黨 雯,侯宏保

(1山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥學部,太原 030001;2山西醫(yī)科大學藥學院;*通訊作者,E-mail:27780042@qq.com)

癌癥成為了世界范圍內(nèi)威脅人類健康最嚴重的疾病之一,據(jù)估計,到2030年,全球癌癥死亡人數(shù)將超過1 140萬[1]。因此,全球?qū)拱┧幬锏男枨笳谏仙?020年以來,抗癌藥物銷售額達到1 500億美元,在各類藥物中排名首位。因此,癌癥的流行及其對現(xiàn)有治療藥物的耐藥性要求開發(fā)新藥,以克服現(xiàn)有藥物的局限性[2,3]。

超過200種化療藥物已被FDA批準用于治療癌癥,其中75%來自天然產(chǎn)物[4,5]。隨著人們對抗腫瘤藥物的深入研究,發(fā)現(xiàn)天然藥物在抗癌藥物中起重要作用,大約三分之二的抗腫瘤藥物是發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物來源或衍生分子[6,7]。其中通過對天然活性成分的結(jié)構(gòu)進行修飾改造,克服其局限性,從而發(fā)現(xiàn)新的高效低毒的抗腫瘤藥物,已經(jīng)成為了一條有效的途徑。

粉防己堿(tetrandrine,Tet)是一種典型的二芐基異喹啉類生物堿,具有多種生物活性,包括抗炎、抑制腫瘤增殖、免疫調(diào)節(jié)等。還作為一種具有多種作用機制的潛在抗癌藥物,能抑制腫瘤細胞的增殖,增加化療藥物的敏感性,逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥(MDR)[8]。其中,Tet可誘導多種腫瘤細胞凋亡,包括人肺癌細胞、肝癌細胞、白血病細胞、結(jié)腸癌細胞、淋巴瘤細胞、人乳腺癌細胞等[9,10]。文獻研究顯示,粉防己堿的結(jié)構(gòu)修飾報道較少,改造主要是在C-5和C-14位置引入鹵素再構(gòu)建C-C或C-N鍵,制備異喹啉單元的季銨鹽[11-13]。在這項研究中,為豐富粉防己堿衍生物的結(jié)構(gòu)多樣性和獲得更好的抗癌候選藥物,以粉防己堿為原料,依次經(jīng)硝化、還原反應,獲得關(guān)鍵中間體14-氨基粉防己堿,采用Chan-Lam-Evans偶聯(lián)法再將其與硼酸類化合物合成了新型粉防己堿衍生物[14-17]。利用HL7702和HepG2細胞對新合成的粉防己堿衍生物進行生物活性評價。本文還對其抗肝癌HepG2細胞活性最強的化合物的遷移侵襲能力進行了研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點儀;ZF-I型三用紫外分析儀;Bruker AVANCE 600 MHz型超導核磁儀(TMS為內(nèi)標);Bruker AV-Ⅲ 400 MHz超導核磁共振波譜儀;Bruker ESI-QTOF型液質(zhì)聯(lián)用儀。

粉防己堿購自南京道斯夫生物科技有限公司;催化劑、配體均購自百靈威科技有限公司;實驗用水為國藥集團產(chǎn)蒸餾水;其他化學試劑均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

HepG2細胞、HL2202細胞由中國科學院上海藥物研究所提供。

1.2 14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿的合成

1.2.1 中間體C-14-硝基粉防己堿、C-14-氨基粉防己堿的合成 在惰性氣體氮氣保護下,溫度為-10 ℃時,將HNO3(69%,1.2 ml,19.2 mmol)緩慢滴加到(CH3CO)2O(3.0 ml,32.0 mmol)的溶液中,繼續(xù)攪拌20 min。待混合液溫度至室溫后,滴加溶解于CH2Cl2(5 ml)中的粉防己堿(1.0 g,1.6 mmol)中,在-5 ℃下反應6.5 h,反應過程中用薄層色譜法對反應進程進行監(jiān)測,反應結(jié)束后,用飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅反應原液,用CH2Cl2(3×20 ml)萃取,用無水硫酸鈉干燥,過濾。溶劑在減壓下被除去,以CH2Cl2/MeOH(50/1,V/V)混合溶液為洗脫劑,經(jīng)硅膠柱層析純化,得到化合物C-14-硝基粉防己堿(見圖1)。

將C-14-硝基粉防己堿(1.0 g,1.5 mmol)與鈀(10%,100 mg)碳加氫催化劑的混合物加入水合肼(85%,1.65 ml,45.0 mmol)的無水甲醇(30 ml)中,在80 ℃攪拌。反應在2 h內(nèi)完成?；旌衔锢鋮s至室溫,過濾除去催化劑。濾液采用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法進行蒸發(fā)。用CH2Cl2稀釋殘渣,用水清洗,在無水硫酸鎂上干燥,過濾。溶劑在減壓下被除去。原油由石油醚和丙酮(1/3,V/V)重結(jié)晶得到化合物C-14-氨基粉防己堿(見圖1)。

圖1 14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿的合成路線Figure 1 The synthetic routes of 14-N-(3-acetylphenyl)-amino-tetrandrine

1.2.2 14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿的合成及鑒定 將中間體C-14-氨基粉防己堿(0.16 mmol,100 mg)、3-乙?；脚鹚?0.32 mmol,52.47 mg)、醋酸銅(0.32 mmol,63.89 mg)和吡啶(0.24 mmol,19.98 ml)在室溫下進行“一鍋化”反應。在干燥的氧氣中攪拌12-24 h反應終止。用氨水淬滅反應,過濾,用CH2Cl2萃取3次。無水硫酸鈉干燥,過濾,溶劑在減壓下被除去。用硅膠層析法從CH2Cl2/MeOH(50/1,V/V)中分離得到產(chǎn)物(見圖1)。

14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿:黃褐色固體85.57 mg;產(chǎn)率:70.8%;熔點:142.7-143.3 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ7.46(s,1H),7.25(dd,J=8.9,2.5 Hz,2H),7.20(d,J=5.0 Hz,1H),7.15(dd,J=8.1,2.5 Hz,1H),7.08(d,J=7.7 Hz,1H),6.95(s,1H),6.60(dd,J=8.4,2.5 Hz,1H),6.55-6.46(m,1H),6.42(d,J=5.2 Hz,1H),6.24(d,J=5.3 Hz,1H),6.10(dd,J=8.5,1.8 Hz,1H),5.84(d,J=9.4 Hz,1H),3.95-3.85(m,2H),3.85-3.78(m,3H),3.67(d,J=3.2 Hz,3H),3.61-3.49(m,2H),3.44(d,J=5.7 Hz,2H),3.30(d,J=3.3 Hz,3H),3.05(d,J=8.7 Hz,3H),2.57(m,3H),2.45(m,2H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ197.5,162.2,154.9,150.9,148.2,147.9,147.3,145.0,143.3,142.9,137.4,137.0,135.3,132.4,131.8,128.8,128.5,126.7,126.3,125.0,120.7,120.3,120.2,119.8,118.3,117.3,113.3,111.3,111.2,104.8,102.7,63.1,60.8,60.1,59.1,55.4,54.7,54.6,43.8,42.1,41.0,39.9,38.6,37.7,30.9,28.7,28.3,25.8,23.4,21.7,19.6。HRMS(ESI-TOF)m/z:756.37{[M+H]+},計算得C46H49N3O7。紅外:3 356,2 942,2 831,1 453,1 021 cm-1。

1.3 抗腫瘤活性

1.3.1 抗腫瘤活性MTT測試 取處于對數(shù)生長期,生長狀態(tài)良好的HepG2、HL7702細胞,以5×106個/孔接種于96孔板,分別標記為HepG2、HL7702細胞組,同時設空白組,37 ℃培養(yǎng)過夜(在細胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μl無菌PBS),作用24,48,72 h。每孔加入10 μl(5 mg/ml)MTT,37 ℃培養(yǎng)4 h;吸出培養(yǎng)基,加入150 μl DMSO震蕩10 min;酶標儀測定568 nm下的各孔吸光值(OD值)。對照組存活率記為100%。

1.3.2 細胞劃痕實驗檢測14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿對HepG2細胞遷移能力的影響 marker筆在6孔板背后,用直尺比著,均勻的劃橫線,大約每隔0.5-1 cm一道,橫穿過孔,每孔至少穿過5條線;取處于對數(shù)生長期,生長狀態(tài)良好的HepG2細胞;用PBS清洗細胞,去除劃下的細胞,加入無血清培養(yǎng)基,同時拍取0 h照片;放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后拍照;本操作依據(jù)參考文獻進行[18]。

1.3.3 細胞侵襲實驗檢測14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對HepG2細胞遷移能力的影響 取處理好的HepG2細胞,加入PBS清洗細胞,胰酶消化收集離心,去上清。無血清MEM培養(yǎng)基重懸細胞,細胞計數(shù)板計數(shù)。結(jié)晶紫染液染色,室溫中放置20 min,PBS清洗,用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)的未遷移的細胞擦干凈,顯微鏡下觀察拍照;本操作依據(jù)參考文獻進行[19]。

1.3.4 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 22對不同組間體外藥效學的差異進行比較,采用單因素方差分析以及LSD-t檢驗(方差齊)和非參數(shù)檢驗(方差不齊)進行分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 生物活性

MTT法體外抗腫瘤活性測試結(jié)果表明:該化合物對所測腫瘤細胞有不同程度的增殖抑制作用(見表1)。

表1 不同化合物對腫瘤細胞及正常細胞的抑制作用

結(jié)果顯示,合成的14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對肝癌HepG2細胞有抑制活性,化合物(IC50=4.61 μmol/L)對肝癌HepG2細胞的IC50值遠低于先導化合物粉防己堿(IC50=10.98 μmol/L)。

2.2 14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿對肝癌HepG2細胞生存率的影響

采用MTT法評價14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿對肝癌HepG2細胞生存率的影響,使用不同濃度的14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿作用于HepG2細胞24,48,72 h后,對細胞的的生長抑制作用結(jié)果見表2。14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿可以劑量依賴性地抑制HepG2細胞增殖(見圖2)。在24,48,72 h的IC50值分別為7.25,4.61,2.98 μmol/L。

圖2 14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿對HepG2細胞生存率的影響Figure 2 Effects of 14-N-(3-acetylbenzene)-amino tetrandrine on survival rate of HepG2 cells

表2 14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿抑制HepG2細胞增殖的作用

2.3 劃痕實驗檢測14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿對HepG2細胞遷移能力的影響

倒置顯微鏡觀察化合物作用48 h后HepG2細胞劃痕細胞面積的差異,結(jié)果見圖3。劃痕實驗證實14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿抑制HepG2細胞遷移能力,0 μmol/L干預組0 h和48 h遷移距離分別為(51±4.1)μm和(181±4.6)μm,1 μmol/L干預組細胞劃痕0 h和48 h遷移距離分別為(50±2.4) μm和(168±6.3)μm；2 μmol/L干預組細胞劃痕0 h和48 h遷移距離分別為(52±1.3)μm和(135±2.1)μm；4 μmol/L干預組干預組細胞劃痕0 h和48 h遷移距離分別為(53±1.9)μm和(50±5.3)μm。不同濃度作用后遷移距離差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明14-N-(3-乙酰基苯)-氨基粉防己堿能夠抑制HepG2細胞的遷移能力,且呈濃度依賴性。

2.4 Transwell實驗檢測14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿對HepG2細胞侵襲力的影響

0 μmol/L干預組通過膜過濾器的遷移數(shù)量為(40±1)個,2 μmol/L干預組通過膜過濾器的遷移數(shù)量為(20±2)個,4 μmol/L干預組通過膜過濾器的遷移數(shù)量為(11±1)個,6 μmol/L干預組通過膜過濾器的遷移數(shù)量為(3±1)個,不同濃度干預后通過膜過濾器的遷移細胞數(shù)量差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿對HepG2細胞的侵襲能力表現(xiàn)出明顯的抑制作用,且呈濃度依賴性。

圖4 Transwell實驗分析14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿對HepG2細胞侵襲的影響 (倒置顯微鏡,×200)Figure 4 Effects of 14-N-(3-acetylbenzene)-amino tetrandrine on invasion of HepG2 cells by Transwell (inverted microscope,×200)

3 討論與結(jié)論

以粉防己堿為先導化合物,經(jīng)過中間體C14-硝基粉防己堿、C14-氨基粉防己堿,再經(jīng)Chan-Lam-Evans反應合成了粉防己堿衍生物,并通過HRMS、1H NMR、13C NMR等技術(shù)手段進行了表征。采用MTT法對衍生物進行體外細胞增殖活性篩選,細胞劃痕實驗和Transwell侵襲結(jié)果均表明,14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿對肝癌HepG2細胞有較好的生物活性;此外,14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿(IC50=4.61 μmol/L)對HepG2細胞的毒性是粉防己堿原料藥對HepG2細胞毒性的2.38倍和阿霉素對HepG2細胞毒性的2.91倍。由于14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿對HepG2細胞的抑制效果較好,進一步設置4個濃度分別進行干預,發(fā)現(xiàn)化合物可以劑量依賴性地抑制HepG2細胞增殖。

進一步的研究表明,14-N-(3-乙?；?-氨基粉防己堿具有明顯抑制肝癌細胞HepG2遷移和侵襲的能力。以上實驗設計合成及初步活性探究結(jié)果可為進一步通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化尋求更加有效的抗腫瘤化合物提供參考。