王崇 王連軍 楊新筍 雷劍 柴沙沙 張文英 焦春海 田小海

摘? 要：基于甘薯葉綠體基因組，利用cpSSR分子標(biāo)記，對104份甘薯栽培品種和地方品種進(jìn)行遺傳多樣性分析并構(gòu)建指紋圖譜，為甘薯資源的保護(hù)鑒定和遺傳改良提供參考。使用了11對cpSSR引物，在104個(gè)甘薯材料中總共擴(kuò)增得到58條條帶，多態(tài)性條帶為47條，單條引物平均擴(kuò)增的條帶數(shù)為5.27，平均多態(tài)性百分率為81.03%。根據(jù)引物在甘薯材料中的擴(kuò)增結(jié)果，構(gòu)建104個(gè)甘薯品種的指紋圖譜。對104個(gè)甘薯品種的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，每個(gè)品種間的遺傳距離為0.0386～5.2723，平均遺傳距離為0.2201，在遺傳系數(shù)為0.74時(shí)將104個(gè)甘薯品種分為5組。

關(guān)鍵詞：甘薯;cpSSR分子標(biāo)記;遺傳多樣性;指紋圖譜

中圖分類號(hào)：S531????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Construction of cpSSR Fingerprints and Genetic Diversity Analysis of 104 Sweetpotato Varieties

WANG Chong1， 2， WANG Lianjun1*， YANG Xinsun1， LEI Jian1， CHAI Shasha1， ZHANG Wenying2， JIAO Chunhai3**， TIAN Xiaohai2*

1. Hubei Key Laboratory of Food Crops Germplasm and Genetic Improvement? /? Institute of Food Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences / Hubei Sweetpotato Engineering and Technology Research Centre， Wuhan， Hubei 430064， China; 2. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025， China; 3. Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei 430064， China

Abstract： Based on the sweetpotato chloroplast genome， this study developed cpSSR molecular markers and analyzed the genetic diversity of 104 cultivars and landraces sweetpotato. A fingerprint map was constructed to provide references for the protection identification and genetic improvement of sweet potato resources. 11 pairs of cpSSR markers were used in this study. A total of 58 bands were amplified from 104 sweetpotato materials， with 47 polymorphic bands. The average number of bands amplified by a single primer was 5.27， and the average polymorphism percentage was 81.03%. Based on the amplification results of the primers in the sweet potato material， the fingerprints of 104 sweet potato varieties were constructed. Cluster analysis was performed on the amplification results of 104 sweetpotato varieties. The genetic distance between each variety was 0.0386 to 5.2723， and the average genetic distance was 0.2201. When the genetic coefficient was 0.74， the 104 sweet potato varieties were divided into 5 groups.

Keywords： sweetpotato; cpSSR marker; genetic diversity; fingerprinting

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.006

甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam]是雙子葉植物，屬旋花科（Convolvulaceae）番薯屬（Ipomoea Linn.），是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料和新型能源作物，是世界第七大糧食作物，中國第四大糧食作物[1]。全球甘薯種植面積和產(chǎn)量分別為832.79萬hm2和1.064億t，中國甘薯種植面積為337.28萬hm2，產(chǎn)量0.85億t，分別占全球甘薯種植面積和產(chǎn)量的40.5%與67.0%，均居世界首位[2]。甘薯是同源六倍體植物，染色體數(shù)目多，遺傳信息復(fù)雜，給甘薯的遺傳改良和親本選配帶來了一定的困難[3]。

分子標(biāo)記技術(shù)是作物育種的一種重要手段，Selaocoe等[4]使用RAPD標(biāo)記對31份在南非種植的甘薯品種進(jìn)行分析，為甘薯的營養(yǎng)改良和抗逆育種提供了參考;蘇文瑾等[5]利用SLAP-seq技術(shù)，以300份甘薯資源為材料，開發(fā)出795 794個(gè)SNP位點(diǎn)，為SNP在甘薯資源的鑒定、高遺傳圖譜的構(gòu)建和重要性狀關(guān)聯(lián)分析奠定了基礎(chǔ);Zhao等[6]通過AFLP標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記，對‘徐薯18和‘徐781的F1分離群體202個(gè)株系構(gòu)建雙親連鎖圖譜，得到父母本的90個(gè)連鎖群。分子標(biāo)記技術(shù)還被應(yīng)用于構(gòu)建植物的指紋圖譜，通過構(gòu)建植物DNA指紋圖譜可有效鑒定植物品種的真實(shí)性，在水稻、馬玲薯、棉花等作物中的品種保護(hù)上起到重要作用[7-9]。如胡文舜等[10]利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了19個(gè)枇杷雜交品種的指紋圖譜，驗(yàn)證了分子標(biāo)記指紋圖譜在區(qū)分雜交品種上的可行性;聶立園等[11]基于SSR標(biāo)記，采用篩選核心引物的方法，構(gòu)建了132份甘薯種質(zhì)的指紋圖譜，可對甘薯品種進(jìn)行有效區(qū)分;王崇等[12]利用cpSSR標(biāo)記，對16份甘薯品種進(jìn)行遺傳多樣性分析和指紋圖譜的構(gòu)建，顯示品種間遺傳多樣性豐富，構(gòu)建的甘薯指紋圖譜可用于品種鑒定。綜上所述，結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建甘薯指紋圖譜，可為甘薯新品種保護(hù)和資源鑒定提供新的指導(dǎo)。

葉綠體微衛(wèi)星（chloroplast simple sequence repeat，cpSSR）標(biāo)記是基于植物葉綠體基因組開發(fā)的一種分子標(biāo)記，兼具普通SSR標(biāo)記和葉綠體基因組的特點(diǎn)。具有引物多態(tài)性高、重復(fù)性好、分布廣、數(shù)量豐富等優(yōu)點(diǎn)，又兼顧cpDNA序列保守、進(jìn)化緩慢、結(jié)構(gòu)簡單、單親遺傳等特點(diǎn)[13]，cpDNA中大多數(shù)編碼蛋白基因與光合作用和許多生化過程相關(guān)，如淀粉合成和氮代謝等，還可能參與植物的免疫反應(yīng)[14-15];cpDNA中還包含許多保守區(qū)域，可為植物的系統(tǒng)分類和條形碼（DNA binding）提供參考[16]。cpSSR分子標(biāo)記技術(shù)在居群保護(hù)、植物種群結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的研究中被廣泛應(yīng)用[17]。Lee等[18]使用8對多態(tài)性好的cpSSR引物，對來自中國、日本、美國、韓國等10個(gè)國家的558個(gè)甘薯品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明甘薯的母本遺傳多樣性低;Saxena等[19]開發(fā)出17對cpSSR引物對7份不同樹豆種質(zhì)資源進(jìn)行分析，結(jié)果表明cpSSR標(biāo)記可有效鑒定樹豆栽培種和野生種;Yan等[20]開發(fā)cpSSR標(biāo)記，表明該標(biāo)記可用于水松的種群遺傳和地理結(jié)構(gòu)分析。本研究采用cpSSR標(biāo)記技術(shù)，對104個(gè)甘薯品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，并構(gòu)建指紋圖譜，旨在為甘薯品種的鑒定區(qū)分和優(yōu)質(zhì)品種保護(hù)提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本試驗(yàn)包括104個(gè)不同品種的甘薯材料（表1），分別來自安徽、北京、重慶、四川、山東、湖北、湖南、江蘇、河北、河南、江西、浙江、廣東等地。2018年種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗(yàn)基地，2019年采取新鮮葉片進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2? 方法

1.2.1? 基因組DNA的提取及引物篩選? 參考Kim等[21]的方法，采用改良CTAB法提取甘薯基因組DNA。將提取的DNA在1.0%的瓊脂糖中進(jìn)行電泳觀察，檢測DNA完整性;使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測量濃度和純度。將本研究中所用DNA模板的濃度稀釋到50～60 ng/μL，在–80 ℃的冰箱中保存，用于后續(xù)研究。參考王崇等[12]的cpSSR標(biāo)記引物用于本研究，全部引物均委托武漢天一生物有限公司合成。

1.2.2? cpSSR擴(kuò)增? PCR的反應(yīng)體系為10×PAGE buffer（Mg2+）5 μL，dNTPs（10 mmol/L）4 μL，DNA（50～60 ng/μL）1 μL，Easy-Taq Polymerase（500 U/μL）0.5 μL，正向引物和反向引物各1 μL，加ddH2O補(bǔ)至總體積為50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，然后在4 ℃條件下保存5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在0.5%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后銀染顯色，進(jìn)行觀察。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

人工記錄聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，對于同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，選擇大小合適、清晰明亮和分辨率高的條帶，同一位置有條帶的記為“1”，無條帶或條帶模糊的記為“0”，形成[0，1]的原始數(shù)據(jù)矩陣，輸入Excel 2016中，把圖形數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。利用軟件NTSYS-pc 2.1.0計(jì)算甘薯品種間的遺傳距離[22]，利用軟件MEGA 7.0.21的非加權(quán)平均數(shù)法進(jìn)行聚類分析并生成甘薯品種的樹狀聚類圖[23];采用王紅意等[24]的方法構(gòu)建甘薯品種的數(shù)字指紋圖譜。

2? 結(jié)果與分析

2.1? cpSSR多態(tài)性分析

用11對引物在104份甘薯材料基因組DNA中進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出58條條帶，多態(tài)性條帶為47條，平均多態(tài)性百分率為81.03%。每條引物平均擴(kuò)增的條帶數(shù)為5.27，每條引物平均擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)為4.27。其中引物CPS18擴(kuò)增得到的多態(tài)性條帶最多，為6條;引物CPS14擴(kuò)增獲得的多態(tài)性條帶最少，為1條（表2）。

2.2? 聚類分析

使用11對引物將供試材料進(jìn)行聚類分析，用軟件NTSYS-pc 2.1.0計(jì)算得到104個(gè)甘薯品種間的遺傳距離矩陣，每個(gè)甘薯品種間的遺傳距離為0.0386～5.2723，平均遺傳距離為0.2201，表明供試材料間的遺傳多樣性較為豐富。根據(jù)104個(gè)甘薯品種的遺傳距離矩陣，利用軟件MEGA 7.0.2的非加權(quán)平均數(shù)法進(jìn)行聚類分析并生成104個(gè)甘薯品種的樹狀聚類圖（圖1）。從聚類樹狀圖可以看出，在遺傳系數(shù)為0.74時(shí)，可將104個(gè)甘薯品種分為5組。第1組包括‘阜紫薯1號(hào)和‘阜徐薯11號(hào)，2個(gè)品種的遺傳距離為0.171，表明親緣關(guān)系較近;第2組包括‘鄭紅21‘煙紫薯3號(hào)‘冀薯332等29個(gè)品種;第3組包括‘阜薯24‘阜徐薯20‘阜徐薯6號(hào)‘冀薯4號(hào)‘冀薯332‘冀薯99‘綿紫薯9號(hào)‘廣紫薯8號(hào)等64個(gè)品種;第4組包括‘寧Y76-3‘鄂薯6號(hào)‘贛GZ12-27‘渝紫薯7號(hào)‘鄂紫薯13‘渝薯50‘紅心王‘川紫薯4號(hào)等8個(gè)品種，其中‘贛GZ12-27與‘鄂紫薯13的遺傳距離最大（0.2086），‘紅心王與‘鄂紫薯13的遺傳距離最?。?.0386），品種間的親緣關(guān)系較近;第5組只有‘皖蘇311個(gè)品種。

2.3? DNA指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)11對cpSSR引物的擴(kuò)增結(jié)果對引物多樣性進(jìn)行分析，綜合多方面的因素來構(gòu)建甘薯品種的指紋圖譜。本研究選擇引物在每個(gè)品種對應(yīng)的擴(kuò)增結(jié)果作為參考指標(biāo)，把擴(kuò)增結(jié)果的有無構(gòu)成一串以“0”和“1”組成的數(shù)字，每串?dāng)?shù)字表示1個(gè)甘薯品種的特征值，即為甘薯的“指紋圖譜”，從而構(gòu)建104個(gè)甘薯品種的指紋圖譜（表3）。采用擴(kuò)增結(jié)果較好的引物CPS4和CPS5來構(gòu)建指紋圖譜。

3? 討論

甘薯是無性繁殖作物，放任授粉（集團(tuán)雜交）是甘薯育種主要方法之一[25]，而集團(tuán)雜交與甘薯的細(xì)胞質(zhì)遺傳相關(guān)，表明基于葉綠體基因組開發(fā)的SSR標(biāo)記在研究甘薯集團(tuán)雜交后代上有一定的應(yīng)用價(jià)值。

對104份普通甘薯的遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示其遺傳多樣性豐富，試驗(yàn)結(jié)果與Lee等[18]、Yang等[26]、趙冬蘭等[27]的研究結(jié)果基本保持一致，群體間的遺傳多樣性與多態(tài)性含量是相符的，遺傳多樣性的豐富程度與群體的遺傳背景相關(guān)，還與所設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記引物有關(guān)，本研究選用的cpSSR引物較少，可能與甘薯葉綠體基因組的特性有關(guān)，與核基因組相比，葉綠體基因組信息相對較少。采用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析，最終的結(jié)果可靠程度與標(biāo)記引物的數(shù)量和質(zhì)量密切相關(guān)。與王崇等[12]所采用的研究材料不同，品種數(shù)量不同，本研究所用的甘薯品種包括紫薯、淀粉型薯、鮮食型薯等類型的104個(gè)甘薯品種，遺傳分析結(jié)果更加準(zhǔn)確。遺傳分析顯示，品種聚類結(jié)果與品種類型和標(biāo)記無直接聯(lián)系，如‘商薯8號(hào)和‘蘇薯35被聚類在一起，‘皖薯373和‘寧紫薯1號(hào)被聚類在一起。聚類分析顯示，來自同一地區(qū)的品種被聚類在一起，如‘冀薯99和‘冀薯982，‘鄂紫薯13和‘鄂薯6號(hào);具有相同親本或血緣關(guān)系相近的品種被聚在一起，如‘冀薯332和‘冀薯4號(hào)，‘阜菜薯1號(hào)和‘煙紫薯3號(hào)，聚類結(jié)果與羅忠霞等[28]的研究結(jié)果基本保持一致?！钐K31被單獨(dú)聚在一組，與預(yù)期設(shè)想一致，表明cpSSR標(biāo)記能夠較為準(zhǔn)確地對甘薯品種進(jìn)行聚類。cpSSR標(biāo)記的聚類結(jié)果可在一定程度上反映甘薯的親緣關(guān)系，可為甘薯育種中高效選擇親本提供參考，在育種親本的選配時(shí)，宜優(yōu)先考慮親緣關(guān)系遠(yuǎn)、地理位置不同、遺傳背景差異大的優(yōu)良品種。

DNA指紋圖譜具有高度的特異性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，能夠在分子層面分辨某一群體中生物個(gè)體間的差異，可避免因外界條件造成的干擾，有效鑒定種質(zhì)資源和選擇育種親本[29]。李航等[30]通過開發(fā)cpSSR標(biāo)記和nSSR標(biāo)記對21份不同柑橘種質(zhì)資源進(jìn)行分析，結(jié)果表明cpSSR和nSSR結(jié)合使用可以比較準(zhǔn)確地鑒定柑橘雜種;Singh等[31]開發(fā)cpSSR標(biāo)記，并將其應(yīng)用于劍蘭指紋圖譜的構(gòu)建;Roullier等[32]結(jié)合cpSSR和nSSR標(biāo)記，對329份甘薯品種進(jìn)行分析，為甘薯馴化源于南美洲提供了證據(jù)，表明通過結(jié)合cpSSR和nSSR標(biāo)記可有效研究種質(zhì)資源。分子標(biāo)記開發(fā)指紋圖譜是篩選不同植物品種的有效方法，指紋圖譜的構(gòu)建一般采用特征譜帶法、引物組合法或核心引物組合法[33]。利用分子標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜的原則是選用較少的引物，獲得精確的鑒定結(jié)果。本研究選用的104個(gè)甘薯品種，主要來自江蘇、河南、安徽和湖南等地，甘薯品種類型主要是紫薯、食用型等，在構(gòu)建指紋圖譜時(shí)，當(dāng)選用引物CPS4和CPS5來構(gòu)建104個(gè)甘薯品種的指紋圖譜時(shí)，只能有效區(qū)分‘鄭紅21‘浙紫薯3號(hào)‘渝紫薯73‘蘇薯16‘浙薯70‘萬薯9號(hào)‘皖蘇718‘皖蘇61‘皖蘇31和‘紅心王等10個(gè)品種，表明cpSSR分子標(biāo)記可用于細(xì)胞質(zhì)遺傳后代的研究，但是對具有相同或相似親本的甘薯品種進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建時(shí)，若要對甘薯品種進(jìn)行更為準(zhǔn)確有效地區(qū)分，可增加新引物或者結(jié)合nSSR等標(biāo)記技術(shù)。

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