崔學(xué)強(qiáng) 唐璇 黃昌艷 鄧杰玲 李秀玲 盧家仕 張自斌

摘 ?要：以48份石斛蘭種質(zhì)資源為對象，采用iPBS分子標(biāo)記技術(shù)對其遺傳多樣性進(jìn)行分析并構(gòu)建DNA指紋圖譜。結(jié)果表明：從83條iPBS引物中篩選出7條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物;利用篩選出的引物對48份石斛蘭基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得279條譜帶，其中多態(tài)性條帶279條，多態(tài)性比例為100%;采用GenAlEx 6.5軟件計(jì)算48份石斛蘭的平均觀測等位基因數(shù)（Na）為2.000，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.202，平均Neis遺傳多樣性指數(shù)（He）為0.153，平均Shannon信息多樣性指數(shù)（I）為0.274，48份石斛蘭表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性;采用NTSYS-pc 2.1軟件計(jì)算得到48份石斛蘭間的遺傳相似系數(shù)為0.6667～0.9211，基于遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類，在相似系數(shù)0.75處，可將48份石斛蘭劃分為7個類群。利用2對引物構(gòu)建的DNA指紋圖譜可單獨(dú)鑒別出48份石斛蘭種質(zhì)資源，該圖譜可為石斛蘭分類與鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：石斛蘭;iPBS分子標(biāo)記;遺傳多樣性;DNA指紋圖譜

Abstract： The genetic diversity of 48 Dendrobium germplasm resources was analyzed and DNA fingerprint was constructed by the iPBS molecular marker technique. The results showed that seven primers with clear amplification bands， high polymorphism and good repeatability were selected from 83 iPBS primers. The selected primers were used to amplify the genomic DNA of 48 Dendrobium germplasm resources by PCR， and a total of 279 bands were generated， of which 279 were polymorphic bands， and the polymorphic ratio was 100%. By GenAlEx 6.5 software， average value of observed allele number， effective number of alleles， Nei's gene diversity and Shannon's information index was 2.000， 1.202， 0.153 and 0.274， respectively， indicating that a high level of genetic diversity among the 48 Dendrobium germplasm resources. The genetic similarity coefficient among the 48 Dendrobium germplasm resources ranged from 0.6667 to 0.9211 by NTSYS-pc 2.1 software. UPGMA clustering based on genetic similarity coefficient revealed the 48 Dendrobium germplasm resources could be divided into seven groups when genetic similarity was 0.75. The DNA fingerprint map constructed with two pairs of primers could separately identify the 48 Dendrobium germplasm resources， which could provide a scientific basis for the classification and identification of Dendrobium.

Keywords： Dendrobium; iPBS molecular marker; genetic diversity; DNA fingerprinting

石斛蘭（Dendrobium）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬植物的總稱，全球約2000個原生種，中國原產(chǎn)80余種[1]。石斛蘭因其花色鮮艷，花姿優(yōu)美，花期長，具芳香氣味，而與卡特蘭（Cattleya）、蝴蝶蘭（Phalaenopsis）、文心蘭（Oncidium）并列為觀賞價(jià)值最高的“四大觀賞洋蘭”[2]。部分石斛蘭還是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，其中鐵皮石斛（Dendrobium officinale）、金釵石斛（Dendrobium nobile）、鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum）、流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum）等均被收錄在《中國藥典》中[3-4]。目前，石斛蘭已被廣泛栽培于世界各地，經(jīng)過育種家開展的新品種的選育工作，已有不少經(jīng)典石斛蘭品種流行于市場。中國開展石斛蘭新品種選育較晚，目前市場上流行的品種大部分都是從國外引進(jìn)的品種。如何挖掘利用這些經(jīng)典品種并結(jié)合我國石斛蘭資源自身優(yōu)勢，培育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的石斛蘭新品種已成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。然而要挖掘和利用石斛蘭種質(zhì)資源，就必須對種質(zhì)資源進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定，并對其遺傳多樣性及親緣關(guān)系有深入了解，才能更有目的地選擇親本，加快新品種選育進(jìn)程。

分子標(biāo)記技術(shù)可在DNA水平上檢測生物的遺傳多樣性。該技術(shù)不依賴基因表達(dá)和環(huán)境條件，并且操作簡單，快速且易于自動化。在分子標(biāo)記輔助育種、群體遺傳研究、種質(zhì)資源鑒定、遺傳關(guān)系分析和遺傳圖譜構(gòu)建中起著重要作用[5]。Inter-primer binding site（iPBS）分子標(biāo)記技術(shù)是Kalendar等[6]提出的以長末端重復(fù)序列（long terminal repeats， LTRs）類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)簡單、有效且無需預(yù)先獲知相關(guān)的LTR序列，與傳統(tǒng)的分子標(biāo)記技術(shù)相比，iPBS分子標(biāo)記技術(shù)在品種鑒定、遺傳多樣性分析等更有優(yōu)勢[7]。目前，該分子標(biāo)記技術(shù)已應(yīng)用于牡丹[5]、葡萄[8-9]、枸杞[10]、楊梅[11]、番石榴[12]、杏子[13]、豌豆[14]、胡蘿卜[15]、亞麻[16]等植物的品種鑒定、遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構(gòu)建，而對石斛蘭的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。因此，本研究以收集保存的48份石斛蘭種質(zhì)資源為對象，采用iPBS分子標(biāo)記技術(shù)，研究種質(zhì)資源間的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，并構(gòu)建DNA指紋圖譜，以期為石斛蘭品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建及分子育種等提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本研究以48份石斛蘭種質(zhì)資源為材料，供試樣本均種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所蘭科植物種質(zhì)資源圃。選取幼嫩的健康葉片用封閉的塑料袋包裝，保存于冰盒中，及時帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍，保存于?80?℃冰箱中，用于基因組DNA的提取，樣品采集編號見表1。

1.2 ?方法

1.2.1 ?基因組DNA提取 ?石斛蘭基因組DNA采用EasyPure Genomic DNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）試劑盒提取，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，并用紫外分光光度計(jì)檢測其濃度和純度，將提取的DNA用TE緩沖液稀釋濃度至20 ng/μL，于?20?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?引物篩選及iPBS-PCR擴(kuò)增 ?試驗(yàn)采用的引物序列選用Kalendar等[6]發(fā)表的83個iPBS引物序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。從合成的引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的引物對供試樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，其中2×EasyTaq? PCR SuperMix 10 μL、模板DNA 1 μL、引物1 μL、無菌水8?μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4?℃預(yù)變性4?min;94?℃變性1?min，50?℃（不同引物退火溫度見表2）退火45?s，72?℃ 1?min，35個循環(huán);72?℃延伸7?min，擴(kuò)增產(chǎn)物放置于4?℃冰箱中保存。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜，同一遷移位置上有條帶的記“1”，無條帶的記為“0”。將擴(kuò)增引物記錄的條帶構(gòu)建“0，1”矩陣。采用NTSYS-pc 2.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用UPGMA方法聚類，建立樹狀圖。利用GenAlEx 6.5軟件計(jì)算等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis遺傳多樣性指數(shù)（He）、Shannon信息多樣性指數(shù)（I）。根據(jù)聚類結(jié)果，篩選出可鑒別供試材料的引物，根據(jù)引物組合的“0，1”矩陣，手動構(gòu)建DNA指紋圖譜。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?引物擴(kuò)增多態(tài)性分析

從83條iPBS引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物7條，對48份石斛蘭基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見表2，擴(kuò)增總條帶為279條，其中多態(tài)性條帶為79條，多態(tài)性比率為100%，每條引物擴(kuò)增產(chǎn)生的條帶數(shù)在37～43條之間。其中擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最多的引物為

2076，擴(kuò)增位點(diǎn)43個，最少的引物為2219，擴(kuò)增位點(diǎn)37個，平均每條引物多態(tài)性條帶數(shù)為39.9，說明用iPBS分子標(biāo)記方法檢測石斛蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性效率很高。引物2076對48份石斛蘭基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

2.2 ?48份石斛蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

利用7條iPBS引物產(chǎn)生的標(biāo)記信息，經(jīng)NTSYS-pc 2.1軟件計(jì)算48份石斛蘭種質(zhì)資源遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.6667～0.9211。其中‘莎諾公主石斛（Dendrobium Himezakura ‘Sanokku）和‘中華夢石斛（Dendrobium China Dream ‘Crystal）遺傳相似系數(shù)最大為0.9211，說明二者親緣關(guān)系最近，遺傳差異相對較小?！S鉆戒石斛（Dendrobium Pittero Gold ‘Diamond Ring）和鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）遺傳相似系數(shù)最小為0.6667，說明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳差異相對較大。采用GenAlEx軟件計(jì)算48份石斛蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性指數(shù)（表3），平均觀察等位基因數(shù)（Na）為2.000，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.202，平均Neis基因多樣性指數(shù)（He）為0.153，平均Shannon多樣性信息指數(shù)（I）為0.274，表明48份石斛蘭種質(zhì)資源間存在豐富的遺傳多樣性。

2.3 ?48份石斛蘭種質(zhì)資源聚類分析

為了確定48份石斛蘭種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系，采用NTSYS-pc 2.1分析軟件對遺傳矩陣按UPGMA進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀聚類圖（圖2）。在遺傳相似系數(shù)為0.75時，可將48份石斛蘭種質(zhì)資源劃分為7個類群。第Ⅰ類群包括麝香石斛、檀香石斛和鐵皮石斛3份種質(zhì)，該類群均是石斛蘭原生種，該類群又可分為2個分支，其中麝香石斛、檀香石斛為1個分支，鐵皮石斛單獨(dú)聚為1個分支。第Ⅱ類群包括束花石斛、金釵石斛、美花石斛、大晶帽石斛、紫苑石斛、扭瓣石斛、球花石斛、鉤狀石斛、梳唇石斛等13份種質(zhì)，該類群除‘龍馬石斛為商品種外，其余均為原生種。第Ⅲ類群包括‘皇后石斛、‘拿波里石斛、‘紅小町石斛、‘中華夢石斛、‘國王石斛、‘米奇石斛、‘糖果石斛等11份種質(zhì)，該類群全部為石斛商品種。第Ⅳ類群包括‘重唇石斛、‘棱晶石斛、‘粉夢幻石斛、‘紅夢幻石斛、‘春神石斛、‘口袋情人石斛、‘三陽石斛等18份種質(zhì)，該類群除‘重唇石斛為原生種外，其余均為商品種。第Ⅴ類僅有大苞鞘石斛1份種質(zhì)，且為石斛原生種。第Ⅵ類群僅有喇叭唇石斛1份種質(zhì)，且為石斛原生種。第Ⅶ類群僅有‘富士山石斛1份種質(zhì)，且為石斛商品種。

2.4 ?48份石斛蘭種質(zhì)資源DNA指紋圖譜構(gòu)建

利用篩選出的7條iPBS引物對48份石斛蘭種質(zhì)資源構(gòu)建DNA指紋圖譜，通過對比發(fā)現(xiàn)引物2076和2271均可單獨(dú)鑒別出48份石斛蘭。本研究利用引物2076構(gòu)建了48份石斛蘭種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜（圖3），其中黑色表示該位點(diǎn)有條帶，即該位點(diǎn)在“0，1”矩陣中為“1”，無色表示該位點(diǎn)無條帶，即該位點(diǎn)為“0”。構(gòu)建的指紋圖譜可用于48份石斛蘭的分類與鑒定。

3 ?討論

3.1 ?iPBS分子標(biāo)記的多態(tài)性分析

iPBS是一類基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基礎(chǔ)的新型分子標(biāo)記技術(shù)，之前iPBS分子標(biāo)記在石斛蘭品種鑒定、遺傳多樣性分析等方面的研究鮮有報(bào)道。本研究從83條iPBS引物中篩選出7條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物，對48份石斛蘭種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測到279條譜帶，且均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為100%。其引物多態(tài)性與利用ISSR分子標(biāo)記開展石斛蘭遺傳多樣性及親緣關(guān)系等研究的引物多態(tài)性一致[17-19]，略高于利用RAPD[20-21]、AFLP[22]、SRAP[23 ]等分子標(biāo)記的引物多態(tài)性。研究結(jié)果充分表明iPBS標(biāo)記是一種簡單高效、擴(kuò)增多態(tài)性較好的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記用于石斛蘭種質(zhì)資源品種鑒定、遺傳多樣性及親緣關(guān)系等研究是可行的。

3.2 ?遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

遺傳多樣性是生物多樣性的核心內(nèi)容，是生命進(jìn)化和物種分化的基礎(chǔ)，為研究物種的遺傳基礎(chǔ)、品種鑒定、親本優(yōu)選等提供理論依據(jù)。本研究的48份供試材料中，18份為石斛蘭原生種，30份為石斛蘭商品種，從引物多態(tài)性比例、遺傳相似系數(shù)變化范圍及遺傳多樣性指數(shù)等方面進(jìn)行研究，結(jié)果表明48份石斛蘭種質(zhì)間遺傳多樣性較豐富，種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)較寬。分析其主要原因是原生種和商品種遺傳背景差異較大，尤其大部分商品種資源都是經(jīng)過多代雜交選育獲得，其血緣關(guān)系非常復(fù)雜。從聚類結(jié)果也可看出，石斛蘭原生種和商品種各自單獨(dú)聚為一個分支。本研究構(gòu)建的聚類圖在遺傳相似系數(shù)為0.75處，可將48份石斛蘭種質(zhì)資源劃分為7個類群。第Ⅰ類群中麝香石斛、檀香石斛聚為1個分支，該聚類結(jié)果與林榕燕等[23]的聚類結(jié)果一致，表明麝香石斛、檀香石斛二者親緣關(guān)系較近。早期已有研究者利用麝香石斛和檀香石斛進(jìn)行雜交，獲得雜交后代Dendrobium Nestor，并于1892年在皇家園藝協(xié)會進(jìn)行登錄[1]。第Ⅱ類群13份種質(zhì)除‘龍馬石斛為商品種外，其余均為原生種，‘龍馬石斛與原生種洛氏石斛聚在一起，表明二者親緣關(guān)系較近，‘龍馬石斛可能有洛氏石斛的血統(tǒng)。第Ⅲ類群11份種質(zhì)全為商品種且單獨(dú)聚在一起，表明11份商品種間親緣關(guān)系近，雜交更易親和。但第Ⅲ類群與第Ⅰ類群和第Ⅱ類群的石斛蘭原生種遺傳距離相對較近，也說明第Ⅲ類群的商品種在與原生種石斛進(jìn)行雜交時，可能存在一定的親和性。第Ⅳ類群18份種質(zhì)，主要都是商品種，但其與第Ⅲ類群單獨(dú)分開，說明這18份商品種間親緣關(guān)系近，雜交更易親和。第Ⅳ類群的商品種與原生種石斛蘭遺傳距離相對較遠(yuǎn)，說明第Ⅳ類群的商品種在與原生種石斛進(jìn)行雜交時，較第Ⅲ類群商品種親和性差。任羽等[24]基于分子分類的石斛蘭雜交結(jié)實(shí)性探討的研究中，發(fā)現(xiàn)石斛蘭商品種間雜交組合結(jié)實(shí)率>原生種之間雜交組合結(jié)實(shí)率>商品種與原生種間雜交組合結(jié)實(shí)率。本研究石斛蘭原生種和商品種的聚類結(jié)果，與任羽等[24]的研究結(jié)論較為一致。通過本研究對石斛蘭商品種和原生種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，有助于充分利用石斛資源和提高育種效率，但由于石斛遺傳背景比較復(fù)雜，單一標(biāo)記只能檢測到石斛基因組的部分位點(diǎn)，僅憑一種分子標(biāo)記分析其遺傳多樣性和親緣關(guān)系可能不夠準(zhǔn)確，因此，今后應(yīng)結(jié)合多種標(biāo)記對其進(jìn)行深入研究。

3.3 ?DNA指紋圖譜構(gòu)建

DNA指紋圖譜是指DNA樣品用特定分子標(biāo)記技術(shù)處理顯示出具有特定DNA片段的總稱[25]。DNA分子標(biāo)記具有不受環(huán)境因子和時空條件影響且高效、快捷等優(yōu)點(diǎn)，可直接反映品種間的遺傳差異，已成為品種鑒定的有效方法之一。前期利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建石斛蘭DNA指紋圖譜有少量報(bào)道，其中劉士輝等[26]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建的特征指紋圖譜，可將供試的10份石斛材料區(qū)分開。李懷志等[27]利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建的特征指紋圖譜可將供試的20份鐵皮石斛種質(zhì)完全區(qū)分開。本研究中采用的iPBS分子標(biāo)記技術(shù)已在葡萄指紋圖譜構(gòu)建中成功應(yīng)用[9]，但應(yīng)用在石斛蘭DNA指紋圖譜構(gòu)建確是較少;篩選出的7條引物中有2條引物擴(kuò)增的“0，1”矩陣構(gòu)建的DNA指紋圖譜，可區(qū)分48份石斛蘭種質(zhì)資源，這說明iPBS分子標(biāo)記應(yīng)用于石斛蘭DNA指紋圖譜構(gòu)建是可行的，但如供試樣本改變，則可能需要重新篩選適合的引物，構(gòu)建指紋圖譜對供試材料進(jìn)行鑒定和區(qū)分。

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