徐志軍 孔冉 蘇俊波 周峰 張垂明 吳小麗 劉洋

摘 ?要：分離群體是進(jìn)行作物遺傳圖譜構(gòu)建、性狀遺傳研究、性狀調(diào)控關(guān)鍵基因挖掘和種質(zhì)資源創(chuàng)新利用的重要基礎(chǔ)。本研究利用‘崖城94-46和‘新臺(tái)糖22號(hào)雜交獲得了209個(gè)雜交單株，通過SSR標(biāo)記鑒定真假雜種和剔除病死單株，獲得了1個(gè)包含145個(gè)雜交后代的F1群體。F1群體主要農(nóng)藝性狀遺傳變異分析表明，8個(gè)性狀都存在雙向超親現(xiàn)象，變異系數(shù)范圍為9.23%～56.78%，8個(gè)性狀的頻數(shù)分布均呈連續(xù)正態(tài)分布，均為由多基因控制的數(shù)量性狀。相關(guān)分析和逐步回歸分析表明，甘蔗叢重與株高、莖徑和叢有效莖顯著正相關(guān)，決定系數(shù)為0.92;叢糖含量主要由株高、莖徑、錘度和叢有效莖4個(gè)因素決定，決定系數(shù)為0.94。研究結(jié)果為利用甘蔗F1群體開展遺傳研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為甘蔗育種中重點(diǎn)選擇性狀確定提供參考。

關(guān)鍵詞：甘蔗栽培種;F1群體;農(nóng)藝性狀;遺傳變異

Abstract： Segregation population is an important basis for genetic linkage map construction， trait inheritance studying， key gene mining and germplasm resource innovated utilization. In this study， 209 seedlings derived from ‘Yacheng 94-46 and ‘ROC 22 were identified by SSR markers， and a F1 population were constructed containing 145 clones combined with filed evaluation. Traits genetic variation analysis of F1 population revealed that eight traits were quantitative traits controlled by multiple genes. The traits were transgressive segregation on both sides. The variation coefficients of the traits ranged from 9.23% to 56.78%， and the frequency distribution showed continuous normal distribution. Correlation analysis and stepwise regression analysis showed that sugarcane clump weight was positively correlated with plant height， stalk diameter and clump effective stalk number， with a determination coefficient of 0.92. And the content of sucrose was mainly determined by four factors including plant height， stalk diameter， brix and clump effective stalk number with a determination coefficient of 0.94. The results would lay a foundation for the genetic research on sugarcane F1 population and provide a reference for the determination of key selected traits in sugarcane breeding.

Keywords： cultivated sugarcane; F1 population; agronomic traits; genetic variation

甘蔗（Saccharum spp.）是我國(guó)重要的糖料作物，在我國(guó)熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛種植，由甘蔗制取的蔗糖是我國(guó)人民食用蔗糖的主要來源（占90%以上）。甘蔗基因組約為10?Gb，基因組極其復(fù)雜，其基因組因具有異源多倍體、非整倍體的特性，而制約著甘蔗的基因組學(xué)、遺傳學(xué)和重要功能基因的挖掘。隨著分子生物學(xué)、數(shù)量遺傳學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，利用作物分離群體和分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建和QTL定位，已廣泛地應(yīng)用于花生[1]、梨[2]、割手密[3]等多種基因組復(fù)雜或群體構(gòu)建難度大的植物基因組研究、遺傳進(jìn)化和重要性狀解析，為甘蔗的遺傳研究提供了借鑒和參考。在甘蔗的研究上，20世紀(jì)90年代以來，國(guó)內(nèi)外科研工作者針對(duì)甘蔗分離群體創(chuàng)制進(jìn)行了積極探索，多個(gè)F1和BC1群體先后被創(chuàng)制出來，如Hoarau等[4]利用R570構(gòu)建的自交F1群體，劉新龍等[5]利用（Co419×Y75/1/2）×ROC25構(gòu)建的BC1群體，其中F1群體被認(rèn)為是遺傳圖譜構(gòu)建質(zhì)量較好、最為經(jīng)濟(jì)的構(gòu)圖群體[5-6]。利用分離群體，DHont等[7]、Grivet等[8]、Hoarau等[4]、劉新龍等[5]、Balsalobre等[9]分別使用RFLP、AFLP、SSR、RAF、SNP標(biāo)記篩選出的單劑量標(biāo)記及（或）雙劑量標(biāo)記構(gòu)建了甘蔗栽培種SP701006、R570、Q165、Co419、SP80-3280×RB835486的分子遺傳連鎖圖譜，其中的一些遺傳圖譜還用于蔗糖含量、錘度等多個(gè)性狀的QTL定位，為這些性狀的遺傳研究奠定了基礎(chǔ)。如Balsalobre等[9]利用SP80-3280×RB835486雜交創(chuàng)制的F1群體，構(gòu)建了一張包含993個(gè)SNP標(biāo)記，由223個(gè)連鎖群組成的總長(zhǎng)3682.04 cM的甘蔗栽培種遺傳圖譜，并對(duì)蔗糖含量、錘度、莖徑和纖維含量4個(gè)性狀進(jìn)行QTL定位，共檢測(cè)到7個(gè)QTL，單個(gè)QTL解釋了2%～9%的表型變異。然而，用于我國(guó)甘蔗栽培種性狀遺傳研究的分離群體仍然較為缺乏，還有大量的農(nóng)藝、產(chǎn)量、品質(zhì)性狀需要進(jìn)行解析。鑒于分離群體在甘蔗遺傳研究、重要性狀解析和功能基因挖掘中的作用，本研究擬利用性狀

差異顯著的甘蔗栽培種資源雜交創(chuàng)制F1群體，利用分子標(biāo)記對(duì)群體進(jìn)行真假雜種鑒定，并對(duì)甘蔗群體的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，為今后利用該群體進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建和重要性狀QTL定位奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

以含糖量、產(chǎn)量和抗病性具有顯著差異的甘蔗品系‘崖城94-46為母本，以品種‘新臺(tái)糖22號(hào)（ROC 22）為父本。2018年將父母本種植于海南省三亞市海南甘蔗育種場(chǎng)實(shí)驗(yàn)基地，冬季誘導(dǎo)開花進(jìn)行雜交，收獲雜交種。其中母本‘崖城94-46具有植株直立、大莖、病蟲害少等優(yōu)良性狀，父本‘新臺(tái)糖22號(hào)具有生長(zhǎng)快、植株高、生勢(shì)好、糖分高、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)等優(yōu)良特性。

1.2 ?方法

1.2.1 ?田間設(shè)計(jì) ?2019年春季在廣東省湛江市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站基地中對(duì)雜交種進(jìn)行催芽、育苗，其中親本使用蔗莖育苗，于4葉期（2019年5月）一并移栽到大田種植。親本各種植3個(gè)株行，每行10株，雜交種隨機(jī)排列，每10株1個(gè)株行，行長(zhǎng)4.0?m，株距0.4?m，行距1.5?m，于2019年12月底收獲。

1.2.2 ?真假雜種分子標(biāo)記鑒定 ?取親本和雜交種各單株幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取DNA[10]，從前期利用甘蔗嵌合單倍體基因組信息設(shè)計(jì)的SSR引物中隨機(jī)挑選20對(duì)[11]，PCR體系和擴(kuò)增條件參照徐志軍等[10]的方法，以親本DNA為模板，篩選差異引物。選取其中的3對(duì)差異引物（表1）按照如下原則對(duì)群體進(jìn)行擴(kuò)增：（1）群體DNA使用1對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果中，含有父本帶型的為真雜種;（2）不含父本帶型的，使用下1對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)，按照（1）對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析;（3）3對(duì)引物檢測(cè)結(jié)果均為母本帶型或無(wú)帶的，在本研究中判定為假雜種。

1.2.3 ?主要農(nóng)藝性狀鑒定 ?于收獲前一周在田間調(diào)查真雜種的存活情況，剔除病死和不能進(jìn)行擴(kuò)繁的雜交后代，對(duì)可以擴(kuò)繁的后代按照《甘蔗種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[12]在田間調(diào)查親本和群體的叢有效莖數(shù)（N）、株高（H）、莖徑（D）、錘度（B），并按照如下公式估算群體的單莖重（SW）、叢重（CW）、蔗糖分（SC）和叢糖含量（CSC）：

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

使用Excel和Origin 8.0軟件對(duì)親本和群體主要農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 ?結(jié)果分析

2.1 ?F1群體鑒定

對(duì)‘崖城94-46和‘新臺(tái)糖22號(hào)雜交獲得的雜交種進(jìn)行催芽、育苗獲得209個(gè)雜交單株。以親本為模板，對(duì)20對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，共篩選到3對(duì)差異引物。使用引物sh020061、sh060101、sh090229對(duì)群體進(jìn)行擴(kuò)增，如圖1所示，使用引物sh020061進(jìn)行擴(kuò)增，雜交單株檢測(cè)到父本帶型的為真雜種，只含母本帶型或無(wú)帶的結(jié)合其他2對(duì)引物進(jìn)行判定，共鑒定出171個(gè)真雜種單株。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，真雜種中有26個(gè)雜交單株在田間發(fā)生病害死亡，獲得了1個(gè)包含145個(gè)雜交后代的栽培種甘蔗F1群體。

2.2 ?親本和F1群體表型變異

親本和F1群體表型數(shù)據(jù)分析表明（表2）：親本‘崖城94-46和‘新臺(tái)糖22號(hào)在親本在莖徑和單莖重2個(gè)性狀上差異不顯著，在株高、錘度、叢有效莖、蔗糖分、叢重和叢含糖量6個(gè)性狀上存在顯著差異，其中親本在錘度和蔗糖分2個(gè)性狀上差異最大。F1群體在株高、莖徑和叢有效莖均值均小于低值親本，錘度均值介于雙親之間。F1群體在株高、莖徑、錘度、叢有效莖、蔗糖分、單莖重、叢重、叢含糖量8個(gè)性狀上分布都存在雙向超親現(xiàn)象，其中分別有13、6、59、12、61、7、2、8個(gè)雜交后代超過高值親本。8個(gè)性狀的變異系數(shù)分別為10.51%、12.53%、9.23%、54.06%、13.89%、28.79%、54.34%和56.78%，其中叢有效莖、叢重和叢含糖量的離散程度最大。

2.3 ?F1群體數(shù)據(jù)分布分析

對(duì)F1群體8個(gè)性狀的數(shù)據(jù)進(jìn)行箱線圖分析表明：群體在8個(gè)性狀的數(shù)值集中分布于上四分位數(shù)和下四分位數(shù)之間（圖2）。偏度分析表明：株高、錘度和蔗糖分3個(gè)性狀數(shù)據(jù)分布左偏，其余性狀數(shù)據(jù)分布右偏（表2）。峰度分析表明，8個(gè)性狀數(shù)據(jù)分布均為尖峰分布（表2）。8個(gè)性狀的頻數(shù)分布均呈連續(xù)分布（圖2），符合正態(tài)分布曲線，表明這8個(gè)性狀都是由多基因控制的數(shù)量性狀，可用于性狀的QTL定位。對(duì)于親本差異不顯著的莖徑和單莖重，F(xiàn)1群體中分別有92.41%和94.48%的家系在性狀上的表現(xiàn)都弱于低值親本。

2.4 ?8個(gè)性狀的相關(guān)性分析

對(duì)F1群體的8個(gè)性狀進(jìn)行相關(guān)分析表明（表3）：呈顯著正相關(guān)的性狀有株高與莖徑、株高與叢重、莖徑與叢含糖量、叢有效莖與蔗糖分、蔗糖分與叢重、單莖重與叢重;呈極顯著正相關(guān)的性狀有株高與單莖重、莖徑與單莖重、莖徑與叢重、錘度

與叢有效莖、錘度與蔗糖分、錘度與叢含糖量、叢有效莖與叢重和從含糖量、蔗糖分與從含糖量、叢重與叢含糖量;呈顯著負(fù)相關(guān)的性狀有株高與叢有效莖、叢有效莖與單莖重;呈極顯著負(fù)相關(guān)的性狀有株高與蔗糖分、株高與錘度。在這8個(gè)性狀中，錘度和蔗糖分、叢重和叢含糖量、莖徑和單莖重、叢有效莖和叢含糖量、叢有效莖和叢重相關(guān)系數(shù)值較高，分別為1.00、0.97、0.94、0.87、0.86。

2.5 ?叢產(chǎn)量和從含糖量逐步回歸分析

分別以叢重（y1）和叢糖含量（y2）為因變量，以株高（x1）、莖徑（x2）、錘度（x3）、叢有效莖（x4）、蔗糖分（x5）、單莖重（x6）為自變量進(jìn)行多元逐步線性回歸分析，得到回歸方程y1= 1.36x1+2.19x2+1.02x4-8.35和y2=0.21x1+0.35x2+ 0.03x3+0.16x4?2.00，方程的決定系數(shù)分別為R12= 0.92和R22=0.94。分析表明，甘蔗叢重主要由株高、莖徑和叢有效莖3個(gè)因素決定，叢糖含量主要由株高、莖徑、錘度和叢有效莖4個(gè)因素決定。

3 ?討論

利用性狀差異親本構(gòu)建分離群體是進(jìn)行作物性狀遺傳研究、性狀調(diào)控關(guān)鍵基因挖掘和種質(zhì)資源創(chuàng)新利用的重要基礎(chǔ)，與水稻、小麥、玉米等禾本科作物相比，甘蔗分離群體構(gòu)建難度較大[5]，利用群體開展遺傳研究也相對(duì)落后。前人已經(jīng)利用不同類型的甘蔗資源在甘蔗群體構(gòu)建方面進(jìn)行了積極探索，如陸鑫等[13]利用熱帶種Saccharum officinarum與滇蔗茅（Erianthus rockii）云南95-19屬間遠(yuǎn)緣雜交構(gòu)建了包含62個(gè)無(wú)性系F1群體;劉新龍等[14]用甘蔗品種Co419與野生種割手密（Saccharum spontaneum）Y75/1/2遠(yuǎn)緣雜交構(gòu)建了包含269個(gè)家系的F1群體，這些群體的創(chuàng)制明確了不同類型資源雜交后的性狀分離特征。本研究利用甘蔗育種上2個(gè)重要的親本資源‘崖城94-46和‘新臺(tái)糖22號(hào)雜交構(gòu)建了1個(gè)包含了145個(gè)雜交后代的甘蔗栽培種F1群體，對(duì)利用同一類型資源雜交后的性狀分離進(jìn)行了分析，表明株高、莖徑、錘度、叢有效莖、蔗糖分等性狀都是由多基因控制的數(shù)量性狀，與前人利用不同類型資源研究的結(jié)果相一致[9， 13-17]。

本研究使用的雜交親本在莖徑和單莖重2個(gè)性狀差異不明顯，而F1群體中莖徑和單莖重分離范圍分別為1.57～3.51?cm、0.37～2.23?kg，在單個(gè)性狀上出現(xiàn)顯著超越親本的雜交后代（分別為6個(gè)和7個(gè)），表明在育種過程中，使用綜合性狀的相近材料雜交也有可能創(chuàng)制出優(yōu)異的育種中間材料。而在其余6個(gè)親本間差異較大的性狀上，除叢重僅有2個(gè)家系超過大值親本，其余5個(gè)性狀超親后代數(shù)目要顯著大于莖徑和單莖重，這表明利用性狀差異較大的親本進(jìn)行雜交組合配置獲得優(yōu)異雜交后代的可能性更高。對(duì)F1群體8個(gè)性狀的回歸分析表明，在高產(chǎn)高糖甘蔗品種選育方面，株高、莖徑、錘度和叢有效莖是需要進(jìn)行重點(diǎn)選擇的關(guān)鍵性狀，已有研究表明，在甘蔗新品種選育過程中還應(yīng)加強(qiáng)出苗發(fā)株勢(shì)強(qiáng)、生勢(shì)強(qiáng)甘蔗材料的選育[18]。王勤南等[15]對(duì)6個(gè)甘蔗自交F1群體研究表明，株高與錘度呈正相關(guān);趙俊[18]利用113個(gè)國(guó)外甘蔗種質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，株高與蔗糖分和錘度呈不顯著負(fù)相關(guān)，但蔗糖分和錘度與蔗產(chǎn)量呈極顯著負(fù)相關(guān);而本研究利用‘崖城94-46和‘新臺(tái)糖22號(hào)雜交發(fā)現(xiàn)，株高與蔗糖分和錘度呈極顯著負(fù)相關(guān)，表明甘蔗性狀的遺傳還較為復(fù)雜，但在育種中需要協(xié)調(diào)蔗產(chǎn)量和糖分、錘度，從而獲得理想的糖產(chǎn)量。

獲得足夠多的分子標(biāo)記對(duì)F1群體進(jìn)行基因分型，是利用F1群體進(jìn)行遺傳研究的基礎(chǔ)。甘蔗栽培種基因組極其復(fù)雜，異源多倍體、非整倍體、種間雜交結(jié)構(gòu)制約著基因組的解析和分子標(biāo)記的開發(fā)[3，19]。運(yùn)用最新測(cè)序和組裝技術(shù)，割手密最小單倍體AP85-441（1n=4x=32，3.5 Gb）[3]，甘蔗栽培種R570嵌合單倍體高質(zhì)量序列（330 Mb）[19]先后發(fā)布，為利用F1群體進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建和QTL定位提供了大量分子標(biāo)記資源。此外，Zhang等[20]對(duì)LA Purple（Saccharum officinarum）與Molokai 5829（Saccharum robustum）及其雜交構(gòu)建的F1群體進(jìn)行RNA-seq測(cè)序，對(duì)親本開發(fā)了20 842個(gè)SNP和11?158個(gè)SNP，構(gòu)建了總長(zhǎng)分別為7096.5?cM和6742.0 cM LA Purple和Molokai 5829的高密度遺傳圖譜，表明利用轉(zhuǎn)錄技術(shù)進(jìn)行高通量分子標(biāo)記的開發(fā)在甘蔗F1群體的利用方面具有巨大的潛力。因此，在今后的研究中，充分利用現(xiàn)有的基因組信息，結(jié)合多種標(biāo)記開發(fā)技術(shù)，有助于加速甘蔗栽培種基于分離群體的遺傳研究。

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責(zé)任編輯：白 ?凈

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