姜鑫 陳文靜 蘇杭 申福國(guó) 肖文龍 孫文彩

摘要：目的：探討葛根素對(duì)激素性股骨頭壞死（SONFH）成骨的促進(jìn)作用。方法：（1）30只6月齡健康成年新西蘭大白兔，雌雄各半，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和葛根素組，每組9只。新西蘭兔應(yīng)用馬血清和甲基強(qiáng)的松龍（MPS）建立體內(nèi)SONFH模型，建模成功后然用葛根素治療，常規(guī)蘇木精-伊紅染色觀察股骨頭組織形態(tài)學(xué)改變。（2）從健康家兔分離成骨細(xì)胞，分別給予地塞米松和葛根素單獨(dú)或聯(lián)合治療，采用CCK-8法測(cè)定成骨細(xì)胞活力及應(yīng)用茜素紅法評(píng)價(jià)礦化結(jié)節(jié)的形成。（3）應(yīng)用qRT-PCR和westernblot檢測(cè)股骨頭壞死組織中RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）和miR-34a的表達(dá)。結(jié)果：葛根素可減輕SONFH對(duì)家兔組織病理學(xué)異常的促進(jìn)作用，對(duì)抗SONFH對(duì)RUNX2和miR-34a表達(dá)的抑制作用。兔成骨細(xì)胞分離成功，呈紅色礦化結(jié)節(jié)。地塞米松暴露降低成骨細(xì)胞的活力，葛根素治療增加了這種活力。此外，葛根素治療減弱了地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞活力、成骨細(xì)胞分化以及RUNX2和miR-34a表達(dá)的抑制作用。結(jié)論：葛根素通過miR-34a上調(diào)促進(jìn)激素性股骨頭壞死的成骨和激素性骨細(xì)胞的成骨。

關(guān)鍵詞：葛根素;激素性股骨頭壞死;成骨;成骨細(xì)胞;miR-34a

【中圖分類號(hào)】R816.8 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2021）07-130-02

激素性股骨頭壞死（SONFH）的特征是骨細(xì)胞進(jìn)行性壞死[1]。糖皮質(zhì)激素的長(zhǎng)期使用或過量攝入是誘發(fā)股骨頭壞死的主要誘因之一[2]，然而，SONFH的發(fā)病機(jī)制仍不十分明確。最近的研究推測(cè)，可能與激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡、成脂與成骨分化失衡及股骨頭微循環(huán)受損等相關(guān)。成骨細(xì)胞來源于成熟的成骨細(xì)胞和間充質(zhì)前體，對(duì)骨生長(zhǎng)和骨基質(zhì)形成至關(guān)重要[3]。成骨細(xì)胞可以與破骨細(xì)胞相互作用，維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)[4]。在骨重塑過程中，成骨細(xì)胞分化和破骨細(xì)胞生成的不平衡會(huì)導(dǎo)致骨組織系統(tǒng)性破壞所反映的病理狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致骨減少、骨溶解甚至骨壞死[5]。通過促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和保護(hù)骨重塑的相關(guān)機(jī)制，天然化合物的使用已被廣泛應(yīng)用于治療SONFH[6]。

葛根素是從葛根中提取的一種異黃酮類植物雌激素，與雌二醇結(jié)構(gòu)類似，具有雌激素樣作用[7]。葛根素可與骨細(xì)胞雌激素受體（ER）結(jié)合，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，增加骨密度和骨強(qiáng)度，并能直接抑制破骨細(xì)胞骨吸收，促進(jìn)骨形成的作用[8]。然而，葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成的機(jī)制尚未完全闡明，為探討葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞向SONFH分化的可能機(jī)制，本項(xiàng)目通過建立兔體內(nèi)模型和成骨細(xì)胞體外模型對(duì)其進(jìn)行研究。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的30只6月齡健康成年新西蘭大白兔，雌雄各半。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照中國(guó)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)的指導(dǎo)方針進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)在齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院進(jìn)行，使動(dòng)物的疼痛和不適降低到最小化，

并獲得齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：DO2019120）。

1.2主要儀器

光學(xué)顯微鏡，倒置顯微鏡蔡司（Axio Vert.A1，卡爾蔡司，德國(guó)Oberkochen;放大倍數(shù)：200×），熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 儀 （ Agilent Technologies Mx3000P ） ; 分 光 光 度 計(jì)（ GENESYS 140/150）。

1.3方法

1.3.1體外SONFH模型的建立

所有的兔子在接受實(shí)驗(yàn)前都經(jīng)過了一周的馴化，將家兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和葛根素組，每組9只。SONFH模型組，于第0天在耳靜脈注射10ml/kg馬血清（HS）3周后在耳靜脈注射HS（6ml/kg），兩周后，家兔腹腔注射甲基強(qiáng)的松龍（40mg/kg）（MPS）3天。在激素給藥期間，青霉素（100000 U）可預(yù)防感染給每只兔子7天。

1.3.2蘇木精-伊紅染色

建立SONFH模型后，將股骨頭標(biāo)本固定在4%多聚甲醛，10%EDTA溶液（EDS，EDS）脫鈣2個(gè)月，脫鈣樣品梯度乙醇中脫水，切片后蘇木精—伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察了美洲馬州沃爾特馬州的Thermofher組織形態(tài)學(xué)變化×大200倍，SONFH病變根據(jù)先前確定的標(biāo)準(zhǔn)[9，10]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3成骨細(xì)胞的分離與鑒定

取出4只健康雄性新西蘭大白兔顱骨，將頭骨切成小塊，在PBS中沖洗三次，并用0.25%胰蛋白酶0.1%I型膠原酶消化骨組織，在1000℃下離心30分鐘，收集下層細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基。培養(yǎng)瓶放置在37℃ 中培養(yǎng)并進(jìn)行細(xì)胞傳代，取第三代細(xì)胞在倒置顯微鏡下進(jìn)行確認(rèn)。

1.3.4細(xì)胞處理與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

分離的成骨細(xì)胞用5%CO2在37℃F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后暴露于地塞米松（Dex，D4902，C22H29FO5，純度≥ 97.0%，）0，0.1，1，5和10μM或用不同劑量（0、0.1、1、5和10μM） ，以二甲基亞砜（DMSO）預(yù)溶葛根素為研究對(duì)象，分別確定建立SONFH體外模型和葛根素治療的最佳濃度。

將分離出的成骨細(xì)胞分為5組，即對(duì)照組（空白對(duì)照組）、Dex組（成骨細(xì)胞暴露于1μM-Dex處理24h），葛根素組（成骨細(xì)胞預(yù)處理0.1μg/ml）μM葛根素24小時(shí)，暴露于1μM-Dex轉(zhuǎn)染24h），葛根素+MC組（模擬對(duì)照轉(zhuǎn)染后，用0.1μmol/l的濃度預(yù)處理成骨細(xì)胞μM葛根素24小時(shí)，暴露于1μM-Dex轉(zhuǎn)染24h），葛根素+M組（miR-34a模擬轉(zhuǎn)染后，成骨細(xì)胞用0.1μmol/l預(yù)處理μM葛根素24小時(shí)，暴露于1μM指數(shù)為24小時(shí)）。所有處理過的基因和lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑在37℃共同孵育℃ 10分鐘后，將孵育液和基因脂質(zhì)復(fù)合物加入成骨細(xì)胞中，37℃孵育48小時(shí)℃。

1.3.5定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

分別用Trizol試劑和PureLink miRNA分離試劑盒從分離成骨細(xì)胞中提取總RNA和miRNA，用氯仿對(duì)總RNA和miRNA進(jìn)行分層，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，在無RNase水中溶解。利用上標(biāo)IV逆轉(zhuǎn)錄酶合成了相應(yīng)的cDNAs，然后在PCR檢測(cè)系統(tǒng)下，相關(guān)基因表達(dá)量用2計(jì)算-ΔΔCt方法。

1.3.6細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）分析以及茜素紅染色

CCK-8試劑測(cè)定成骨細(xì)胞的活性，CCK-8試劑（10μ五十） 在37℃時(shí)加入每個(gè)孔中的貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)℃ 2小時(shí)，通過分光光度計(jì)（GENESYS 140/150）記錄450 nm處的細(xì)胞吸光度。

茜素染色檢測(cè)成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)，成骨細(xì)胞加入茜素紅工作液，37℃孵育℃ 在倒置顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞中礦化結(jié)節(jié)的形成× PBS沖洗后放大。

1.3.7蛋白質(zhì)印跡

通過RIPA緩沖液從分離的成骨細(xì)胞中提取總蛋白。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯示蛋白條帶，用ImageJ軟件（1.52s版）分析條帶強(qiáng)度。

1.3.8統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。測(cè)量數(shù)據(jù)以平均值表示± 標(biāo)準(zhǔn)差。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)檢測(cè)正態(tài)分布。多組間比較采用單因素方差分析，事后配對(duì)比較采用Tukey檢驗(yàn)。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1葛根素能減輕MPS誘導(dǎo)的兔組織病理學(xué)異常，并對(duì)抗MPS和miR-34a表達(dá)的抑制作用

如圖1A所示，我們觀察到典型的股骨頭壞死，骨小梁內(nèi)有大量空骨陷窩或骨細(xì)胞核收縮，骨小梁周圍有骨髓壞死，髓腔擴(kuò)大，造血細(xì)胞明顯減少，與對(duì)照組股骨頭未見明顯骨壞死相比，SONFH模型兔脂肪組織增生、肥大。家兔灌胃葛根素后，股骨頭組織學(xué)特征均較模型組改善，骨小梁基本完整，排列不規(guī)則，偶見空骨陷窩，周圍壞死骨髓細(xì)胞較模型組減輕（圖1A）。這些結(jié)果表明葛根素可能對(duì)家兔的SONFH有保護(hù)作用。

注射多磺酸粘多糖后，測(cè)定兔股骨頭中RUNX2 的表達(dá)。MPS誘導(dǎo)的SONFH兔的表達(dá)下調(diào)，葛根素逆轉(zhuǎn)MPS對(duì)RUNX2表達(dá)的抑制作用（P<0.001;圖1B-1D）。此外，先前的研究發(fā)現(xiàn)miR-34a減輕了Dex誘導(dǎo)的對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制作用[11]。如圖1E所示，注射MPS可下調(diào)兔股骨頭中miR-34a的表達(dá)，而葛根素治療可減弱對(duì)miR-34a表達(dá)的抑制作用（P<0.001）。這些結(jié)果表明葛根素可能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，從而拮抗家兔的SONFH。

2.2成功分離出紅色礦化結(jié)節(jié)的兔成骨細(xì)胞，地塞米松降低成骨細(xì)胞活力，葛根素提高成骨細(xì)胞活力

觀察葛根素和地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響。茜素紅S染色結(jié)果顯示分離細(xì)胞中有紅色礦化結(jié)節(jié)，表明兔成骨細(xì)胞已成功分離（圖2A）。分別用不同濃度的地塞米松和葛根素處理離體成骨細(xì)胞。在暴露于Dex（1，5和10）24小時(shí)后，檢測(cè)到成骨細(xì)胞活力的劑量依賴性降低μM） （P<0.01，P<0.001），而細(xì)胞暴露于濃度低于1μM沒有顯示成骨細(xì)胞活力的明顯變化（圖2B）。對(duì)照組用葛根素（0.1，1，5）治療24，48hμM） 增加成骨細(xì)胞活力，葛根素0.1μM對(duì)成骨細(xì)胞活力的提高作用較強(qiáng)（P<0.05，P<0.01）;圖2C，D）。

2.3葛根素通過上調(diào)miR-34a的表達(dá)，部分減弱Dex對(duì)兔成骨細(xì)胞成骨分化的抑制作用

地塞米松處理后miR-34a表達(dá)和成骨細(xì)胞活力均下降（P<0.01，P<0.001），葛根素可減輕地塞米松對(duì)這些因子的抑制作用（P<0.05，P<0.001;圖3A，B）。此外，將miR-34a模擬物轉(zhuǎn)染葛根素處理的成骨細(xì)胞后，進(jìn)一步促進(jìn)了葛根素增強(qiáng)miR-34a表達(dá)和成骨細(xì)胞活力的作用（P<0.05，P<0.001;圖3A，B）。此外，暴露于Dex可減少紅色礦化結(jié)節(jié)，降低RUNX2的蛋白表達(dá)（P<0.001），葛根素治療可使這些表達(dá)減弱（P<0.001，圖3C-3E）。值得注意的是，將miR-34a模擬物轉(zhuǎn)染到葛根素處理的成骨細(xì)胞中也促進(jìn)了葛根素對(duì)抗Dex對(duì)紅色礦化結(jié)節(jié)形成和RUNX2蛋白表達(dá)的影響（P<0.001，圖3C-3E）。這些結(jié)果表明葛根素可能通過上調(diào)miR-34a的表達(dá)，部分誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，從而拮抗SONFH。

3討論

糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致骨細(xì)胞出現(xiàn)不可修復(fù)的缺損，引起骨壞死，擾亂骨代謝失衡，從而導(dǎo)致非創(chuàng)傷性股骨頭塌陷[12]，可導(dǎo)致成骨和骨細(xì)胞凋亡，抑制骨祖細(xì)胞的增殖和向成骨細(xì)胞分化[13]。Weinstein的研究表明，接受糖皮質(zhì)激素的小鼠表現(xiàn)出股骨頭強(qiáng)度、股骨頭礦物質(zhì)密度和股骨頭松質(zhì)骨中成骨細(xì)胞數(shù)量減少，小梁寬度縮短。本研究采用HS和MPS聯(lián)合給藥的方法，在家兔上建立了SONFH的體內(nèi)模型，根據(jù)上述結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)SONFH兔骨小梁周圍有空骨陷窩或骨細(xì)胞核固縮，骨髓壞死。

Runt家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）是骨發(fā)育過程中激活與啟動(dòng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化并調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞成熟的重要轉(zhuǎn)錄因子[14]，對(duì)成骨分化的發(fā)展和進(jìn)展是不可或缺的，與一系列協(xié)同調(diào)節(jié)蛋白相互作用，為整合成骨細(xì)胞分化所需的細(xì)胞信號(hào)通路和基因表達(dá)的組織特異性調(diào)節(jié)提供了一種組合機(jī)制[15]。Fan的研究表明，在DEX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松兔中RUNX2蛋白水平下調(diào)，并且在DEX處理的MC3T3-E1細(xì)胞中抑制RUNX2的表達(dá)[16]。王海珍等人的研究證實(shí)抑制表達(dá)miR-196a-3p 的大鼠成骨細(xì)胞中Runx2 表達(dá)升高，而過表達(dá)Runx2明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化[17]。與這些發(fā)現(xiàn)相似，我們的研究發(fā)現(xiàn)，HS和MPS聯(lián)合給藥可下調(diào)兔SONFH模型中RUNX2的表達(dá)。總之，目前的結(jié)果表明，股骨頭從成骨分化向成脂分化的轉(zhuǎn)變可能是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)股骨頭壞死的原因。

葛根素是從葛根中藥里提取的一種單體成分，屬于植物雌激素，對(duì)成骨細(xì)胞的活性具有調(diào)節(jié)作用[18]。在我們的研究中，葛根素對(duì)MPS誘導(dǎo)的SONFH兔的作用與葛根素對(duì)酒精誘導(dǎo)的骨壞死小鼠的作用幾乎相同。我們觀察到葛根素逆轉(zhuǎn)了多磺酸粘多糖對(duì)形態(tài)學(xué)改變的作用。此外，葛根素處理的MC3T3-E1細(xì)胞呈現(xiàn)上調(diào)的RUNX2表達(dá)[19]。本研究的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，葛根素對(duì)MPS誘導(dǎo)的兔骨髓細(xì)胞壞死和股骨頭塌陷有保護(hù)作用，并通過調(diào)節(jié)miR-34a的表達(dá)對(duì)抗Dex對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化的抑制作用，與此同時(shí)，葛根素也能抑制多磺酸粘多糖誘導(dǎo)的家兔RUNX2 mRNA和蛋白質(zhì)水平的上調(diào)。這些結(jié)果表明葛根素通過促進(jìn)成骨分化逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素對(duì)骨形成的抑制作用。

曾有研究表明，葛根素能夠促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖和分化，并表明1.0umol/Lg葛根素效果最好[17]，本研究為進(jìn)一步探討葛根素促進(jìn)成骨分化促進(jìn)骨形成的機(jī)制，進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。分別用不同濃度的地塞米松和葛根素處理離體成骨細(xì)胞，以確定造模和葛根素處理的最佳濃度。先前的體外實(shí)驗(yàn)表明，葛根素治療可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增加礦化結(jié)節(jié)的形成，并增加成骨相關(guān)基因的表達(dá)[20]。與這些觀察結(jié)果一致，我們的研究表明葛根素能提高成骨細(xì)胞的活力，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化和成骨相關(guān)基因的表達(dá)。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)影響多種生物學(xué)過程，包括增殖、分化和凋亡等[21]。Yuan等[22]利用qRT-PCR證明SONFH患者組織中miR-34a表達(dá)上調(diào)，Kand [23]證實(shí)miR-34a具有促進(jìn)成骨的作用。Zha等研究表明miR-34a在Dex給藥后下調(diào)，上調(diào)的miR-34a通過促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化而減輕糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死[24]。在我們的研究中，我們檢測(cè)到在MPS誘導(dǎo)的SONFH兔和Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中miR-34a表達(dá)下調(diào)，并且證明上調(diào)的miR-34a在體外進(jìn)一步促進(jìn)葛根素的作用，表明miR-34a與葛根素的作用正相關(guān)。在這項(xiàng)研究中，雖然我們沒有確定miR-34a在SONFH中促進(jìn)成骨分化的基因或信號(hào)通路，但是我們?yōu)橐院蟮难芯刻峁┝朔较颉?/p>

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