季小詩(shī)，郭紅蓮，王笑笑，楊昭輝，閆晨卉

(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津，300450)

冬棗(ZizyphusjujubaMill.)果皮薄而脆，果肉細(xì)嫩多汁，鮮食口感甜脆，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有人體所需的多種礦物質(zhì)、維生素以及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，特別是維生素C含量極高，可達(dá)300～600 mg/100g，被譽(yù)為“活維生素丸”[3]，還富含環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)和環(huán)磷酸鳥(niǎo)腺苷(guanosine-5′-monophosphate，GMP)等功能成分，深受人們喜愛(ài)[4]。然而冬棗在采摘以及貯藏過(guò)程中不僅極易失水皺縮造成果實(shí)軟化腐爛，并且容易受到病原菌從而引起腐敗，是冬棗在采后運(yùn)輸以及銷(xiāo)售過(guò)程中的極大障礙[5-6]。據(jù)報(bào)道，冬棗收獲后引起果實(shí)腐敗的病原菌大多數(shù)為細(xì)交鏈格孢菌(Alternariaalternata)[7]。如何保持冬棗的采后品質(zhì)，特別是減少受黑斑病侵染而造成的腐敗，是當(dāng)前冬棗保鮮領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。

在冬棗保鮮研究中，保鮮技術(shù)分為以下幾種：物理保鮮、化學(xué)保鮮和生物防治[8]。生物防治是近幾年來(lái)深受人們青睞的一種保鮮技術(shù)。它主要是利用拮抗微生物對(duì)果蔬病原菌的抑制作用從而達(dá)到保鮮效果[9-10]。我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了1株拮抗菌GS-316屬于膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)果實(shí)黑斑病(細(xì)交鏈格孢菌)有明顯抑制作用，并對(duì)其抗病機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)研究[11]。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，通過(guò)研究拮抗酵母GS-316發(fā)酵液對(duì)冬棗黑斑病的抑菌效果以及對(duì)冬棗果實(shí)貯藏期品質(zhì)的影響，以期為發(fā)現(xiàn)拮抗菌發(fā)酵液保鮮機(jī)制，探索冬棗果實(shí)生物保鮮技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：試驗(yàn)所用黃驊冬棗，天津市千品果蔬超市；拮抗菌膜醭畢赤酵母GS-316、細(xì)交鏈格孢菌，實(shí)驗(yàn)室保存。

試劑：2,6-二氯靛酚、Adamas-beta、3,5-二硝基水楊酸，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；過(guò)氧化氫，天津市化學(xué)試劑二廠；鄰苯二酚，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；DK-2000-ⅢL電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌的活化及孢子懸浮液制備

將實(shí)驗(yàn)室保藏的病原菌菌株使用無(wú)菌接種環(huán)接種到PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。用無(wú)菌鏟挑取培養(yǎng)7 d后的病原菌分生孢子于無(wú)菌蒸餾水中，制成孢子懸浮液。

1.3.2 拮抗菌的活化

無(wú)菌條件下，用無(wú)菌接種環(huán)刮取1環(huán)實(shí)驗(yàn)室保藏的拮抗菌GS-316菌株，采用3區(qū)劃線接種于PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 拮抗菌GS-316發(fā)酵液的制備

在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌接種環(huán)挑取已活化好的拮抗菌膜醭畢赤酵母GS-316接入PDA液體培養(yǎng)基中，以120 r/min的速度在搖床上培養(yǎng)7 d。將培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液用冷凍離心機(jī)以6 000 r/min冷凍離心15 min后，收集上清液。將得到的上清液經(jīng)0.22 μm的微孔過(guò)濾器過(guò)濾除菌體得無(wú)菌發(fā)酵液。

1.3.4 發(fā)酵液對(duì)病原菌的影響

參照喬博鑫等[12]的方法，在培養(yǎng)皿平板上打孔，另一側(cè)平行放置病原菌菌片。在小孔中加入50 μL提取的發(fā)酵液作為實(shí)驗(yàn)組，以小孔中加入50 μL無(wú)菌水作為對(duì)照，觀察發(fā)酵液對(duì)交鏈孢的生長(zhǎng)抑制率。每組處理設(shè)置3個(gè)平行。生長(zhǎng)抑制率計(jì)算方法如公式(1)所示：

生長(zhǎng)抑制率/%=

(1)

1.3.5 發(fā)酵液對(duì)冬棗自然發(fā)病率及病斑的影響

選取無(wú)機(jī)械損傷的棗果，用2%體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉溶液浸泡2 min，流水沖洗干凈后于通風(fēng)處晾干。將拮抗菌GS-316發(fā)酵液均勻噴灑于棗果表面作為實(shí)驗(yàn)組，以無(wú)菌水噴灑作為對(duì)照組。將處理后的棗果置于室溫25 ℃閉光且濕度適宜的泡沫箱中，定時(shí)噴灑無(wú)菌水以保證其貯藏濕度，每隔2 d觀察棗果的發(fā)病情況并記錄數(shù)據(jù)。每組設(shè)置3個(gè)平行。發(fā)病率計(jì)算方法如公式(2)所示：

(2)

取數(shù)個(gè)預(yù)處理后的棗果，用直徑為0.5 cm的無(wú)菌打孔器在赤道部分表面打孔，在孔中注入40 μL濃度為1×105個(gè)/mL交鏈孢孢子懸浮液，以注入40 μL拮抗菌GS-316發(fā)酵液作為實(shí)驗(yàn)組，注入等量無(wú)菌水作為對(duì)照組。將處理后的棗果置于室溫25 ℃閉光且濕度80%～90%的泡沫箱中，定時(shí)噴灑無(wú)菌水以保證其貯藏濕度，每天觀察棗果腐爛情況并記錄。每組處理設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.6 發(fā)酵液對(duì)冬棗生理品質(zhì)及抗氧化活性的影響

稱重法測(cè)定失重率[13]；酸堿滴定法測(cè)定可滴定酸含量[14]；2,6-二氯靛酚滴定法測(cè)定維生素C含量[14]；3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖含量[14]；紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(catalase， CAT)活性[15]；參考ADEDEJI等[16]的方法測(cè)定多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌GS-316發(fā)酵液對(duì)病原菌細(xì)交鏈格孢菌的作用

從圖1可以看到，病原菌在拮抗菌GS-316發(fā)酵液的存在下于PDA平板上28 ℃ 培養(yǎng)6 d后，相較于對(duì)照組，發(fā)酵液對(duì)病原菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，測(cè)得生長(zhǎng)抑制率為17.03%。結(jié)果表明，拮抗菌GS-316發(fā)酵液中存在抑菌成分，并且在離體條件下抑制棗果黑斑病病原菌的生長(zhǎng)。

2.2 冬棗采后貯藏試驗(yàn)

2.2.1 拮抗菌GS-316發(fā)酵液對(duì)棗果發(fā)病率的影響

從圖2可以看出，貯藏過(guò)程中，棗果的發(fā)病率隨著貯藏時(shí)間的增加均呈上升的趨勢(shì)，但經(jīng)發(fā)酵液處理后的棗果發(fā)病率要明顯優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組棗果發(fā)病率在前期迅速上升，第14 天時(shí)發(fā)病率便達(dá)到了95.83%，而經(jīng)發(fā)酵液處理后的棗果前期上升速率較對(duì)照組緩慢，第14天發(fā)病率僅為51.39%。在第20天時(shí)，對(duì)照組發(fā)病率為100.00%，實(shí)驗(yàn)組發(fā)病率僅為86.11%。結(jié)果說(shuō)明，棗果經(jīng)拮抗菌GS-316發(fā)酵液處理后，其中的抑菌成分可以有效減少病原菌對(duì)棗果的侵染，減緩冬棗被病原菌侵染的概率，有效抑制棗果發(fā)病。

2.2.2 拮抗菌GS-316發(fā)酵液對(duì)有傷接種棗果病斑的影響

從圖3可以看出，實(shí)驗(yàn)組由于拮抗菌GS-316發(fā)酵液的存在，阻止了交鏈孢孢子在棗果表面定植生長(zhǎng)，故其腐爛程度低，病斑直徑小。到第7天時(shí)發(fā)酵液處理的病斑直徑僅為7.00 mm，對(duì)照組達(dá)到了10.5 mm，2組差異明顯(P<0.05)。結(jié)果表明，拮抗菌GS-316發(fā)酵液能有效減輕棗果黑斑病的發(fā)病程度，并在一定程度上減緩棗果的腐爛，延長(zhǎng)冬棗的保質(zhì)期。

2.3 拮抗菌GS-316發(fā)酵液對(duì)棗果生理品質(zhì)和酶活性的影響

2.3.1 果實(shí)失重率

冬棗在采后仍然會(huì)進(jìn)行呼吸作用等一系列的代謝活動(dòng)，會(huì)造成水分蒸發(fā)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗[17]，是采后貯藏過(guò)程中果實(shí)失重的主要原因。從圖4可以看出，2組棗果的失重率隨著貯藏時(shí)間的增加呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，而經(jīng)過(guò)發(fā)酵液處理的棗果失重率一直低于對(duì)照組。至貯藏第7天時(shí)，發(fā)酵液處理后的冬棗失重率為6.04%，對(duì)照組為9.81%，兩者差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，發(fā)酵液能夠在一定程度上減少棗果中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝分解和水分的蒸發(fā)，保持果實(shí)的重量，提高果實(shí)的品質(zhì)。

2.3.2 果實(shí)可滴定酸的變化

可滴定酸含量直接影響著棗果品質(zhì)，是檢驗(yàn)果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[18]。一般在冬棗青果中含量最高，隨后隨著果實(shí)成熟度的增加，可滴定酸含量降低，這是因?yàn)樵诠麑?shí)成熟過(guò)程中，可滴定酸作為呼吸作用底物被消耗[19]。從圖5可以看出，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組冬棗的可滴定酸含量隨著貯藏時(shí)間的增加均呈逐漸下降的趨勢(shì)，但對(duì)照組的可滴定酸含量一直低于實(shí)驗(yàn)組。至貯藏第7天時(shí)，經(jīng)發(fā)酵液處理的棗果可滴定酸含量為0.21%，對(duì)照組為0.19%，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組但差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，發(fā)酵液處理能夠有效減緩棗果可滴定酸含量的降低，保持棗果的貯藏品質(zhì)和風(fēng)味口感。

2.3.3 果實(shí)維生素C含量的變化

維生素C是水果的營(yíng)養(yǎng)成分之一，對(duì)于人類(lèi)來(lái)說(shuō)具有重要的健康價(jià)值[20]。冬棗的維生素C含量極高，是貯藏期間重要的理化指標(biāo)，且棗果維生素C含量與軟化率呈負(fù)相關(guān)。由圖6可知，在貯藏時(shí)間內(nèi)，2組棗果維生素C含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，經(jīng)發(fā)酵液處理后的棗果維生素C含量一直高于對(duì)照組。至貯藏第7天時(shí)，對(duì)照組維生素C含量為105.42 mg/100g，而經(jīng)發(fā)酵液處理?xiàng)椆S生素C含量為134.17 mg/100g，差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，經(jīng)發(fā)酵液處理有效保持棗果內(nèi)維生素C含量，抑制棗果內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分的流失，起到了一定的保鮮作用。

2.3.4 果實(shí)還原糖含量的變化

棗果在采后貯藏期間，果實(shí)需要進(jìn)行呼吸作用，還原糖是果實(shí)呼吸作用的底物，于是淀粉逐漸被淀粉酶分解為還原糖，這樣便會(huì)使果實(shí)中的還原糖含量升高。如圖7所示，棗果中的還原糖含量隨著貯藏時(shí)間的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，對(duì)照組果實(shí)還原糖含量一直高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。結(jié)果表明，GS-316拮抗菌發(fā)酵液處理能夠有效抑制棗果的呼吸作用，降低果實(shí)淀粉酶的活性，有效延長(zhǎng)冬棗的保鮮期限。

2.3.5 CAT和PG

H2O2是植物體在生命代謝過(guò)程中產(chǎn)生的，對(duì)植物體細(xì)胞具有破壞性，而CAT可以使其分解為H2O和O2。如圖8所示，棗果中的CAT活性隨著貯藏時(shí)間的增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在貯藏第7天時(shí)，CAT活性低于初始值，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。貯藏第1天時(shí)，對(duì)照組CAT活性高于實(shí)驗(yàn)組且達(dá)到高峰，實(shí)驗(yàn)組CAT活性在第3天才達(dá)到高峰，推測(cè)對(duì)照組棗果衰老進(jìn)程較實(shí)驗(yàn)組快，果實(shí)中的防御系統(tǒng)提前啟動(dòng)，誘導(dǎo)CAT活性增加，后期冬棗腐爛，導(dǎo)致果實(shí)內(nèi)的CAT活性降低。

植物細(xì)胞壁中的果膠含量與果實(shí)硬度呈現(xiàn)正相關(guān)。PG能夠特異性催化水解多聚半乳糖醛酸，使植物細(xì)胞壁中的果膠發(fā)生降解，且外界病原菌侵入會(huì)使棗果抗病酶系失效，病原菌同樣會(huì)分泌果膠相關(guān)的降解酶等，也會(huì)使棗果發(fā)生軟化。2組棗果的PG活性在貯藏間內(nèi)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組的PG活性一直低于對(duì)照組(P<0.05)，且上升速率小于對(duì)照組。推測(cè)其原因可能是因?yàn)榻?jīng)上清液處理的棗果果實(shí)有上清液中的抑菌成分抑制了果實(shí)PG發(fā)揮其作用，并且增強(qiáng)了果實(shí)體內(nèi)抗病酶系活性，這樣就有效減少了外界病原菌入侵對(duì)果實(shí)造成的傷害。

結(jié)果表明，拮抗菌GS316發(fā)酵液處理果實(shí)能夠使果實(shí)中CAT活性保持在較高位置，并且減緩棗果果實(shí)中PG活性的升高，增強(qiáng)冬棗果實(shí)抗病酶系的活性，提高果實(shí)的抗氧化活性，減少外界病原菌對(duì)果實(shí)細(xì)胞壁的降解，有效抑制果實(shí)軟化，提升其貯藏品質(zhì)及貯藏時(shí)間。

3 結(jié)論與討論

拮抗微生物的抑菌機(jī)制研究是近幾年人們研究的熱點(diǎn)，拮抗微生物可能分泌一些抗毒素、抑菌蛋白等物質(zhì)直接作用于靶標(biāo)如病原菌菌絲、孢子等起到抑制效果[21-23]。已有研究報(bào)道了一種膜醭畢赤酵母可通過(guò)分泌2種抑菌蛋白PMKT和PMICT2來(lái)抑制病原真菌的生長(zhǎng)[24]。本實(shí)驗(yàn)室的初步研究結(jié)果也表明，膜醭畢赤酵母菌可能產(chǎn)生某種物質(zhì)抑制了病原菌致病水解酶，所以導(dǎo)致了病原菌致病力下降，抑制病原菌的入侵[12]。本文在前述成果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確了該菌的抑菌物質(zhì)在發(fā)酵液中存在，抑菌物質(zhì)能夠?qū)绘滄呔淦鸬街苯右种谱饔谩?/p>

棗果在采后易受到病原菌的污染，主要是由于其高水分含量以及高糖分等特點(diǎn)，使得棗果的生理品質(zhì)在采后貯藏過(guò)程中逐漸下降，直至棗果腐爛。本研究通過(guò)冬棗采后貯藏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GS-316發(fā)酵液處理后能夠抑制冬棗發(fā)病，減緩果實(shí)失重率的變化并維持可滴定酸含量，抑制還原糖含量的增加，說(shuō)明拮抗菌發(fā)酵液可對(duì)采后果實(shí)品質(zhì)惡化有抑制作用；主要代謝酶活性分析表明，發(fā)酵液作用于果實(shí)后，能夠保持較高的CAT活性，降低PG的活性，從而增強(qiáng)果實(shí)的抗氧化能力，降低果實(shí)軟化速率，推測(cè)該拮抗酵母的發(fā)酵液中含有的抑菌類(lèi)物質(zhì)，能夠阻止外界病原菌的侵入從而達(dá)到保持冬棗品質(zhì)和抗病酶系活性的目的，并且有效的阻止果實(shí)品質(zhì)的劣變。

拮抗菌GS316發(fā)酵液能夠抑制冬棗果實(shí)在貯藏期的黑斑病，可作為一種生物保鮮液在冬棗保鮮中發(fā)揮作用。將拮抗微生物的發(fā)酵液應(yīng)用到冬棗果實(shí)的保鮮中，為冬棗果實(shí)的貯藏保鮮提供了新技術(shù)。未來(lái)可將發(fā)酵液進(jìn)行更精細(xì)的分離純化，并可明確其起抑菌作用的物質(zhì)分類(lèi)及分子結(jié)構(gòu)。