吳小延，劉小云，古家美，黃永詩，王 芳，湯 濤

（中山大學(xué)腫瘤防治中心∕∕華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室分子診斷科，廣東廣州 510060）

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是指原發(fā)于胃腸道和腹腔的間質(zhì)細(xì)胞腫瘤，占胃腸道腫瘤的1%～4%［1］。早在2003 年，Heinrich等［2］和Hirota 等［3］分別發(fā)現(xiàn)并證實了在部分不存在c-Kit基因突變的GIST 中，存在血小板源性生長因子受體α（platelet derived growth factor receptor-al‐pha，PDGFRA）基因突變。在無配體結(jié)合的情況下，PDGFRA蛋白仍然能保持持續(xù)的自身酪氨酸蛋白激酶活性，從而激活下游的信號傳導(dǎo)通路［2-3］。PDGFRA突變的患者占GIST患者的5%～10%左右，最常見的突變形式是第18 號外顯子D842V 點突變，占所有PDGFRA突變類型的90%以上［4］，大部分PDGFRA突變原發(fā)于胃。酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼（imatinib）可以使超過80%的患者獲益，延長患者無進展生存時間（progression-free survival，RFS），而imatinib 治療的療效與GIST基因突變狀態(tài)及突變類型直接相關(guān)［5］。PDGFRA突變是GIST中少見的一種突變類型，尤其是外顯子18 D842V突變導(dǎo)致的GIST 對imatinib 具有高度耐藥性［6］，僅有外顯子12和外顯子18中的D842Y 突變對ima‐tinib 治療敏感。因此需要新的靶向藥物來面對PDGFRA 突變型，特別是外顯18 D842V 突變型原發(fā)耐藥突變GIST 治療的一大臨床難點。本文主要回顧性分析PDGFRA 突變型GIST 的臨床病理特征、治療及預(yù)后，以為此類罕見分子病理突變型患者的個體化靶向治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2015 年1 月至2020 年11 月期間中山大學(xué)腫瘤防治中心收治的855 例手術(shù)切除且經(jīng)病理確診為GIST 的患者，回顧性分析其中40 例原發(fā)腫瘤組織基因突變檢測證實存在PDGFRA突變的患者。每例標(biāo)本均由2 位病理醫(yī)生重新復(fù)查。其中男性24 例，女性16 例，中位年齡47（33～81）歲。根據(jù)《中國胃腸間質(zhì)瘤診斷治療共識（2017 年版）》［7］GIST 病理診斷及組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)：包括梭形細(xì)胞型32 例、上皮樣細(xì)胞型3 例、混合細(xì)胞型5 例。按照2008 年改良的NIH 標(biāo)準(zhǔn)進行GIST 危險程度評估分級標(biāo)準(zhǔn)：包括極低危6 例、低危8 例、中危11例、高危15 例。4 例伴隨其他癌種，其中肝轉(zhuǎn)移1例，盆腔轉(zhuǎn)移2 例，腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移1 例。其中2 例患者術(shù)前分別接受過imatinib 及avapritinib 治療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且獲得所有患者知情同意。

1.2 Sanger測序法

采用石蠟包埋組織切片，按試劑盒說明書進行組織DNA 提取。PDGFRA 基因擴增及測序引物由上海英濰捷基公司合成，外顯子12 上游引物序列F：5’TCCAGTCACTGTGCTGCTTC3’，下游引物序列R：5’GCAAGGGAAAAGGGAGTCTT3’，目的片段長度為260 bp。外顯子18 上游引物 序列F：5’ACATGGATCAGCCAGTCTT3’，下游引物序列R：TGAAGGAGGATGAGCCTGACC3’，目的片段長度為280 bp。PCR 總反應(yīng)體系為25 μl：2× Premix‐EXTaqTM 12.5 μL，分別取1 μL上下游引物（10μmol∕L），DNA模板5μL，RNase-free Water 5.5 μL。PCR 擴增條件為94 ℃5 min、94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，共32 個循環(huán)；最終72 ℃5 min，12 ℃保溫。使用ABI3500XL 型測序分析儀進行雙向測序，測序結(jié)果使用Chromas 軟件與基因組DNA序列進行比對分析。

1.3 免疫組織化學(xué)

將石蠟包埋組織行3～4 μm 厚切片，70℃烤片?？贵w購自［基因科技（上海）股份有限公司］，全自動免疫組化儀（Leica Microsystems Nussloch GmbH）購自Laica 公司。陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)：CD117 和Dog1 為胞核和胞質(zhì)著色，陽性顯色為棕黃色。CD34 以腫瘤細(xì)胞胞漿或胞膜呈棕黃色為陽性。每批染色切片均設(shè)陰、陽性對照各一張。染色結(jié)果均由兩名副高及以上職稱的病理醫(yī)師獨立判定。

1.4 臨床資料隨訪

根據(jù)病情對部分患者行imatinib 400 mg∕d 或600 mg∕d 或Avapritinib 300 mg∕d 的治療方案；其療效采用Choi 標(biāo)準(zhǔn)［8］進行評估，通過查閱病歷、門診或電話等方式進行隨訪。無進展生存期（re‐lapse-free survival，RFS）指從手術(shù)之日至疾病出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的時間。末次隨訪時間為2021年1月。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用R 語言軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。文中涉及率的比較采用精確Fisher 概率法；生存情況采用通過Kaplan-Meier 法及Log-rank 檢驗分析D842V 突變組與非D842V 突變組突變患者的無復(fù)發(fā)生存及總生存。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)特征

40 例患者的標(biāo)本在顯微鏡下可見梭形細(xì)胞32例（80%，32∕40）、混合型細(xì)胞5 例（12.5%，5∕40）、上皮樣細(xì)胞3 例（7.5%，3∕40）3 種主型，其中梭形細(xì)胞呈束狀、編織狀或柵欄狀排列、細(xì)胞核多為梭形；上皮樣細(xì)胞胞漿紅染、核圓形及卵圓形、核分裂像少；混合型則同時包含梭形細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞（圖1）。抗體的陽性表達率為：CD117 27例（67.5%，27∕40）、DOG-134 例（85.0%，34∕40）及CD3432例（80.0%，32∕40）。此外，抗體的陽性表現(xiàn)為：CD34、DOG-1以及CD117等多為彌漫強陽性（圖1）。

圖1 PDGFRA基因突變型GIST的組織學(xué)類型及免疫組化Fig.1 Histological type and immunohistochemistry of PDGFRA gene mutant GIST

2.2 臨床病理特征

2015 年1 月至2020 年11 月期間中山大學(xué)腫瘤防治中心收治的40 例經(jīng)病理確診為GIST、原發(fā)腫瘤組織基因突變檢測證實存在PDGFRA突變的患者。腫瘤位于胃部34 例（85.0%，34∕40），小腸2例（5.0%，2∕40），胃腸道外共4 例（10.0%，4∕40）。4（10.0%，4∕40）例在診斷時有其他癌種伴隨。7 例（17.5%，7∕40）腫瘤最大直徑≤2 cm；13（32.5%，13∕40）例腫瘤最大直徑＞2，＜5 cm；17（42.5%，17∕40）例腫瘤最大直徑≥5 cm 但＜10 cm；3（7.5%，3∕40）例腫瘤最大直徑≥10 cm。32 例（80%，32∕40）為梭形細(xì)胞型，5 例（12.5%，5∕40）為混合細(xì)胞型，3 例（7.5%，3∕40）為上皮細(xì)胞型。30 例（75%，30∕40）核分裂象≤5∕50HPF，10例（25%，10∕40）核分裂象＞5∕50HPF。40 例GIST 分別為極低度侵襲危險性6例（15.0%，6∕40），低度侵襲危險性8 例（20.0%，8∕40），中度侵襲危險性11 例（27.5%，11∕40）和高度侵襲危險性15 例（37.5%，15∕40）。術(shù)后復(fù)發(fā)8 例，其中高度危險程度5例，中度危險度2 例，低度危險度1例；術(shù)后肝臟轉(zhuǎn)移1 例，中度危險程度（表1）。

表1 PDGFRA 基因突變胃腸道間質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between clinicopathological charac?teristics of patients with PDGFRA gene mutation gastroin?testinal stromal tumor

續(xù)表

2.3 PDGFRA 突變類型分布

855 例GIST 患者中40 例（4.7%，40∕855）檢測到PDGFRA基因突變。在GIST患者中，PDGFRA基因最常見突變位點為18 號外顯子第842 位密碼子的錯義突變（GAC＞GTC，D842V）。本研究40 例PDGFRA突變型GIST患者中，第12外顯子突變1例（2.5%，1∕40），即P581S點突變；第18外顯子突變39例（97.5%，39∕40）。其中D842V點突變34例（85.0%，34∕40），D842Y點突變2例（5.0%，2∕40），D842-D846＞S（混合突變），I843-D846del 及D842-M844 缺失突變各1例（2.5%，1∕40）。具體突變類型和分布見圖2，表2～4。

圖2 PDGFRA突變型的Sanger測序結(jié)果Fig.2 Sanger sequencing results of PDGFRA mutant

2.4 PDGFRA基因突變GIST與免疫表型的關(guān)系

40例GIST 患者中CD117和DOG1的陽性率均＞65.0%，CD117 和DOG1 的表達與PDGFRA基因突變之間無明顯相關(guān)性（P＞0.05；表2）。Ki-67 增殖指數(shù)≤5%、5%～10% 和≥10% GIST 患者中PDG?FRA基因突變率的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05；表5）。

表2 PDGFRA基因12號外顯子突變Table 2 Mutations in exon 12 of PDGFRA gene

2.5 PDGFRA 基因突變GIST 與臨床病理特征的關(guān)系

40 例GIST 患者中D842V 突變34 例（3.98%，34∕855），非D842V 突 變6 例（0.70%，6∕855）。D842V 突變男性19 例，女性15 例，男女比例1.27：1.00，中位年齡47（33～81）歲。非D842V 突變男性5 例，女性1 例，男女比例5∶1，中位年齡50（44～66）歲。比較兩組患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、核分裂象計數(shù)、CD117、DOG1 及CD34 表達、Ki-67 增殖指數(shù)、改良NIH 分級，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。另外統(tǒng)計學(xué)分析顯示：不同性別患者的腫瘤原發(fā)部位、發(fā)病年齡及腫瘤大小等指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 PDGFRA基因18號外顯子突變Table 3 Mutations in exon 18 of PDGFRA gene

表4 PDGFRA 突變胃腸道間質(zhì)瘤患者突變類型Table 4 Types of mutations with PDGFRA mutant gastrointestinal stromal tumors ［n（%）］

2.6 PDGFRA基因突變GIST與預(yù)后的關(guān)系

2.6.1 靶向治療 本研究40 例PDGFRA突變GIST患者中有14例患者接受imatinib 輔助治療。其中1例imatinib 400 mg 治療4 月后停止用藥，23 個月后出現(xiàn)進展；1 例患者imatinib 400 mg 輔助治療32 個月后進展，imatinib 量提高到600 mg，6 個月后腫瘤未控，后停止用藥，改中藥治療至今病情穩(wěn)定；1 例imatinib 400 mg 輔助治療15 個月后進展，換達沙替尼100 mg，但1 周后死亡；1 例imatinib 400 mg 輔助治療13 個月后進展，停止靶向治療；1 例imatinib 400 mg 輔助治療18 個月后停藥，至今病情穩(wěn)定。另外有2 例接受avapritinib 治療，1 例手術(shù)后未治療，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后入組avapritinib 臨床試驗，5 個月后評估PR；1 例術(shù)前接受avapritinib 臨床試驗，2 個月后評估PR（表5）。除此之外9 例D842V 突變和非D842V 突變患者術(shù)后接受了6 個月以上imatinib 400 mg∕d的輔助治療。

表5 PDGFRA 基因突變靶向治療病例Table 5 PDGFRA gene mutation targeted therapy cases

2.6.2 復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移 本研究末次隨訪日期為2021年1 月18 日，隨訪時間為1～63（中位32）個月，35例正在隨訪中（隨訪率87.5%），死亡3例（7.5%），均死于GIST。在隨訪期間，8 例出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，且均為D842V 突變。生存分析顯示D842V 突變患者3 年無復(fù)發(fā)生存率為97.1%，非D842V 突變患者3 年無復(fù)發(fā)生存率為100%，兩組突變患者的RFS及OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05；圖3）。

圖3 PDGFRA基因突變胃腸間質(zhì)瘤患者的生存曲線Fig.3 Survival curve of patients with PDGFRA gene mutation gastrointestinal stromal tumors

3 討論

GIST起源于胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC），是胃腸道最常見的間葉組織源性腫瘤，研究表明，約10%GIST患者存在PDGFRA基因突變［9］。PDGFRA基因的定位與c-Kit在空間上毗鄰，也位于人類4號染色體（4q12），基因全長約65 kb，由23 個外顯子組成。與c-Kit一樣，PDGFRA可以編碼Ⅲ型酪氨酸激酶，能將有絲分裂等信號傳遞入細(xì)胞核，引起細(xì)胞分裂和增殖，該基因突變可導(dǎo)致惡性腫瘤的產(chǎn)生。

PDGFRA基因在GIST 中的突變主要集中在其編碼的近膜區(qū)和激酶區(qū)，以外顯子18 突變多見，其次為外顯子12。外顯子18 突變集中在841-847位點，以D842V 的點突變最常見，外顯子12 突變多為第561位點的點突變，由Val突變?yōu)锳sp。本研究共納入40 例PDGFRA突變型GIST，統(tǒng)計顯示，PDGFRA突變發(fā)生率為4.8%（40∕855），其中D842V突變占85.0%（34∕40），突變頻率與國內(nèi)外報道基本一致［10-11］。40 例PDGFRA突變型GIST患者中，外顯子12只有1例（2.5%，1∕40）P581S點突變；外顯子18有39例（97.5%，39∕40）發(fā)生突變；其中常見的D842V 點突變34 例（85.0%，34∕40），D842Y 點突變2例（5.0%，2∕40），D842-D846＞S 混合突變，I843-D846del 及D842-M844缺失突變各1例（2.5%，1∕40）。本研究還首次發(fā)現(xiàn)未曾報道的PDGFRA基因18號外顯子D842-D846＞S混合突變。本研究中PDGFRA基因的突變類型、突變位點與以往文獻報道有部分差異，可能與研究人群及樣本量不同有關(guān)。

本組40例PDGFRA突變型GIST 患者腫瘤以胃部34 例（85.0%，34∕40）最多見，其次是胃腸道外共4 例（10.0%，4∕40），還見于小腸2例（5.0%，2∕40）。有研究表明，來源于胃的GIST 的患者預(yù)后較好且大多生物學(xué)行為呈“良性”［12］。也有文獻報道，PDGFRA基因突變病例均為高度侵襲危險性，且患者預(yù)后不良［13］。本研究結(jié)果顯示，腫瘤最大直徑≥5 cm 但＜10 cm 者占42.5%（17∕40），核分裂象計數(shù)≤5 個∕50 高倍視野者占75.0%（30∕40），NIH 危險度分級以中危和高危為主（65.0%，26∕40）。本組中此類突變多見于發(fā)生在胃的中高度侵襲危險性病例。

有研究［14］顯示，核分裂計數(shù)、腫瘤直徑大小、Ki67 增殖指數(shù)、危險度分級等是影響腫瘤預(yù)后的因素，本研究單因素分析發(fā)現(xiàn)，不同性別的患者年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑大小、核分裂計數(shù)、CD117、DOG1 及CD34 表達、Ki-67 增殖指數(shù)、改良NIH 分級，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。關(guān)于性別是否是預(yù)后的獨立影響因素，之前國內(nèi)外的研究并不一致［15-17］。也有相關(guān)文獻［18］報道，年齡≤50 歲的GIST患者PDGFRA 基因突變率明顯高于年齡＞50 歲的GIST 患者，本研究結(jié)果顯示，D842V 與非D842V 兩組患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑大小、核分裂計數(shù)、CD117、DOG1及CD34表達、Ki67增殖指數(shù)、改良NIH分級，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究中GIST 細(xì)胞類型以梭形細(xì)胞為主，少數(shù)為上皮樣細(xì)胞型及混合細(xì)胞型GIST，這種突變類型與腫瘤原發(fā)部位的相關(guān)性亦見于既往研究報道。李軍等［19］研究表明，PDGFRA在上皮樣細(xì)胞型和混合細(xì)胞型GIST 中的突變率顯著高于梭形細(xì)胞型GIST。此前有研究顯示，PDGFRA基因突變與GIST 原發(fā)部位及細(xì)胞組織學(xué)類型等具有相關(guān)性［20］。本組病例數(shù)量較少，并未發(fā)現(xiàn)PDGFRA 基因突變與組織類型有相關(guān)性，因此需要進一步大樣本研究。

胃腸道間質(zhì)瘤的指南［21］提示，胃腸間質(zhì)瘤的準(zhǔn)確診斷依賴于病理學(xué)、免疫組織化學(xué)（CD117、DOG1、CD34 等）及基因檢測（Kit的第9、11、13、17外顯子及PDGFRA基因第12、18 外顯子）。本組中CD117 和DOG1 的陽性率高達85.0%，兩者聯(lián)合檢測可顯著提高GIST的診斷率。我們發(fā)現(xiàn)有部分PDGFRA突變型的CD117、CD34 和DOG-1 是部分陽性和弱陽性，而在c-Kit 或野生型中卻沒這種情況，因此筆者認(rèn)為CD117、CD34 和DOG-1 免疫表達的強弱可能與基因型有關(guān)。但我們的研究顯示，以上基因免疫表達與PDGFRA 基因突變之間沒有相關(guān)性，CD117 和DOG1 并不能作為預(yù)測腫瘤基因突變的指標(biāo)。

TKI是三磷酸腺苷（ATP）與酪氨酸激酶結(jié)合的競爭性抑制劑，其作用機制是抑制酪氨酸殘基磷酸化，從而阻斷下游信號通路的轉(zhuǎn)換，阻止細(xì)胞生長。GIST 對常規(guī)的放化療不敏感，imatinib 作為c-Kit的分子靶向藥物明顯的改善了GIST 的預(yù)后。以往研究顯示，imatinib可以使超過80%的患者獲益，延長RFS［22］。另有一部分病人對imatinib 原發(fā)性耐藥。GIST 對TKI的治療反應(yīng)及用藥劑量與GIST 的發(fā)生機制有關(guān)，盡管c-Kit 與PDGFRA 均屬于Ⅲ型受體偶聯(lián)的酪氨酸激酶家族，但是與c-Kit 突變相比，PDGFRA 基因突變型GIST 的治療效果較差，研究［23］發(fā)現(xiàn)PDGFRA基因D842V 突變是導(dǎo)致GIST 患者imatinib 原發(fā)耐藥的原因。Yoo 等［24］也證實了PDGFRA-D842V 突變患者對imatinib 完全耐藥，不應(yīng)該接受imatinib 藥物治療。本研究中，10 例D842V 突變型患者手術(shù)后進行imatinib 輔助治療，其中4 例在之后的隨訪過程中出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，6例未獲得后續(xù)進展情況，由此，可在一定程度上說明PDGFRA-D842V 突變患者并不能從imatinib 靶向治療中受益。臨床研究［25-26］亦表明，多靶點的TKI dasatinib 和新型TKI Avapritinib 對PDG‐FRAD842V 突變的GIST 患者有明顯的抑制效果。目前Avapritinib 在美國已經(jīng)被批準(zhǔn)使用，用于治療攜帶PDGFRA 外顯子18 突變（包括PDGFRA D842V 突變）的不可切除性或轉(zhuǎn)移性GIST 成人患者。我們的研究結(jié)果也表明，攜帶PDG‐FRA-D842V突變的GIST患者可以從dasatinib和avapritinib的治療中獲益。研究［27］證明，在PDGFRA-D842V 突變?nèi)巳褐?，?6 位患者中的49 位（88%；95%CI：76，95）有總緩解，其中有5 位（9%）完全緩解和44 位（79%）部分緩解。葉小龍等［17］和Trent 等［28］研究結(jié)果同樣證明，dasatinib 和avapritinib 均可以使D842V 突變的不可切除或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的GIST 患者獲益。我們的研究結(jié)果證明，接受avapritinib 治療的PDGFRAD842V 突變的患者，腫瘤出現(xiàn)明顯退縮，且均耐受良好，這給未來此類患者的治療帶來了希望。

綜上所述，PDGFRA 的突變多見于胃，病理形態(tài)以梭形細(xì)胞為主。PDGFRA 外顯子18 D842V 點突變?yōu)橹饕蛔冾愋?，對ima‐ tinib 不敏感。Avapritinib 是一種高選擇性口服激酶抑制劑，能有效縮小D842V 突變GIST 患者的靶病灶，對于晚期PDGFRA-D842V 突變型胃腸道間質(zhì)瘤患者，avapri‐tinib 具有可控的安全性，并具有初步的抗腫瘤活性。本研究尚存在一些局限性，GIST 病例主要是單中心的回顧性研究，樣本量較少，分析存在一些偏差，有待于未來更多的樣本對基因突變類型與臨床病理特征、治療及預(yù)后進一步研究，以期更好的指導(dǎo)臨床用藥。