許燕，孫韶華，逯南南，孫莉，趙清華，賈瑞寶

山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測(cè)中心，濟(jì)南 250100

世界衛(wèi)生組織(WHO)定義內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)是指能改變機(jī)體內(nèi)分泌功能，并對(duì)生物體、后代或種群產(chǎn)生不良影響的外源性物質(zhì)或混合物[1]。一些EDCs能作為激素的模擬物或者阻滯劑直接作用于機(jī)體的激素受體，還有一些能直接作用于控制激素向其靶細(xì)胞或者組織傳遞的蛋白質(zhì)，從而對(duì)人類(lèi)或者動(dòng)物的生殖健康、性別比例和神經(jīng)發(fā)育等產(chǎn)生影響，引起甲狀腺、腎上腺、代謝紊亂和免疫功能障礙等相關(guān)疾病。目前，已知包含農(nóng)藥、阻燃劑、塑料制品、個(gè)人護(hù)理品、重金屬、增塑劑和抗氧化劑等在內(nèi)的，超過(guò)800種化學(xué)物質(zhì)具有內(nèi)分泌干擾特性[2]。隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，各類(lèi)新型化合物的合成以及新型污染物的排放，數(shù)十萬(wàn)種合成化學(xué)品中只有極小部分被評(píng)估為內(nèi)分泌干擾活性，人類(lèi)已經(jīng)完全暴露于多種EDCs廣泛存在的環(huán)境中。已有研究表明，EDCs廣泛分布于水生環(huán)境，可能對(duì)水生生物和人類(lèi)健康構(gòu)成威脅[3-4]。

由于EDCs種類(lèi)繁多且多具有低濃度活性，相互之間可能產(chǎn)生附加或協(xié)同作用，環(huán)境EDCs篩查方法中，儀器分析法雖然能識(shí)別和量化已知的特定環(huán)境EDCs，但具有前處理復(fù)雜、儀器昂貴和耗時(shí)久等缺點(diǎn)[5]。生物分析法因其檢測(cè)費(fèi)用低、耗時(shí)短、能測(cè)定復(fù)雜化合物的綜合毒性等優(yōu)點(diǎn)，在篩查測(cè)定環(huán)境EDCs時(shí)，與儀器分析法相比有顯著的優(yōu)勢(shì)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)基因法(chemically activated luciferase gene expression, CALUX)是一種體外生物測(cè)試法，通過(guò)測(cè)定重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于污染物所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，結(jié)合毒性當(dāng)量物質(zhì)的響應(yīng)值，來(lái)評(píng)價(jià)污染物的綜合毒性效應(yīng)。美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)家和組織已將CALUX生物測(cè)定法指定為官方篩選方法。近年來(lái)，CALUX技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境(土壤、大氣和水)[6-7]、食品和人類(lèi)血清[8-9]等EDCs的篩查測(cè)定。

小清河是濟(jì)南市城市河流的兩大水系之一，是濟(jì)南市區(qū)內(nèi)唯一的防洪除澇和排污河道，小清河(濟(jì)南段)流域主要包括槐蔭區(qū)、天橋區(qū)、市中區(qū)、歷下區(qū)、歷城區(qū)和章丘市，從辛豐莊出濟(jì)南界，長(zhǎng)70.3 km，匯流面積2 873.93 km2，絕大多數(shù)支流集中在主干河道南岸，成單側(cè)羽毛狀分布，基本上屬于雨源型山溪河流，北岸支流較少，均屬平原型坡水河流(圖1)。

圖1 小清河主要支流采樣點(diǎn)分布圖Fig. 1 Distribution map of the main tributaries of Xiaoqing River

本文聚焦小清河(濟(jì)南段)的主要支流，采用CALUX生物測(cè)定法深度調(diào)研各支流雌激素類(lèi)、二噁英類(lèi)、雄激素類(lèi)和腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)等4類(lèi)典型EDCs的污染現(xiàn)狀，通過(guò)為期1年的調(diào)查研究，明確了各支流4類(lèi)EDCs的含量水平，揭示了不同EDCs的時(shí)空分布規(guī)律，為評(píng)估小清河支流EDCs污染風(fēng)險(xiǎn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

儀器與試劑：LB960型微孔板式化學(xué)分光檢測(cè)儀(德國(guó)Berthold Centro公司)；AC2-4S1型生物安全柜(新加坡ESCO公司)；HERA cell 150i型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；CKX41型組織培養(yǎng)用顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)；Auto SPE-06C型全自動(dòng)固相萃取儀(美國(guó)睿科公司)；正己烷、乙酸乙酯為色譜純，美國(guó)Dikmapure公司；二甲基亞砜(DMSO)為分析純，美國(guó)Sigma公司。

細(xì)胞系購(gòu)自荷蘭Biodetection Systerms B.V.(BDS)公司，其中，DR CALUX細(xì)胞是通過(guò)基因工程，使其在暴露于Ah受體(AhR)激動(dòng)劑時(shí)產(chǎn)生熒光素酶的大鼠肝癌細(xì)胞(H4IIe)，AhR激動(dòng)劑包括二噁英化合物、類(lèi)二噁英多氯聯(lián)苯化合物和呋喃化合物等。

ER CALUX細(xì)胞是通過(guò)基因工程，使其在暴露于雌激素受體(ER)激動(dòng)劑時(shí)產(chǎn)生熒光素酶的人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞(T-47D)，ER激動(dòng)劑包括雌激素化合物或類(lèi)雌激素化合物。

GR CALUX細(xì)胞是通過(guò)基因工程，使其在暴露于腎上腺皮質(zhì)激素受體(GR)激動(dòng)劑時(shí)產(chǎn)生熒光素酶的人類(lèi)成骨骨癌細(xì)胞(U2-OS)，GR激動(dòng)劑包括腎上腺皮質(zhì)激素化合物或類(lèi)腎上腺皮質(zhì)激素化合物。

AR CALUX細(xì)胞是通過(guò)基因工程，使其在暴露于雄激素受體(AR)激動(dòng)劑時(shí)產(chǎn)生熒光素酶的人類(lèi)成骨骨癌細(xì)胞(U2-OS)，AR激動(dòng)劑包括雄激素化合物或類(lèi)雄激素化合物。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度系列(2,3,7,8-四氯二苯并-對(duì)-二噁英、雌二醇、二氫睪酮、地塞米松)購(gòu)自荷蘭BDS公司；細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Oasis HLB固相萃取柱購(gòu)自美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

2017年9月—2018年8月，每月對(duì)小清河(濟(jì)南段)的LS、XJ、GS、XL、DL、LY、HC和DX等8條南岸主要支流進(jìn)行一次水樣樣本采集，采樣瓶須使用氫氧化鈉溶液進(jìn)行充分清洗，并經(jīng)無(wú)水乙醇漂洗晾干，水樣采集后需在4 ℃條件下運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，然后在72 h內(nèi)完成過(guò)濾和前處理操作。經(jīng)前處理后，利用CALUX生物測(cè)定法分別測(cè)試二噁英類(lèi)、雌激素類(lèi)、腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)和雄激素類(lèi)的含量水平。

1.2.2 樣品的前處理

測(cè)定二噁英類(lèi)的樣品前處理：已混勻的水樣加入正己烷，用振蕩器震蕩萃取，靜置使兩相分層，將上層液相轉(zhuǎn)入玻璃試管中，以平緩的氮?dú)馐乖嚬苤械恼和檎舭l(fā)。重復(fù)以上液液萃取2次后，將濃縮液通過(guò)硫酸硅膠柱，完成對(duì)有機(jī)物、脂肪和不穩(wěn)定多環(huán)芳烴等的氧化。凈化后的提取液以平緩的氮?dú)獯蹈?，加入DMSO溶液，-20 ℃保存，以待細(xì)胞分析測(cè)定。

測(cè)定雌激素類(lèi)、雄激素類(lèi)和腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)的樣品前處理：樣本混勻后經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，經(jīng)已活化的HLB固相萃取柱富集，用乙酸乙酯洗脫固相萃取柱3次，以平緩的氮?dú)鉂饪s洗脫液，氮吹后加入DMSO溶液，-20 ℃保存，以待細(xì)胞分析測(cè)定。

1.2.3 CALUX法檢測(cè)

根據(jù)ISO17025認(rèn)證推薦的標(biāo)準(zhǔn)操作方法[10]進(jìn)行檢測(cè)，首先，將細(xì)胞懸浮液按一定的稀釋比例，植板于96孔微孔板，孵育16 h。然后，無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移出微孔板的培養(yǎng)基，將預(yù)先制備的含特定劑量樣本的培養(yǎng)基、含特定濃度劑量的標(biāo)準(zhǔn)參照物的培養(yǎng)基填充至96孔板，孵育24 h后，從微孔板中移出所有培養(yǎng)基，每孔加入30 μL細(xì)胞消散試劑，測(cè)定螢光素酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)參照物系列的熒光強(qiáng)度，使用數(shù)據(jù)分析軟件制作劑量-響應(yīng)曲線，得出樣品中不同EDCs的當(dāng)量值，即分別使用17β-雌二醇(E2)、二氫睪酮(DHT)、地塞米松(Dex)、2,3,7,8-四氯二苯并-對(duì)-二噁英(2,3,7,8-TCDD)來(lái)表征雌激素類(lèi)、雄激素類(lèi)、腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)和二噁英類(lèi)的內(nèi)分泌活性的濃度。

數(shù)據(jù)分析時(shí)，低于檢出限的測(cè)試結(jié)果，統(tǒng)一賦為檢出限一半的值，用于計(jì)算平均值。

2 結(jié)果(Results)

2.1 小清河(濟(jì)南段)主要支流EDCs含量水平及分布特征

2.1.1 二噁英類(lèi)

結(jié)果表明，在為期1年的調(diào)研周期內(nèi)，小清河(濟(jì)南段)8條支流的二噁英類(lèi)毒性當(dāng)量濃度范圍為

圖2 不同季節(jié)二噁英類(lèi)含量水平Fig. 2 Dioxin levels in different seasons

由圖3可知，8條支流的年平均毒性當(dāng)量濃度為0.020～0.040 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1，二噁英類(lèi)的含量分布較為平均，僅一條河流二噁英類(lèi)含量高于美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(US EPA)飲用水中二噁英含量標(biāo)準(zhǔn)0.030 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1，本研究調(diào)研小清河的支流主要為城市內(nèi)部泄洪的季節(jié)性河流，因此得出調(diào)研支流的二噁英類(lèi)污染風(fēng)險(xiǎn)較低。

2.1.2 雌激素類(lèi)

由圖3可知，8條支流雌激素類(lèi)的年平均毒性當(dāng)量濃度為0.007～0.050 ng E2-eq·L-1，除HC支流的年平均毒性當(dāng)量濃度達(dá)0.050 ng E2-eq·L-1外，其余支流雌激素類(lèi)活性濃度均在0.020 ng E2-eq·L-1左右。

由圖4所示，雌激素類(lèi)檢測(cè)結(jié)果表明，2017年9月—2018年8月，LS、XJ和DX等3條支流全年未檢測(cè)到雌激素類(lèi)活性(

圖4 雌激素類(lèi)分布特征Fig. 4 Characteristics of estrogen distribution

2.1.3 腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)

腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)的年平均毒性當(dāng)量濃度為1.8～9.6 ng Dex-eq·L-1，由圖3可知，有4條支流年平均腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)毒性當(dāng)量低于方法檢出限(LOD=3.9 ng Dex-eq·L-1)，其余支流年平均腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)毒性當(dāng)量濃度范圍為4.4～9.6 ng Dex-eq·L-1。

測(cè)試結(jié)果表明，XJ支流全年未檢測(cè)到腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)活性(

圖5 腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)分布特征Fig. 5 Characteristics of glucocorticoid distribution

2.1.4 雄激素類(lèi)

雄激素類(lèi)除2018年2—3月在DL、XL和GS支流各檢出一次外，其余均未檢測(cè)到雄激素類(lèi)活性(

2.2 小清河(濟(jì)南段)支流EDCs對(duì)水環(huán)境污染的貢獻(xiàn)

由圖3和圖6可知，在調(diào)研期內(nèi)，小清河(濟(jì)南段)的主要支流都受到了4類(lèi)EDCs不同程度的污染，位于居民區(qū)和商業(yè)區(qū)的GS、DL和XL等3條支流均檢測(cè)到了4類(lèi)EDCs活性，由地下泉水匯流而成的HC和LY支流檢測(cè)到了除雄激素類(lèi)之外的其余3類(lèi)EDCs活性，LS和DX支流檢測(cè)到了二噁英類(lèi)和腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)活性，XJ支流只檢測(cè)到二噁英類(lèi)活性。

圖3 二噁英類(lèi)、雌激素類(lèi)和腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)年平均含量分布注：二噁英的含量單位為ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1；雌激素的含量單位為E2-eq·L-1。Fig. 3 Average annual distribution of dioxin, estrogen and glucocorticoidNote: The unit of dioxin content is ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1; the unit of estrogen content is E2-eq·L-1.

由圖6可知，CALUX生物分析法測(cè)定的小清河(濟(jì)南段)支流中每類(lèi)EDCs的毒性當(dāng)量對(duì)4類(lèi)EDCs的貢獻(xiàn)分析結(jié)果顯示，腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)、二噁英類(lèi)、雌激素類(lèi)和雄激素類(lèi)等4類(lèi)EDCs中，對(duì)水環(huán)境EDCs污染貢獻(xiàn)最大的是腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)，占比均達(dá)90%以上。

圖6 4種內(nèi)分泌干擾物(EDCs)對(duì)各支流水環(huán)境污染的貢獻(xiàn)Fig. 6 Contribution of four endocrine disrupting chemicals (EDCs) to river water environment

3 討論(Discussion)

3.1 二噁英類(lèi)

有文獻(xiàn)報(bào)道，環(huán)境中二噁英類(lèi)的主要來(lái)源是焚燒的大氣沉積[12]，這可能是二噁英類(lèi)在小清河(濟(jì)南段)主要支流中分布較為平均的原因。近年來(lái)針對(duì)環(huán)境二噁英污染的研究，大多集中在大氣[5]、土壤[13]的含量篩查，利用生物方法對(duì)水環(huán)境中二噁英類(lèi)的研究，多以地表水[14]、污水[15]和沉積物[16-18]為研究對(duì)象，Shi等[19]使用EROD生物測(cè)試法評(píng)價(jià)了我國(guó)長(zhǎng)江、淮河和太湖流域的二噁英類(lèi)含量為0.062～0.116 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1；黃楚琴等[20]應(yīng)用酵母報(bào)道基因系統(tǒng)，檢測(cè)了我國(guó)廣州市內(nèi)河涌水體二噁英類(lèi)含量范圍為0.0136～50.1890 ng·L-1，污染較為嚴(yán)重的可能原因是工業(yè)排污和大量的水陸交通尾氣排放，珠江水體二噁英類(lèi)當(dāng)量范圍為0.0130～6.2210 ng·L-1。我國(guó)濟(jì)南市河流夏季處于豐水期，由于降水量大且調(diào)研支流多為泄洪河道，大氣中含二噁英類(lèi)的顆粒物隨著雨水匯入各支流，此類(lèi)物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定且難以被降解，這可能是各支流夏季二噁英類(lèi)含量水平高于其他三季的主要原因。對(duì)比近年來(lái)我國(guó)南方重要流域的二噁英類(lèi)含量報(bào)道，小清河(濟(jì)南段)主要支流受二噁英類(lèi)的污染程度較低。

3.2 雌激素類(lèi)

眾多學(xué)者使用生物分析法對(duì)各國(guó)家河流的雌激素類(lèi)毒性含量進(jìn)行了測(cè)試，如表1所示，比較發(fā)現(xiàn)，小清河(濟(jì)南段)主要支流雌激素類(lèi)的含量與文獻(xiàn)報(bào)道的其他國(guó)家河流相比[10,17,19,21-24]，含量水平相對(duì)較低，說(shuō)明雌激素類(lèi)的污染風(fēng)險(xiǎn)較低。

表1 各國(guó)河流水中雌激素類(lèi)活性的相關(guān)研究Table 1 Some research about estrogen activity in river waters of different countries

有學(xué)者證實(shí)了細(xì)菌在需氧和厭氧條件下，具有降解環(huán)境中雌激素類(lèi)固醇的作用[25-26]，Vandermarken等[17]從體外生物降解實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)河流中天然存在的細(xì)菌群落對(duì)雌激素類(lèi)EDCs具有一定的自凈能力。本研究所調(diào)研河流多具有城市泄洪功能，濟(jì)南夏秋兩季雨水豐盛，河流中天然細(xì)菌群落較為豐富，細(xì)菌群落對(duì)雌激素類(lèi)EDCs的天然降解及較大雨水量的自然稀釋，可能是夏秋季節(jié)雌激素類(lèi)活性低的原因。此外，有研究表明，雌激素類(lèi)大多來(lái)自城市、農(nóng)業(yè)或家庭排放的小分子[27-28]，5條檢出雌激素類(lèi)的支流分布在人口較為密集的居民區(qū)，因此，家庭廢水排放對(duì)河流中雌激素類(lèi)的污染不容忽視。

3.3 腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)

近年來(lái)，應(yīng)用CALUX法篩查評(píng)估地表水、河流中腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)的含量也見(jiàn)諸報(bào)道。已有研究報(bào)道了捷克共和國(guó)和瑞士的河流、萊茵河流域(荷蘭境內(nèi)的部分)、荷蘭某地表河流的腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)含量水平為

一定量的腎上腺皮質(zhì)激素，主要通過(guò)哺乳動(dòng)物尿液排出體外，通過(guò)污水處理廠或潮濕天氣徑流排放到水生環(huán)境中，并成為水生環(huán)境中潛在的污染物[33]。而本研究中DX河河道最長(zhǎng)，流經(jīng)區(qū)域復(fù)雜包含居民區(qū)、工業(yè)區(qū)和農(nóng)業(yè)區(qū)，該支流取樣點(diǎn)處于下游且接收了污水處理廠排放的出水，賈瑞寶等[34]研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)行污水處理工藝對(duì)腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)EDCs的去除能力有限，處理后出水的腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)當(dāng)量濃度依然較高，這些可能是導(dǎo)致該支流全年檢出腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)活性且當(dāng)量濃度較高的原因。荷蘭學(xué)者對(duì)地表水和污水出水中多種激素活性的研究也有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)，他們觀測(cè)到所測(cè)試的環(huán)境水樣中雄激素類(lèi)、孕激素類(lèi)和腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)活性水平大多高于雌激素類(lèi)水平[10]。

對(duì)比已報(bào)道的數(shù)據(jù)來(lái)看，4條檢出腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)的小清河(濟(jì)南段)支流已經(jīng)受到了該類(lèi)EDCs較大程度的污染，其含量水平高于已報(bào)道的飲用水中的腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)濃度，小清河作為濟(jì)南市重要的城市內(nèi)部河流，其支流水環(huán)境中存在顯著水平的腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)EDCs應(yīng)該引起重視。

3.4 雄激素類(lèi)

Shi等[19]在中國(guó)東部長(zhǎng)江、淮河和太湖流域的雄激素類(lèi)含量水平篩查中，未發(fā)現(xiàn)雄激素類(lèi)活性，本研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用CALUX法測(cè)試了濟(jì)南市4座水庫(kù)二噁英類(lèi)、雌激素類(lèi)、腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)和雄激素類(lèi)的含量水平，二噁英類(lèi)當(dāng)量濃度范圍為0.009～0.250 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1，雌激素類(lèi)當(dāng)量濃度范圍0.040～0.250 ng E2-eq·L-1，未發(fā)現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)和雄激素類(lèi)活性[35]。河流水中雄激素活性的相關(guān)報(bào)道較少，由測(cè)試結(jié)果可得出小清河(濟(jì)南段)支流受雄激素類(lèi)EDCs的污染水平較低。

城市河流作為重要的泄洪排污方式，其EDCs等新型污染物的污染也應(yīng)該引起相應(yīng)的重視。從調(diào)研結(jié)果看出，在為期1年的調(diào)研期內(nèi)，小清河(濟(jì)南段)主要支流均受到4類(lèi)EDCs不同程度的污染，對(duì)比已報(bào)道的國(guó)內(nèi)外研究數(shù)據(jù)，二噁英類(lèi)和雌激素類(lèi)的污染水平總體較低，受雄激素類(lèi)EDCs的污染風(fēng)險(xiǎn)較低，4類(lèi)EDCs中腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)的毒性當(dāng)量對(duì)水環(huán)境污染貢獻(xiàn)最大。

未來(lái)研究中，將生物分析作為快速篩查手段，篩選污染物類(lèi)型，再結(jié)合化學(xué)分析精準(zhǔn)定位污染物，實(shí)現(xiàn)生物分析和化學(xué)分析的有效結(jié)合，為水環(huán)境污染物篩查和污染物去除研究提供數(shù)據(jù)支撐。

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