李玲玲，沈章軍，宋玉芳，史奕

1. 合肥師范學(xué)院，合肥 230009 2. 中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽 110016

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥由于具有高效、對哺乳動物和鳥類低毒、且易降解等優(yōu)點，已經(jīng)逐漸成為有機磷、有機氯和氨基甲酸酯類殺蟲劑的替代品而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和公共場所防蟲工作中[1]。根據(jù)構(gòu)效學(xué)和特征學(xué)，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥被劃分為Ⅰ型和Ⅱ型[2-3]。聯(lián)苯菊酯，一種Ⅰ型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛用于防治昆蟲和螨蟲[4]。氟氯氰菊酯，一種Ⅱ型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、獸醫(yī)業(yè)以及家庭住宅中的防蟲過程中[5]。隨著疏水性擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的大量使用，它們被土壤顆粒和沉積物強烈吸附，從而對生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生不可逆的損傷[6-9]。

α-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase,α-Glu)是一種消化酶，可以參與有機體內(nèi)碳水化合物的消化并釋放葡萄糖，具有被用作生物指標(biāo)以評估環(huán)境中農(nóng)藥暴露引發(fā)的生態(tài)風(fēng)險的潛力[10-11]。蛋白酶是另外一類消化酶，已經(jīng)在赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，其不僅具有水解纖維蛋白和其他蛋白成短肽或自由氨基酸的作用，也具有活化一些酶類的作用，例如凝血素和血纖維蛋白溶酶原[12-13]。前期研究主要關(guān)注蚯蚓蛋白酶的臨床應(yīng)用，而將蛋白酶活性作為評估環(huán)境污染物風(fēng)險指標(biāo)的研究未見報道[12]。消化酶活性與有機體的攝食能力和生長能力息息相關(guān)，而在筆者團隊前期研究中發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下赤子愛勝蚓的體質(zhì)量增長率被抑制，因此，可以將消化酶作為環(huán)境潛在毒性診斷標(biāo)志物[14-16]?；谝陨涎芯?，筆者假設(shè)聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯影響了蚯蚓體內(nèi)消化酶的活性，從而導(dǎo)致其體質(zhì)量增長率被抑制。

蚯蚓是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的分解者，影響著土壤生態(tài)系統(tǒng)中的分解活性、營養(yǎng)礦化和初級生產(chǎn)[17]。蚯蚓通過其行為活動能夠改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤透氣、排水和深層持水能力，扮演著“土壤生態(tài)系統(tǒng)工程師”的重要角色。生活在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的蚯蚓攝取大量的土壤，可以通過皮膚和腸道直接接觸土壤污染物，已經(jīng)被經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)和國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)推薦為研究化學(xué)品對土壤生態(tài)系統(tǒng)無脊椎動物影響的模式生物[18-19]。目前，應(yīng)用蚯蚓診斷生態(tài)毒理的研究多集中在污染物暴露對其生存、生長及繁殖等個體水平上的影響。然而，隨著生態(tài)毒理診斷的發(fā)展，蚯蚓個體水平指標(biāo)已經(jīng)不能滿足低劑量污染條件下的風(fēng)險評估，隨之應(yīng)運而生的是蚯蚓生物標(biāo)志物在土壤生態(tài)系統(tǒng)風(fēng)險評估中的應(yīng)用。

本研究以模式生物赤子愛勝蚓為實驗動物，通過探究4種消化酶(α-葡萄糖苷酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶)的響應(yīng)，評估聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯對赤子愛勝蚓的消化毒性效應(yīng)，從而為進一步評估擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的土壤生態(tài)風(fēng)險，闡釋其毒性機制提供基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 供試土壤

土壤取自中國科學(xué)院沈陽農(nóng)業(yè)生態(tài)站保護行0～20 cm土層，該土壤具有以下理化性質(zhì)：pH 6.2，堿解氮(K-N)0.091%，總磷(TP)0.04%，總鉀(TK)0.18%，有機質(zhì)(OM)1.65%，陽離子交換量(CEC)12.3 cmol·kg-1，最大持水量(WHC)32%。土壤的粒徑分布如下：砂粒(>50 μm)占22%，粉粒(1～50 μm)占64%，黏粒(<1 μm)占14%。土壤采集后去除植物等殘渣，室溫條件下風(fēng)干，過20目篩后備用。

1.1.2 蚯蚓

赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)購買于沈陽華清源蚯蚓養(yǎng)殖公司，挑選300～400 mg具有健康環(huán)帶的成蚓在潔凈土壤中于(20±1) ℃(光照∶黑暗比為12 h∶12 h)馴化至少2周。

1.1.3 試劑和儀器

試劑：聯(lián)苯菊酯(97%)和氟氯氰菊酯(95%)購買于上海永遠(yuǎn)化工有限公司。牛血清蛋白(≥95%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)(99.5%)、乙二胺四乙酸(EDTA)(≥99%)、二硫蘇糖醇(DTT)(99%)、對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(α-pNPG)(≥99.7%)、轉(zhuǎn)化酶(≥300 units·mg-1固體)、酪蛋白(≥98%)和酪氨酸(≥99%)購買于美國西格瑪奧德里奇公司，磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、醋酸(HAC)、醋酸鈉(NaAc)和硼砂(Borax)等其他試劑均為分析純，購買于沈陽萊博科貿(mào)有限責(zé)任公司。

儀器：BS210S萬分之一電子分析天平(Sartorius，德國)，HPG-280BX型光照培養(yǎng)箱(哈東聯(lián)，北京)，HPS-280型光照培養(yǎng)箱(哈東聯(lián)，北京)，10 mL手動玻璃勻漿器(凱瑞實驗器材，江蘇)，CP-80MX低溫超速離心機(Hitachi，日本)，Multiskan FC-51119000酶標(biāo)儀(Thermo，美國)，高效液相色譜儀(Thermo Fisher Ultimate 3000，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 污染暴露實驗

根據(jù)前期急性毒性實驗半數(shù)致死濃度結(jié)果，設(shè)置本實驗亞致死劑量分別為：聯(lián)苯菊酯0、10、20、40、60和80 mg·kg-1；氟氯氰菊酯0、5、10、20、30和60 mg·kg-1，暴露期為28 d，其中0 mg·kg-1即為對照組。聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯溶解在50 mL丙酮中，然后撒到土壤中拌勻，平衡48 h以揮發(fā)丙酮，調(diào)節(jié)水分含量至60% WHC。每個濃度有3個重復(fù)，每個重復(fù)含有2 000 g土壤和40條蚯蚓。

1.2.2 指標(biāo)測定

分別于暴露第3、7、14、21和28天，從每個重復(fù)組中取出3條蚯蚓，放于濕潤濾紙上清腸24 h，然后冰塊上解剖獲取內(nèi)臟。由于赤子愛勝蚓內(nèi)臟較少，因此每個重復(fù)組中取出的3條蚯蚓內(nèi)臟合并為一個樣品。內(nèi)臟使用0.15 mol·L-1KCl清洗，然后放于2 mL勻漿緩沖液(包含250 mmol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1Tris pH 7.5，1 mmol·L-1DTT和1 mmol·L-1EDTA)中進行手動勻漿。勻漿液于4 ℃、15 000×g下離心30 min，取上清液用于測定消化酶活性。

α-Glu活性測定參考Agustí等[20]和Boyd[21]的方法，將80 μL內(nèi)臟上清液和80 μL的10 mmol·L-1α-pNPG溶液放于96孔板內(nèi)于37 ℃下孵育反應(yīng)1 h，而后通過添加80 μL的15% Na2CO3溶液以終止反應(yīng)，然后放于酶標(biāo)儀405 nm處測定其吸光度。以轉(zhuǎn)化酶作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，α-Glu活性表示為單位質(zhì)量(mg)蛋白參與反應(yīng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化酶的量(U·mg-1protein)。

蛋白酶活性測定采用福林酚法，是在Hidalgo等[22]的方法基礎(chǔ)之上略作調(diào)整后的方法。酪蛋白作為蛋白酶水解作用的底物，反應(yīng)緩沖液分別使用0.2 mol·L-1NaAc-0.2 mol·L-1HAC(pH 3.6)，0.2 mol·L-1Na2HPO4-0.2 mol·L-1NaH2PO4(pH 7.0)和0.05 mol·L-1Borax-0.2 mol·L-1NaOH(pH 10)。100 μL的酪蛋白水溶液(1%)、100 μL內(nèi)臟上清液和100 μL反應(yīng)緩沖液，放于40 ℃水浴鍋中孵育反應(yīng)15 min，之后加入300 μL的0.4 mol·L-1三氯乙酸，然后放于4 ℃下靜置10 min，以10 000×g離心5 min。取離心后的100 μL上清液，加入500 μL的0.4 mol·L-1Na2CO3溶液和100 μL的福林酚顯色液充分混合，放于40 ℃水浴中顯色15 min。顯色結(jié)束后，取200 μL溶液加入96孔板中，放于酶標(biāo)儀測定溶液于650 nm處的吸光度。酪氨酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，1 U蛋白酶活性定義為在40 ℃各pH環(huán)境下單位時間(min)產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需要的酶量(酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶)。

土壤農(nóng)藥殘留量的測定根據(jù)張志勇等[23]的方法并加以改進，分別于暴露第3、7、14、21和28天取出聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯染毒的土壤樣品，使用氣相色譜(GC)測定土壤中2種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留量，該部分?jǐn)?shù)據(jù)已發(fā)表[15-16]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Kolmogorov-Smirnov檢驗和Levene檢驗用于正態(tài)分布和方差齊性檢驗。使用Dunnett多重檢驗比較各暴露時間下擬除蟲菊酯類農(nóng)藥處理組與對照組之間的顯著性差異。如果數(shù)據(jù)不能滿足勻質(zhì)性，使用對數(shù)轉(zhuǎn)換，如果轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)后依然不滿足方差齊性，則使用Kruskal-Wallis H非參數(shù)檢驗進行數(shù)據(jù)分析。圖形使用SigmaPlot 12.5制作。

2 結(jié)果(Results)

2.1 聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓α-Glu活性的響應(yīng)

如圖1所示，在暴露初期第3天時，20～80 mg·kg-1聯(lián)苯菊酯處理組中蚯蚓α-Glu活性增加，說明在早期聯(lián)苯菊酯能夠誘導(dǎo)消化酶α-Glu的水解作用。隨著時間延長，在暴露第7、14和28天，高劑量聯(lián)苯菊酯(60～80 mg·kg-1)對α-Glu活性起到抑制作用，即消化酶α-Glu的水解作用在長時間的高劑量組暴露下被干擾。如圖2所示，在暴露21 d內(nèi)，除第14天外，其他暴露時間下，氟氯氰菊酯能夠顯著抑制蚯蚓體內(nèi)的α-Glu活性。在暴露第28天下，氟氯氰菊酯處理組蚯蚓α-Glu活性與對照組無顯著差異。2種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥暴露下，蚯蚓α-Glu活性對氟氯氰菊酯的響應(yīng)更為敏感。

圖1 聯(lián)苯菊酯暴露下蚯蚓體內(nèi)α-葡萄糖苷酶活性的變化注：α-Glu表示α-葡萄糖苷酶；與對照組相比有顯著性差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。Fig. 1 Changes of α-Glu activity in earthworms after exposure to bifenthrin in soilNote: α-Glu represents alpha-glucosidase; compared with the control, there are significant differences (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

圖2 氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓體內(nèi)α-葡萄糖苷酶活性的變化注：α-Glu表示α-葡萄糖苷酶；與對照組相比有顯著性差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。Fig. 2 Changes of α-Glu activity in earthworms after exposure to cyfluthrin in soilNote: α-Glu represents alpha-glucosidase; compared with the control, there are significant differences (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

2.2 聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓蛋白酶活性的響應(yīng)

在聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下，蚯蚓體內(nèi)3種蛋白酶活性(酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶)被測定。如圖3(a)所示，在暴露初期第3天時，酸性蛋白酶活性被20～80 mg·kg-1聯(lián)苯菊酯顯著誘導(dǎo)。隨著暴露時間的延長，誘導(dǎo)作用降低。如圖3(b)所示，與對照組相比，在暴露初期第3天時，中性蛋白酶活性被20～80 mg·kg-1聯(lián)苯菊酯顯著誘導(dǎo)，隨著暴露時間延長，高劑量組(60～80 mg·kg-1)誘導(dǎo)作用減弱。如圖3(c)所示，在暴露第3天，隨著濃度的增加，堿性蛋白酶活性增加，在60 mg·kg-1和80 mg·kg-1聯(lián)苯菊酯處理組達到顯著誘導(dǎo)，分別是對照組的1.82倍和1.84倍。同樣，隨著暴露時間延長，誘導(dǎo)作用逐漸減弱。從響應(yīng)劑量和顯著性分析，3種蛋白酶中中性蛋白酶活性對聯(lián)苯菊酯暴露的響應(yīng)更為敏感。由圖3可知，3種蛋白酶活性在暴露早期能夠顯著被聯(lián)苯菊酯誘導(dǎo)，揭示著它們具有早期生物標(biāo)志物的潛能。

氟氯氰菊酯暴露下，3種蛋白酶活性的響應(yīng)情況如圖4所示。由圖4(a)可知，暴露初期第3天時，低劑量氟氯氰菊酯處理組(5 mg·kg-1)顯著誘導(dǎo)了赤子愛勝蚓體內(nèi)酸性蛋白酶活性，而10～60 mg·kg-1氟氯氰菊酯處理組則抑制了赤子愛勝蚓體內(nèi)酸性蛋白酶活性。在整個暴露期間內(nèi)，高劑量氟氯氰菊酯處理組(60 mg·kg-1)對蚯蚓酸性蛋白酶活性起到抑制作用。如圖4(b)所示，在第3天，與對照組相比，5 mg·kg-1氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓中性蛋白酶活性有所增加，隨著暴露濃度的增加，中性蛋白酶活性有所降低。暴露第7天時，高劑量氟氯氰菊酯(60 mg·kg-1)顯著抑制了蚯蚓中性蛋白酶活性，對照組活性是該處理組的1.59倍。到暴露中后期，則出現(xiàn)了誘導(dǎo)作用。由圖4(c)可知，氟氯氰菊酯對蚯蚓堿性蛋白酶的顯著影響僅僅發(fā)生在暴露早期第3天，蚯蚓堿性蛋白酶活性被5 mg·kg-1氟氯氰菊酯顯著誘導(dǎo)，被10 ～ 60 mg·kg-1氟氯氰菊酯顯著抑制，其中，對照組蚯蚓堿性蛋白酶活性是最高劑量組的1.37倍。隨著暴露時間延長，堿性蛋白酶活性在處理組與對照組之間沒有顯著響應(yīng)差異。從響應(yīng)劑量和顯著性分析，酸性蛋白酶和堿性蛋白酶活性對氟氯氰菊酯的早期暴露的響應(yīng)更為敏感，在暴露后期，中性蛋白酶活性對低劑量氟氯氰菊酯的響應(yīng)更敏感。由圖3和圖4結(jié)果可知，在聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯早期暴露下3種蛋白酶活性主要呈現(xiàn)出相反的響應(yīng)趨勢。

圖3 聯(lián)苯菊酯暴露下蚯蚓體內(nèi)酸性蛋白酶(a)、中性蛋白酶(b)和堿性蛋白酶(c)活性的變化注：與對照組相比有顯著性差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。Fig. 3 Changes of acid (a), neutral (b) and alkaline (c) protease activities in earthworms after exposure to bifenthrin in soilNote: Compared with the control, there are significant differences (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

圖4 氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓體內(nèi)酸性蛋白酶(a)、中性蛋白酶(b)和堿性蛋白酶(c)活性的變化注：與對照組相比有顯著性差異(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。Fig. 4 Changes of acid (a), neutral (b) and alkaline (c) protease activities in earthworms after exposure to cyfluthrin in soilNote: Compared with the control, there are significant differences (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

2.3 聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯殘留量與消化酶活性之間的量效關(guān)系

隨著暴露時間的延長，聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯被逐漸降解，2種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解符合一級動力學(xué)模式[15-16]。為探究擬除蟲菊酯類農(nóng)藥暴露下，蚯蚓體內(nèi)消化酶活性與土壤殘留的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥之間的量效關(guān)系，本研究選用3種曲線擬合擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量與消化酶活性的回歸方程，并進行了顯著性檢驗，P<0.05即表示曲線擬合效果較好，具有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

如表1所示，在聯(lián)苯菊酯暴露下，暴露初期(7 d內(nèi))消化系統(tǒng)3種蛋白酶活性與聯(lián)苯菊酯殘留量存在著顯著的回歸關(guān)系；暴露中后期，消化酶α-Glu活性與土壤聯(lián)苯菊酯殘留量之間存在顯著的回歸關(guān)系。如表2所示，在氟氯氰菊酯暴露下，在暴露第7天時，4種消化酶活性與氟氯氰菊酯殘留量之間存在較好的擬合方程關(guān)系；暴露中期14 d時，僅蚯蚓堿性蛋白酶活性與氟氯氰菊酯殘留量存在顯著的回歸關(guān)系；暴露后期第21天時，僅有酸性蛋白酶活性與氟氯氰菊酯殘留量存在顯著的回歸關(guān)系；最后暴露第28天時，α-Glu活性和堿性蛋白酶活性與氟氯氰菊酯殘留量之間存在顯著的回歸關(guān)系。

表1 土壤中聯(lián)苯菊酯殘留量與蚯蚓體內(nèi)消化酶活性的量效關(guān)系Table 1 Dose-response relationship between bifenthrin residue in soil and digestive enzyme activity in earthworm

表2 土壤中氟氯氰菊酯殘留量與蚯蚓體內(nèi)消化酶活性的量效關(guān)系Table 2 Dose-response relationship between cyfluthrin residue in soil and digestive enzyme activity in earthworm

2.4 聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下消化酶活性之間的相關(guān)性分析

生物體中各生物標(biāo)志物之間不是相互獨立的，而是存在著互相調(diào)節(jié)的關(guān)系，本研究采用Pearson相關(guān)性分析方法分析蚯蚓在2種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥暴露下，其體內(nèi)4種消化酶之間的相關(guān)性。如圖5所示，對照組處理下，蚯蚓α-Glu活性與蛋白酶活性之間相關(guān)性不顯著，3種蛋白酶活性之間存在顯著的兩兩正相關(guān)。如圖6和圖7所示，在聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下，蚯蚓消化系統(tǒng)中α-Glu、酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及堿性蛋白酶活性之間呈現(xiàn)兩兩顯著正相關(guān)。與對照組比較可以發(fā)現(xiàn)，在添加聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯后，α-Glu活性與蛋白酶活性出現(xiàn)顯著相關(guān)性，說明2種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的暴露能夠誘導(dǎo)2類不同消化酶之間發(fā)生協(xié)同作用以應(yīng)對外界脅迫。

圖5 對照組處理中蚯蚓4種消化酶活性之間的Pearson相關(guān)性注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 5 Pearson correlation of activities of 4 digestive enzymes in earthworms in control groupsNote: *represents P<0.05; **represents P<0.01.

圖6 聯(lián)苯菊酯暴露下蚯蚓4種消化酶活性之間的Pearson相關(guān)性注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 6 Pearson correlation of activities of 4 digestive enzymes in earthworms after exposure to bifenthrin in soilNote: *represents P<0.05, **represents P<0.01.

圖7 氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓4種消化酶活性之間的Pearson相關(guān)性注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 7 Pearson correlation of activities of 4 digestive enzymes in earthworms after exposure to cyfluthrin in soilNote: *represents P<0.05, **represents P<0.01.

3 討論(Discussion)

蚯蚓消化酶(α-Glu和蛋白酶)與其攝食能力、生物增長相關(guān)，然而卻很少被用作識別環(huán)境污染物的生物標(biāo)志物。本研究分析了聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露對土壤模式生物赤子愛勝蚓4種消化酶的影響。結(jié)果顯示，聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯影響了赤子愛勝蚓消化酶的活性，調(diào)節(jié)了2類不同消化酶之間的協(xié)同作用以應(yīng)對暴露脅迫。

暴露在聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯染毒土壤下，赤子愛勝蚓體內(nèi)α-Glu活性的變化表明其體內(nèi)的糖類水解在一定程度上受到擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的影響。然而關(guān)于α-Glu響應(yīng)的具體分子機制依然未知，有待進一步研究。蛋白酶水解作用能夠調(diào)解有機體的發(fā)育過程、細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和組織修復(fù)[24]。然而僅有少量研究以蛋白酶活性為端點進行污染暴露實驗，例如花園愛勝蚓(E.hortensis)白細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的蛋白酶活性在暴露5 d后隨著多氯聯(lián)苯(PCBs)(1～30 μg·cm-2)濃度的增加而增加[25]。本研究中，3種蛋白酶活性在暴露早期，能夠分別被聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯顯著誘導(dǎo)和抑制，表明它們能夠被用作早期警示標(biāo)志物以評估聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯的毒性效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)赤子愛勝蚓內(nèi)臟中的中性和堿性蛋白酶水解活性高于酸性蛋白酶(圖3和圖4)，這一現(xiàn)象也出現(xiàn)在鯉魚和丁鯛中[22]。同一個指標(biāo)在聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下出現(xiàn)不同的響應(yīng)，可能與2種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。相比Ⅰ型聯(lián)苯菊酯，Ⅱ型氟氯氰菊酯的醇基團α碳上存在一個氰基團[26]。

在整個暴露期間，蚯蚓消化酶與聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯之間的相關(guān)性隨著時間發(fā)生變化，可能因為隨著時間延長，2種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥被蚯蚓及土壤微生物代謝轉(zhuǎn)化，形成一個擬除蟲菊酯類農(nóng)藥母體與中間代謝產(chǎn)物復(fù)合污染的體系，蚯蚓生化指標(biāo)的變化是母體和中間產(chǎn)物共同影響的一個結(jié)果。例如，聯(lián)苯菊酯代謝過程中環(huán)丙基甲酸和2-甲基3-聯(lián)苯基甲醇產(chǎn)生，這些代謝產(chǎn)物的毒性可能高于母體化合物[27]。在氟氯氰菊酯的代謝過程中會釋放出化學(xué)不穩(wěn)定性的氰醇，氰醇能夠分解為氰化物和醛類，而這些化合物是自由基的來源物，可以對有機體造成損傷[28]。

綜上所述，亞致死劑量的聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯能夠引起赤子愛勝蚓的消化酶活性的紊亂，從而可能影響其生長繁殖。氟氯氰菊酯對α-Glu活性的抑制作用大于聯(lián)苯菊酯，蛋白酶活性能夠在暴露最早期指示聯(lián)苯菊酯和氟氯氰菊酯的毒性。在2種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥暴露下，蚯蚓體內(nèi)4種消化酶之間存在著顯著的相關(guān)關(guān)系。

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