甘俊英，秦建新，原海亮，李強(qiáng)，薛玉英,*

1. 環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009 2. 蘇州匯涵醫(yī)用科技發(fā)展有限公司，常熟 215500 3. 常熟市市場(chǎng)監(jiān)督管理局，常熟 215500

金屬硫蛋白(metallothionein, MT)是一類富含半胱氨酸、相對(duì)分子質(zhì)量較低(6～7 kDa)的金屬結(jié)合蛋白[1]，包含2個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域，即α結(jié)構(gòu)域和β結(jié)構(gòu)域。MT由Margoshes和Vallee于1957年首次從馬的腎臟中分離出來，至今對(duì)MT的研究已走過半個(gè)多世紀(jì)，大多數(shù)研究集中在脊椎動(dòng)物MT的結(jié)構(gòu)、功能和基因調(diào)節(jié)等方面，研究成果豐富，涉及生物化學(xué)、衛(wèi)生毒理學(xué)、食品科學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域[2]。由于MT特有的氨基酸組成與分子結(jié)構(gòu)，其在機(jī)體內(nèi)具有多種生物功能。首先，MT的特殊結(jié)構(gòu)使得它具有和多種金屬離子結(jié)合的能力，包括鎘、鋅、鉛和鐵等[3-4]，MT可通過與金屬離子的結(jié)合，降低重金屬對(duì)機(jī)體的毒害，達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體生理狀態(tài)的作用[5]。有研究表明，MT還具有清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)的功能[6-8]，但其作用機(jī)理仍不清楚，一般認(rèn)為其可以清除體內(nèi)過多的自由基，從而降低氧化損傷程度[9]。癌癥仍是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的一個(gè)瓶頸，據(jù)《2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)》報(bào)道，2018年全球大約有1 810萬癌癥新發(fā)病例和960萬癌癥死亡病例，新增1 810萬癌癥病例中，亞洲占據(jù)近1/2，960萬癌癥死亡患者中，亞洲占近70%[10]；已有多項(xiàng)研究探索了MT在多種惡性腫瘤中的表達(dá)，通過多種作用機(jī)制發(fā)揮促癌及抑癌的雙重功能[11]。鑒于MT的多種生物功能，未來外源性補(bǔ)充MT具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其是MT結(jié)合金屬作用，其在植物中的表達(dá)可提高植物抗脅迫能力[12]，已被應(yīng)用到環(huán)境重金屬污染的治理當(dāng)中。

MT主要有4種異構(gòu)體，MT-Ⅰ和MT-Ⅱ在大多數(shù)哺乳動(dòng)物的內(nèi)臟器官中廣泛存在，尤以肝、腎細(xì)胞為主，而且參加其功能調(diào)節(jié)。MT-Ⅲ分布主要限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中，還有少量分布于生殖細(xì)胞、小腸、胃、腎和嗅覺皮質(zhì)細(xì)胞中。MT-Ⅳ存在于皮膚和胃腸道上部。目前，MT的獲取途徑分為3類，一是從動(dòng)物組織中提取[13]，二是從植物中提取[14]，三是采用基因工程技術(shù)，將MT基因克隆至大腸桿菌或乳酸菌等宿主中進(jìn)行發(fā)酵提純[15]，相對(duì)于前2種方法，第3種方法獲取的MT純度高，產(chǎn)品單一性好，性能更加穩(wěn)定，特別是對(duì)人源MT蛋白的異源表達(dá)，使得人源蛋白產(chǎn)品的應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化成為可能，同時(shí)人源蛋白機(jī)體同源性好，可以避免一些免疫原反應(yīng)，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。王欣卉等[16]利用體外抗氧化試驗(yàn)驗(yàn)證了酵母源金屬硫蛋白具有清除自由基及抑制脂質(zhì)過氧化的功能，表現(xiàn)出良好的抗氧化性。由于其抗氧化功能及低分子量的特性[17]，MT將成為化妝品領(lǐng)域最佳的生物添加劑，與目前化妝品中常用的抗氧化添加劑(超氧化物歧化酶(SOD))相比，MT分子量低，更易被皮膚吸收。顧群和杜欣[18]將鋅合MT加入到面霜中，利用家兔及豚鼠模型，從整體動(dòng)物水平評(píng)價(jià)了鋅合MT的皮膚毒性，而在細(xì)胞水平上對(duì)其皮膚毒性的探討尚鮮見報(bào)道。

本研究針對(duì)大腸桿菌基因工程制備的重組人金屬硫蛋白Ⅲα短肽(rh-MT-Ⅲα)，以人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞為模型，從細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)其可能的毒性效應(yīng)，進(jìn)而利用秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans,C.elegans)為模型，進(jìn)行了整體模型毒性評(píng)價(jià)，為rh-MT-Ⅲα的安全應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑儀器與細(xì)胞來源

1.1.1 材料與試劑

試驗(yàn)樣品：重組人MT-Ⅲα短肽，商品名為重組人巰基短肽(rh-MT-Ⅲα)，由蘇州匯涵醫(yī)用科技發(fā)展有限公司提供，是該公司利用大腸桿菌基因工程高密度發(fā)酵并純化獲得的人源金屬硫蛋白Ⅲα亞基片段，分子量3.7 kD，每分子蛋白含游離巰基6個(gè)，蛋白SDS-PAGE純度≥98%。

主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(博士德生物工程有限公司)，噻唑藍(lán)(MTT)(美國Sigma公司)，LDH試劑盒(碧云天生物公司)，細(xì)胞凋亡試劑盒(美國BD公司)。磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氯化鈉(NaCl)、硫酸鎂、蛋白胨、瓊脂、磷酸鉀、氯化鈣、膽固醇、酵母提取物、胰蛋白胨、氫氧化鈉、鹽酸和次氯酸鈉等(南京晚晴化玻儀器有限公司)。

1.1.2 主要儀器

3423型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；Biobase生物安全柜(中國博科控股集團(tuán)有限公司)、FSX型圖像導(dǎo)航儀(日本Olympus公司)、5424R型離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Epoch型酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司)；MVS-1型渦旋混合器(中國北京金紫光科技發(fā)展有限公司)；BS-210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；MilliQ Advantage型超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)；Olympus SZ61體視顯微鏡(日本Olympus公司)；Eppendorf 5417R臺(tái)式高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)(中國蘇州凈化設(shè)備有限公司)；SHP150生化培養(yǎng)箱(中國上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物

HaCaT細(xì)胞是非腫瘤來源的人正常皮膚永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株，與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞分化特性相似，可以繁殖150代以上。本試驗(yàn)用HaCaT細(xì)胞購自上海名勁生物科技有限公司。

L929細(xì)胞是非腫瘤來源的小鼠成纖維細(xì)胞，購自上海名勁生物科技有限公司。

野生型秀麗隱桿線蟲株(N2)取自美國明尼蘇達(dá)大學(xué)線蟲遺傳中心(CaenorhabditisGenetic Center，CGC)，雌雄同體。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 染毒溶液的配制

細(xì)胞試驗(yàn)：染毒液劑量依據(jù)現(xiàn)有研究試驗(yàn)劑量擴(kuò)大10倍。使用完全培養(yǎng)基，將rh-MT-Ⅲα配制成濃度為2 mg·mL-1的原溶液，渦旋1 min混勻，染毒時(shí)利用完全培養(yǎng)基將原液稀釋成濃度為25～400 μg·mL-1的rh-MT-Ⅲα溶液。線蟲實(shí)驗(yàn)：使用超純水，將rh-MT-Ⅲα配制成濃度為1 mg·mL-1的原溶液，渦旋1 min混勻，染毒時(shí)利用純水將原液稀釋成濃度為5、50和500 μg·mL-1的rh-MT-Ⅲα溶液。染毒液均現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 劑量與染毒

(1)噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞活性試驗(yàn)：HaCaT細(xì)胞和L929細(xì)胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素)于37 ℃、5% CO2常規(guī)傳代培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，調(diào)整細(xì)胞懸浮液密度為1×105個(gè)·mL-1，分別接種于96孔板(每孔0.2 mL)和6孔板(每孔2 mL)中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸出原培養(yǎng)液，加入染毒液，劑量為25、50、100、200和400 μg·mL-1，完全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸出染毒液，加入MTT，4 h后緩慢吸出MTT，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床10 min后，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

(2)乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)同上，種板濃度為1×104個(gè)·mL-1。操作按照試劑盒步驟進(jìn)行。LDH為胞內(nèi)酶，一般在細(xì)胞外不能被檢測(cè)到，只有在細(xì)胞膜損傷時(shí)，可釋放到胞外而被檢測(cè)到，是評(píng)判細(xì)胞膜完整性的一個(gè)重要指標(biāo)。

(3)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：種板濃度同MTT，種板6孔板，每孔2 mL。染毒劑量選擇400 μg·mL-1，染毒時(shí)間為24 h。

(4)細(xì)胞凋亡：種板濃度及染毒劑量同MTT，種板6孔板，每孔2 mL。染毒24 h后，按照凋亡試劑盒步驟檢測(cè)細(xì)胞凋亡指標(biāo)。

(5)線蟲試驗(yàn)：以劑量為5、50和500 μg·mL-1的rh-MT-Ⅲα溶液進(jìn)行染毒，以同體積純水為空白對(duì)照，以200 μL體積加入含菌OP50的3 cm培養(yǎng)基均勻覆蓋，待其自然晾干后將同步化后L1期線蟲轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基上。染毒48 h后進(jìn)行線蟲運(yùn)動(dòng)行為(頭部擺動(dòng)和身體彎曲)、線蟲生長發(fā)育(體長)和咽泵頻率評(píng)價(jià)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組之間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(One-Way ANOVA)。兩組之間比較，若符合方差齊性，則采用LSD-t檢驗(yàn)方法，若方差不齊，則采用Games-Howell檢驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以mean±SD表示，檢測(cè)水平為P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。線蟲體長測(cè)量應(yīng)用image J軟件處理。

2 結(jié)果(Results)

2.1 細(xì)胞存活率及細(xì)胞膜損傷結(jié)果

rh-MT-Ⅲα對(duì)HaCaT細(xì)胞和L929細(xì)胞的存活率影響結(jié)果如圖1所示，在實(shí)驗(yàn)劑量下，與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率無明顯改變，與對(duì)照組基本持平，400 μg·mL-1劑量下，細(xì)胞存活率出現(xiàn)了降低，但這些改變均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。L929細(xì)胞存活率總體趨勢(shì)與HaCaT細(xì)胞相同，均為隨劑量升高而呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。

圖1 重組人金屬硫蛋白Ⅲα短肽(rh-MT-Ⅲα)對(duì)HaCaT細(xì)胞和L929細(xì)胞存活率的影響Fig. 1 Effect of recombinant human metallothionein Ⅲ-α peptide (rh-MT-Ⅲα) on survival rate of HaCaT and L929 cells

LDH檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組比較，2種細(xì)胞的LDH釋放率在400 μg·mL-1時(shí)顯著升高，25～200 μg·mL-1劑量下，LDH釋放率與對(duì)照組無明顯差異。HaCaT細(xì)胞LDH釋放率呈現(xiàn)先降低，后增高的趨勢(shì)，L929細(xì)胞的趨勢(shì)不明顯。

圖2 rh-MT-Ⅲα對(duì)HaCaT細(xì)胞和L929細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率的影響注：與對(duì)照組相比，* P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。Fig. 2 Effect of rh-MT-Ⅲα on lactate dehydrogenase (LDH) release of HaCaT and L929 cellsNote: Compared with the negative control group, *indicates significant differences at P<0.05 level; data are expressed as mean±standard deviation.

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

根據(jù)LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果，400 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞膜可能開始出現(xiàn)損傷，故選此劑量觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。2種細(xì)胞經(jīng)rh-MT-Ⅲα染毒24 h后，光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示，在400 μg·mL-1劑量下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞連接均緊密，HaCaT細(xì)胞呈鋪路石狀，L929細(xì)胞呈梭形，2種細(xì)胞染毒組與對(duì)照組未出現(xiàn)明顯差別。

圖3 rh-MT-Ⅲα對(duì)HaCaT細(xì)胞和L929細(xì)胞形態(tài)的影響注：(a) 陰性對(duì)照組(完全培養(yǎng)基)；(b) 400 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα溶液組；標(biāo)尺為20 μm。Fig. 3 Effect of rh-MT-Ⅲα on morphology of HaCaT and L929 cellsNote: (a) Negative control group, complete medium; (b) 400 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα solution; scale is 20 μm.

2.3 細(xì)胞凋亡結(jié)果

2種細(xì)胞經(jīng)rh-MT-Ⅲα染毒24 h后，細(xì)胞存活率及形態(tài)學(xué)觀察與對(duì)照組相比均未顯示出明顯差異，但LDH釋放量在400 μg·mL-1劑量下，明顯升高，基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)可能由于rh-MT-Ⅲα對(duì)2種細(xì)胞的凋亡(尤其早期凋亡)產(chǎn)生了影響，故考察了rh-MT-Ⅲα對(duì)2種細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，2種細(xì)胞凋亡率均在400 μg·mL-1劑量下明顯上升，尤其是早期凋亡率，為對(duì)照組的4倍～5倍。

圖4 rh-MT-Ⅲα對(duì)HaCaT細(xì)胞和L929細(xì)胞凋亡的影響注：與對(duì)照組相比，* P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。Fig. 4 Effect of rh-MT-Ⅲα onapoptosis of HaCaT and L929 cellsNote: Compared with the negative control group, * indicates significant differences at P<0.05 level; data are expressed as mean±standard deviation.

2.4 rh-MT-Ⅲα對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)行為的影響

經(jīng)rh-MT-Ⅲα染毒48 h后，檢測(cè)線蟲運(yùn)動(dòng)行為包括頭部擺動(dòng)和身體彎曲頻率，結(jié)果如圖5所示，染毒液以5、50和500 μg·mL-1劑量均勻覆蓋含大腸桿菌的NGM線蟲培養(yǎng)基后自然風(fēng)干，加入L1期線蟲延長暴露48 h，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中頭部擺動(dòng)頻率(20 s)及身體彎曲頻率(60 s)無明顯差異。

圖5 rh-MT-Ⅲα對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)行為的影響Fig. 5 Effect of rh-MT-Ⅲα on movement of C. elegans

2.5 rh-MT-Ⅲα對(duì)線蟲體長的影響

L1期線蟲延長染毒48 h后，用M9溶液清洗3遍，取出線蟲，以100 μL 60 μmol·L-1的左旋咪唑溶液麻醉線蟲1 min后用移液槍吸取適量線蟲于載玻片上，于顯微鏡下觀察每組線蟲并捕捉圖像，獲取圖像經(jīng)由軟件Image J處理測(cè)量，結(jié)果如圖6所示，高劑量組(500 μg·mL-1)線蟲平均體長為965.53 μm，中劑量組(50 μg·mL-1)線蟲平均體長為996.80 μm，低劑量組(5 μg·mL-1)線蟲平均體長為972.53 μm，與對(duì)照組平均體長((968.35±93.82) μm)相比，染毒組線蟲體長未出現(xiàn)明顯差異。

圖6 rh-MT-Ⅲα對(duì)線蟲體長的影響Fig. 6 Effect of rh-MT-Ⅲα on length of C. elegans

2.6 rh-MT-Ⅲα對(duì)線蟲攝食行為的影響

不同濃度rh-MT-Ⅲα對(duì)線蟲攝食行為的影響如圖7所示，與對(duì)照組相比，染毒組線蟲咽泵頻率的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7 rh-MT-Ⅲα對(duì)線蟲咽泵頻率的影響Fig. 7 Effect of rh-MT-Ⅲα on pumping rate of C. elegans

3 討論(Discussion)

2種細(xì)胞存活率及形態(tài)學(xué)結(jié)果，在研究劑量下與對(duì)照組相比未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但存活率呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。LDH釋放率在400 μg·mL-1劑量時(shí)明顯上升，表明細(xì)胞膜出現(xiàn)損傷，結(jié)合細(xì)胞凋亡結(jié)果分析，在凋亡初期，細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，早期凋亡細(xì)胞增多，可能部分細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)已經(jīng)受到損傷。因此，在進(jìn)行細(xì)胞毒性研究時(shí)，應(yīng)結(jié)合2種以上試驗(yàn)方法以獲得更加全面的細(xì)胞毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)。

MT具有和多種金屬離子結(jié)合的能力，包括鎘、鋅、鉛和鐵等[3-4]，利用這一特性可降低重金屬對(duì)機(jī)體的毒害，發(fā)揮解毒和調(diào)節(jié)機(jī)體生理狀態(tài)的作用[5]。線蟲是一種自由生活在土壤中的生物，以細(xì)菌為食，易于在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)且成本低廉、遺傳學(xué)背景清晰[19]，本研究選用秀麗隱桿線蟲N2作為體內(nèi)毒性評(píng)價(jià)模型，探討rh-MT-Ⅲα對(duì)線蟲的毒性效應(yīng)。經(jīng)不同濃度(5、50和500 μg·mL-1)rh-MT-Ⅲα延長暴露48 h后，與對(duì)照組相比，線蟲運(yùn)動(dòng)行為(頭部擺動(dòng)和身體彎曲頻率)、發(fā)育(體長)及攝食行為(咽泵頻率)各生物學(xué)終點(diǎn)與對(duì)照組相比未顯示出明顯差異，說明rh-MT-Ⅲα在實(shí)驗(yàn)劑量下無明顯毒性效應(yīng)。其結(jié)果與細(xì)胞毒性中LDH釋放率的結(jié)果不同，原因可能是由于線蟲消化道對(duì)于rh-MT-Ⅲα的消耗或因?yàn)楸┞稌r(shí)間較短，未來需要進(jìn)行rh-MT-Ⅲα對(duì)線蟲更長暴露下的毒性評(píng)價(jià)，以期更加全面地探討rh-MT-Ⅲα應(yīng)用的安全性。

本研究初步探討了rh-MT-Ⅲα的細(xì)胞及線蟲毒性效應(yīng)，目前，實(shí)驗(yàn)室研究鋅合金屬硫蛋白作為化妝品添加劑的劑量為25 mg·kg-1[18]，本研究選用的劑量范圍是其2倍～16倍，更加確保了rh-MT-Ⅲα應(yīng)用劑量的生物安全性。對(duì)于內(nèi)源性及外源性MT功能的研究很多，主要認(rèn)為其分子作用機(jī)制是可以降低機(jī)體氧化損傷水平及Caspase-3表達(dá)水平，通過P53通路抑制細(xì)胞凋亡[20]以起到保護(hù)功能。于立博[21]利用體內(nèi)加體外實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了外源性給予植物MT具有降低鉛毒性作用，并利用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)了組織中MT含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陽性對(duì)照組比較，高劑量干預(yù)組巰基含量顯著增加，證明外源性MT可被機(jī)體吸收，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MT對(duì)于鉛的解毒作用，但未涉及其進(jìn)入細(xì)胞的方式和機(jī)體吸收。李曉偉和魯曼[22]利用含MT制劑對(duì)鉛中毒兒童進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)MT制劑能有效降低血鉛濃度，但這個(gè)試驗(yàn)只是前后對(duì)照且干預(yù)前后間隔時(shí)間長，無法解釋其排鉛效用是由內(nèi)源性MT過表達(dá)產(chǎn)生，還是外源性MT由胃腸道進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生，對(duì)胃腸道對(duì)MT功能的影響試驗(yàn)結(jié)果也無法解釋。徐炳政[23]體外模擬胃腸道環(huán)境，研究了胃腸道對(duì)外源性MT功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模擬胃腸環(huán)境對(duì)酵母源MT巰基具有一定程度的破壞作用，但MT-Ⅰ與MT-Ⅱ在模擬胃腸環(huán)境中均能顯著地螯合鉛離子，并在12 h內(nèi)能較好地抵抗模擬胃腸環(huán)境的消化，保持其螯合鉛離子能力。在這些外源性MT功能實(shí)驗(yàn)中，其發(fā)揮作用是在胞外形成抗氧化環(huán)境而結(jié)合重金屬，還是在胞內(nèi)進(jìn)行分子調(diào)控，尚不明確，未來對(duì)于完整MT尤其是基因工程這種新方式制備的MT片段如何進(jìn)入細(xì)胞并被組織吸收的問題，尚需進(jìn)一步研究。

MT幾乎存在于所有哺乳動(dòng)物中，是一類低分子量的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，富含半胱氨酸，幾乎無毒。MT由于其豐富的生物學(xué)功能，應(yīng)用前景十分廣闊，但由于目前動(dòng)物肝臟提取這種方式獲取量極少并且純度不高，故近些年來，利用基因工程技術(shù)，采用大腸桿菌重組發(fā)酵的制備方式越來越受到關(guān)注，這種方式可大大提高M(jìn)T產(chǎn)量和純度，但其工業(yè)制備方法殘余物可能會(huì)成為其產(chǎn)生毒性效應(yīng)的原因。因此，對(duì)rh-MT-Ⅲα進(jìn)行全面的生物安全性評(píng)價(jià)，對(duì)于確保其安全應(yīng)用具有十分重要的意義。

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