóng)科院甘蔗研究所丁當(dāng)試驗基地甘蔗種植區(qū)，選取葉片表現(xiàn)出明顯白色條紋病狀特征的甘蔗植株，砍取整株甘蔗，將蔗莖分上、中、下后，置于放有冰袋的泡沫盒運輸帶回實驗室，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌分離

將維管束變紅的蔗莖樣品，用酒精火焰消毒砍刀，把蔗莖砍成節(jié)，再用蒸餾水把所取蔗莖的表面沖洗干凈，接著用75%酒精對蔗莖進(jìn)行表面消毒，然后用經(jīng)過火焰消毒的砍刀把蔗莖去皮并切掉兩端，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺中的滅菌牛皮紙上。用滅菌的剪刀剪去部分蔗莖，取污染源較少的中間部位，剪碎置于滅菌的1.5mL離心管中，再加入1mL滅菌蒸餾水，旋渦震蕩1min，靜置半小時。用移液槍取50uL液體涂布在XAS選擇培養(yǎng)基［5］平板上，吹干水分，置于培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)5～8d，待菌落長出，用接種環(huán)挑單菌落再次在XAS選擇培養(yǎng)基上劃線純化培養(yǎng)2～3d，從平板中挑取少量菌體放入5mL XAS液體培養(yǎng)基中，搖床過夜培養(yǎng)36～48h，然后取適量菌液加入等體積50%的無菌甘油，混勻后置于-80℃冰箱菌種保存。

1.3 PCR鑒定

1.3.1 DNA提取

按照細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）的說明書提取病原菌基因組DNA或蔗莖和葉片DNA作為PCR模板，用于PCR鑒定。

1.3.2 PCR檢測

利用文獻(xiàn)報道的甘蔗白條病菌的特異性引物（XAF1：5'-CCTGGTGATGACGCTGGGTT-3'；XAR1：5'-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3'）對病原菌菌落基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定［2-3］。PCR反應(yīng)體系為：2×Taq PCR MasterMixⅡ10μL、10μmol/L上下游引物各1μL、模板DNA 1μL，補足去離子無酶水至總體積為20μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s，65℃延伸1min，31個循環(huán)；65℃終延伸3min。取5μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，并以無菌蒸餾水為陰性對照、以魏春燕等［5］分離的甘蔗白條病菌的DNA作為陽性對照。

1.4 致病性鑒定

1.4.1 接種液制備

用250mL體積的三角瓶配制50mL XAS液體培養(yǎng)基，121℃高溫滅菌20min。挑取少量經(jīng)過PCR檢測鑒定為陽性的菌落，接種到裝有XAS無抗性液體培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床28℃200rpm培養(yǎng)36～48h，制成母液。將母液用無菌水稀釋配置成590nm波長下OD=0.18的接種菌液，用于后續(xù)實驗。

1.4.2 接種

采用斬首法［6］接種甘蔗品種GT46的健康組培苗，即從甘蔗+1葉的葉耳處斬斷頭部，用移液槍取100μL制備好的接種菌液涂抹切口位置。共計接種20株甘蔗健康組培苗（5～6葉），用無菌水作為陰性對照。

1.4.3 致病性觀察

接種后放置于溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在接種后10d、30d和50d對接種蔗苗進(jìn)行觀測并拍照記錄其病癥。

1.4.4 致病菌鑒定

接種50d后，采集植株+1葉，按1.3.1提取DNA，按1.3.2進(jìn)行PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 大田蔗株病癥

對田間疑似感染甘蔗白條病的蔗株進(jìn)行觀察。在蔗株幼苗期，發(fā)病較輕時，植株第1至第2張葉的葉色保持正常顏色，從第3張葉開始，其葉片邊緣才出現(xiàn)條帶狀褪綠，白色條帶跟主脈呈平行分布，主脈保持正常綠色，隨時間推移，白色條帶慢慢擴大，且靠近葉尖的白色帶擴散速度快于葉片基部的白色帶，可致整張葉片枯萎，如圖1A所示；植株發(fā)病嚴(yán)重時，整株幼苗的葉片大部分或全部褪綠變白，且葉片細(xì)小，葉片卷曲，不能正常展開，幼苗出土后不久便枯死，如圖1B和C所示。在蔗株成熟期，發(fā)病的植株葉片白化條基本都連帶成片，一般是葉尖部先白化枯萎，葉基部保持部分綠色，如圖1D所示，莖部側(cè)芽萌發(fā)，且側(cè)芽長出的新葉也變白，如圖1E所示，其節(jié)和節(jié)間的維管束發(fā)紅，隨后不久整株就會枯死，如圖1F所示。

圖1 大田甘蔗感染白條病的病癥

2.2 病原菌的分離與鑒定

培養(yǎng)6d后，XAS選擇培養(yǎng)基平板上，開始長出菌落，菌落圓形，透明光滑，邊緣圓整，不具流動性，有很淡的黃色，質(zhì)地均勻，易挑取，如圖2所示。

圖2 XAS培養(yǎng)基上長出的菌落

利用甘蔗白條病菌的特異性引物對分離得到的菌落進(jìn)行PCR擴增，得到片段大小約為600bp的目標(biāo)產(chǎn)物，如圖3所示，分離得到的菌落為白條黃單胞桿菌（X.albilineans），說明田間發(fā)病蔗株感染了白條病。

圖3 菌落PCR擴增結(jié)果

2.3 致病性觀察及鑒定

以分離鑒定后的菌落經(jīng)XAS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，配制成接種菌液，用斬首法接種甘蔗品種GT46的健康組培苗。接種10d后，有些植株葉片的邊緣出現(xiàn)與葉脈平行的淡白色條紋，且切口處出現(xiàn)葉片壞死癥狀，如圖4A所示；接種30d后，有些植株靠近生長點的部位出現(xiàn)白斑，葉片邊緣出現(xiàn)內(nèi)卷現(xiàn)象，如圖4B所示；接種50d后，有些植株葉片葉尖部位枯死，葉片卷曲明顯，甚至整張葉片枯死，如圖4C所示。

圖4 甘蔗GT46組培苗接種白條病菌后的病癥

接種50d后，采集20株接種的組培苗的+1葉，利用白條病菌特異性引物對+1葉的DNA進(jìn)行PCR擴增，除第2、3、7和20株沒有檢測到目標(biāo)產(chǎn)物，其余都得到片段大小約為600bp的目標(biāo)產(chǎn)物，說明接種成功。接種后50d后的PCR擴增結(jié)果，如圖5所示。

圖5 接種后50d后的PCR擴增結(jié)果

3 討論

甘蔗是我國重要的產(chǎn)糖經(jīng)濟(jì)作物，栽培面積占我國常年糖料面積的85%以上，產(chǎn)糖量占食糖總產(chǎn)量的90%以上，甘蔗產(chǎn)業(yè)已成為主產(chǎn)區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱和農(nóng)民增收的主要來源。國外有許多關(guān)于甘蔗白條病的研究報道，包括白條病的發(fā)生規(guī)律和危害癥狀、病原檢測技術(shù)、傳播途徑以及防控措施等［7］。我國也有關(guān)于甘蔗白條病的研究報道，明確了廣西北海、來賓、百色蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)的疑似甘蔗白條病癥狀蔗株的致病病原為白條黃單胞菌，該菌可對甘蔗的產(chǎn)量和糖分造成嚴(yán)重?fù)p失，且有擴大蔓延的趨勢［8-12］。本研究鑒定了廣西隆安蔗區(qū)也遭受到白條病的侵害，說明白條病正在不斷地擴大蔓延，正影響著廣西甘蔗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本研究分離培養(yǎng)了白條病的病原菌，并采用柯赫氏法則回接驗證病原菌的致病性。但發(fā)病程度并沒有大田病癥嚴(yán)重，可能是因為病原菌在蔗株體內(nèi)積累的數(shù)量不夠，該病潛伏期較長有關(guān)［1］。

據(jù)報道多數(shù)甘蔗屬中國種抗白條病，多數(shù)熱帶種和大莖野生種感白條病，有學(xué)者初步篩選出一些抗病的甘蔗新品種（系），如桂糖40號、桂糖44號、桂糖08-120、桂糖08-1589、柳城07-150、粵甘46號、粵甘50號、云蔗11-3898、云蔗08-1609等，生產(chǎn)上可選用這些抗病品種進(jìn)行品種布局，以防治白條?。?2］?；瘜W(xué)藥劑可有效防治白條病，在發(fā)病初期及時選用1000~1200倍液的77%可殺得2000可濕性粉劑、3500倍液的72%農(nóng)用硫酸鏈霉素、500倍液的50%代深銨水劑、4000倍液的新植霉素、350倍液的14%絡(luò)氨銅水劑等藥劑進(jìn)行噴施，可有效防止甘蔗白條病的發(fā)生與流行［13］。