盧志宇，閆 鑫，于永慧，丁 晟，夏光輝，周冬生，熊小路，徐建民，焦 俊

立克次體為專性真核細胞內寄生的革蘭陰性小球桿菌，其引起的立克次體病是重要的人獸共患自然疫源性疾病[1]。立克次體病原體主要有斑疹傷寒群立克次體(typus-group rickettsiae)、斑點熱群立克次體(spotted fever group rickettsia, SFGR)、恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi)、無形體(Anaplasma)和埃立克體(Ehrlichia)等，分別引起斑疹傷寒、斑點熱、恙蟲病、無形體病和埃立克體病。貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii)雖然已歸類到軍團菌目，但其引起的Q熱仍歸于立克次體病范疇。在自然環(huán)境中，哺乳動物，尤其是嚙齒類動物是多種立克次體的自然宿主[2]，也是蜱、螨等立克次體傳播媒介的自然吸血宿主[3-4]，在立克次體病的流行中起重要作用。

近年來，國內立克次體宿主學研究集中于立克次體節(jié)肢動物傳播媒介—蜱，發(fā)現蜱可攜帶斑點熱群立克次體、嗜吞噬細胞無形體(Anaplasmaphagocytophilum)、查菲埃立克體(Ehrlichiachaffeensis)、貝氏柯克斯體等[5-6]。而嚙齒動物攜帶立克次體的研究數據相對較少，文獻報告多在我國東北林區(qū)、新疆戈壁、云南熱帶雨林、南海島礁等遠離密集人群地區(qū)發(fā)現嚙齒動物攜帶立克次體[7-15]。

江西省位于我國東南部，屬亞熱帶季風性濕潤氣候，當地水網稠密，是以水稻為主的重要糧食產區(qū)之一，同時也是鼠類等嚙齒動物密集活動的重災區(qū)[16]。目前研究發(fā)現江西省部分地區(qū)的嚙齒類動物攜帶鉤端螺旋體等病原[17]，但是罕見境內嚙齒動物攜帶立克次體病原體報告。本研究選擇江西省南豐縣、銅鼓縣、上猶縣、浮梁縣、上高縣、上饒市廣信區(qū)捕獲嚙齒類動物，采用立克次體屬/群特異性巢式PCR對嚙齒類動物脾臟組織DNA樣本擴增，再對擴增的陽性DNA片段測序和序列分析，旨在調查此地區(qū)嚙齒動物攜帶立克次體病原的種類，以便為當地立克次體病的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 于2019年10月，選擇江西省東、南、西、北的南豐縣、銅鼓縣、上猶縣、浮梁縣、上高縣、上饒市廣信區(qū)(圖1)，在上述地區(qū)稻田布置中型板夾，采取夜夾法捕獲嚙齒類動物。每個采集點每次放置有效鼠夾≥300個，行距30 m，夾距5 m[18]。下午或傍晚放夾，次日凌晨收夾。

圖1 在江西省的6個縣捕獲嚙齒動物樣本

1.2 樣本處理及鼠種鑒定 將捕獲的嚙齒類動物用75%酒精擦拭體表，于生物安全柜內無菌解剖，取脾臟，將脾臟置液氮罐中凍存?zhèn)溆?。捕獲的嚙齒類動物通過形態(tài)學[19]及分子生物學方法進行種類鑒定，分子生物學種類鑒定基于嚙齒動物特異的線粒體細胞色素c氧化酶亞基I(COI)[20]和細胞色素b(Cytb)基因[21]。

1.3 DNA提取和巢式PCR擴增 從液氮中取脾臟，無菌剪取約100 mg脾臟組織置于無菌陶珠管中，加入300 μL PBS緩沖液后置于全自動組織勻漿儀7 000 r/min勻漿90 s。充分勻漿后，取適量提取全基因組DNA，其余保存于-80 ℃?zhèn)溆?。使用核酸提取試劑?Dneasy Blood&Tissue Kit，Qiagen)，按其說明書從脾臟勻漿液中提取DNA。

從文獻獲取擴增柯克斯體16SrRNA基因[22]、斑點熱群立克次體ompA基因[4]、東方體56-kDa基因[23]和無形體和埃立克體16SrRNA基因[24]的屬/群特異性引物序列(表1)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以從鼠脾臟組織中提取的全DNA為模板，采用巢式PCR方法進行擴增。PCR反應總體積為50 μL：ddH2O 21 μL、2×PCR Premix 25 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL，每次擴增均設陰性(水)對照、陽性對照(本實驗室留存的立克次體全基因組DNA)。第2次擴增時取第1次擴增產物2 μL為模板。電泳條件為1.5%的瓊脂糖凝膠120 V電壓下電泳20 min，加樣量5 μL/孔。2×PCR Premix和DNA Marker(DL 2000)為寶生物工程(大連)有限公司生產，PCR儀(GeneAmp PCR System 9700)為美國應用生物系統(tǒng)公司產品。

表1 嚙齒動物種類鑒定和立克次體特異性PCR擴增引物

1.4 同源性比較和聚類分析 將巢式PCR擴增的陽性DNA片段物送至北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行測序，將獲得序列在美國國家生物技術信息中心(NCBI)中的BLAST界面與GenBank注冊基因進行同源性比對，最后用MEGA 7.0軟件采用最大似然法(Maximum Likelihood)將新測得的基因序列與相關已知同源序列構建遺傳進化樹(Bootstrap值設定為1 000)。

2 結 果

2.1 樣本采集和鼠種鑒定 從江西省南豐縣、銅鼓縣、上猶縣、浮梁縣、上高縣、上饒市廣信區(qū)等地區(qū)的稻田，通過夜夾法共捕獲嚙齒類動物393只，形態(tài)學鑒定為黑線姬鼠、褐家鼠、黃毛鼠、黃胸鼠、社鼠和鼩鼱6個種類，并進一步通過分子生物學方法確證。其中黑線姬鼠為優(yōu)勢鼠種，共計311只(79.14%)(表2)。

表2 采集的嚙齒動物種類及數量(%)

2.2 巢式PCR檢測 采用柯克斯體屬、斑點熱群、東方體屬、無形體屬特異性引物對動物DNA樣本做巢式PCR擴增。結果從19只黑線姬鼠樣本擴增出柯克斯體屬DNA(6.11%)，2只黑線姬鼠樣本擴增出東方體DNA(0.64%)，從1只黑線姬鼠樣本擴增出斑點熱群立克次體DNA(0.32%)，從所有黑線姬鼠樣本中未擴增出無形體DNA，詳見表3。其它5種嚙齒類動物樣本所有立克次體引物擴增均為陰性。

表3 PCR檢出黑線姬鼠的陽性結果

2.3 同源性比對和系統(tǒng)進化分析 將擴得的柯克斯體屬16SrRNA基因片段進行測序，結果顯示19份樣本測得的基因序列一致，同源性分析顯示與已知貝氏柯克斯體16SrRNA基因同源性為98.43%～100%。系統(tǒng)進化樹分析表明，該菌株與Coxiellaburnetiistr.Schperling(CP014563.1)、CoxiellaburnetiiMSU Goat Q177(CP018150.1)、CoxiellaburnetiiCbuK Q154(CP001020.1)處于同一進化分支(圖2)。

圖中菌株序列取自GenBank數據庫，JX/2019/China為本研究中擴得序列。

將擴得的斑點熱群立克次體ompA基因片段測序，同源性分析顯示其與已知新塔拉薩維奇立克次體(CandidatusR.tarasevichiae)的ompA基因序列同源性為100%。系統(tǒng)進化樹分析表明該菌株與我國東北地區(qū)新塔拉薩維奇立克次體(MN450411.2，MN450410.2，MN450409.2，MG888729.1)處于同一進化分支(圖3)。

圖中菌株序列取自GenBank數據庫，JX-Fuliang/2019/China為本研究中擴得序列。

將擴得的東方體屬56-kDa基因片段測序，2份樣本基因序列一致，同源性分析顯示該序列與恙蟲病東方體的56-kDa基因序列同源性為100%。系統(tǒng)進化樹分析顯示該菌株與恙蟲病東方體(GU446598.1，JN415556.1，GQ332758.1，LC110350.1)處于同一進化分支，為Gilliam基因型(圖4)。

圖中菌株序列取自GenBank數據庫，JX/2019/China為本研究中擴得序列。

3 討 論

既往調查研究發(fā)現，江西省嚙齒動物攜帶有鼠疫耶爾森菌[25]、廣州管圓線蟲[26]、漢坦病毒[27]，鉤端螺旋體[15]等多種人獸共患病原或寄生蟲，但境內嚙齒動物攜帶立克次體鮮有報道。本次研究采用分子生物學方法對江西省南豐縣、銅鼓縣、上猶縣、浮梁縣、上高縣、上饒市廣信區(qū)的嚙齒類動物攜帶立克次體的情況進行了調查，發(fā)現部分地區(qū)黑線姬鼠攜帶貝氏柯克斯體、新塔拉薩維奇立克次體和恙蟲病東方體。

貝氏柯克斯體是重要的人獸共患病—Q熱的病原體。本次研究在江西省北部的浮梁縣、銅鼓縣以及東北部的上饒市廣信區(qū)的黑線姬鼠檢出貝氏柯克斯體，陽性率為6.11%，提示這些地區(qū)存在Q熱的疫源地，黑線姬鼠是該疫源地貝氏柯克斯體的儲存宿主和潛在的Q熱傳染源。盡管江西目前尚未見Q熱疫情報告，但仍有必要對當地臨床不明原因發(fā)熱患者進行Q熱篩查。

新塔拉薩維奇立克次體是斑點熱群的一新種，于2001年首先在俄羅斯烏拉爾南部和西部、西伯利亞東部的全溝硬蜱(Ixodespersalcatus)中發(fā)現[28]，隨后我國黑龍江、吉林、河南的全溝硬蜱中也檢出該立克次體[29]，王寧等[30]在內蒙西部的長爪沙鼠及五趾跳鼠也檢出該立克次體。另外，賈娜等于2012年在我國黑龍江牡丹江地區(qū)，首次從患者血樣本分離到新塔拉薩維奇立克次體，證實該立克次體可感染人[31]。本次研究中，我們從浮梁縣1只黑線姬鼠樣本中檢出該立克次體，系統(tǒng)進化樹顯示該立克次體與我國黑龍江、吉林等地蜱中檢出的新塔拉薩維奇立克次體處于同一分支，提示除長爪沙鼠及五趾跳鼠外，黑線姬鼠也是新塔拉薩維奇立克次體的宿主。此外，該地區(qū)的蜱是否也攜帶該立克次體和當地人群中是否存在斑點熱感染值得進一步研究。

恙蟲病東方體是我國廣泛分布的重要人獸共患病病原，其自然界儲存宿主主要為鼠類動物，恙螨為其傳播媒介[32]。1998年廖如桂等利用間接免疫熒光法確診了江西首例恙蟲病病例，隨后贛州、撫州等市縣也有恙蟲病散發(fā)病例報告[33]，2006-2018年江西省部分縣市恙蟲病的年均發(fā)病率超過了0.98/10萬[34]。本次調查在江西省浮梁縣和南豐縣的黑線姬鼠中檢出恙蟲病東方體，系統(tǒng)進化樹顯示這2株恙蟲病東方體均屬Gilliam型，該型是我國主要的流行株，提示這兩個縣存在恙蟲病的自然疫源地。

江西是一個動植物種類繁多、植被覆蓋率高、山清水秀的生態(tài)秀麗的省份，世界性分布的立克次體病原體也可在這種自然環(huán)境中循環(huán)。采用分子生物學方法，調查自然環(huán)境中的立克次體的宿主和傳播媒介，將發(fā)現立克次體病的自然疫源地，將為有效防控人群的立克次體感染提供科學依據。

利益沖突：無