石 磊, 陳 平, 王 昊, 趙 偉, 符德元

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院/揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 1. 胃腸外科, 2. 甲乳外科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

胃腸間質(zhì)瘤(GIST)是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，顯示Cajal間質(zhì)細(xì)胞分化，大多數(shù)患者具有c-kit或血小板源性生長因子受體A(PDGFRA)功能獲得性突變[1]?！吨袊改c間質(zhì)瘤診斷治療共識(shí)(2017年版)》[2]推薦疑難病例、擬行靶向治療(包括術(shù)前治療、輔助治療和晚期GIST靶向治療)、野生型、繼發(fā)耐藥GIST患者行常規(guī)基因檢測。基因檢測對評估GIST患者預(yù)后以及分子靶向治療反應(yīng)性均有指導(dǎo)意義。本研究分析GIST中c-kit、PDGFRA基因的突變類型及特點(diǎn)，探討其與GIST臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，旨在為GIST患者的全程化管理提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集江蘇省蘇北人民醫(yī)院2013年1月—2020年12月收治的288例經(jīng)臨床診斷、病理檢查確診為GIST且具有完整臨床病理學(xué)資料、基因突變信息的患者信息。臨床病理學(xué)資料包括性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、腫瘤最大徑、核分裂象計(jì)數(shù)、改良美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)危險(xiǎn)分級和CD117、CD34和DOG-1表達(dá)情況等?；蛲蛔冃畔╟-kit基因外顯子9、外顯子11、外顯子13、外顯子17和PDGFRA基因外顯子12、外顯子18的突變情況。

1.2 Sanger基因測序

選擇合適的腫瘤組織石蠟包埋切片5張，勾選腫瘤細(xì)胞比例在60%以上的腫瘤組織區(qū)域并行刮取、富集腫瘤細(xì)胞，蘇木精-伊紅(HE)染色結(jié)果見圖1。提取DNA，測定DNA濃度和純度，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增。采用雙向Sanger測序檢測c-kit基因外顯子9、外顯子11、外顯子13、外顯子17及PDGFRA基因外顯子12、外顯子18突變，測序引物見表1。對于DNA碎片嚴(yán)重的標(biāo)本，可針對性地設(shè)計(jì)短片段引物測序。最后應(yīng)用Chromas軟件進(jìn)行測序結(jié)果解讀。

A: 梭形細(xì)胞型GIST;

B: 上皮細(xì)胞型GIST。

表1 c-kit和PDGFRA外顯子的PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理學(xué)特征

288例GIST患者中，原發(fā)性突變型GIST(MUT-GIST)244例(84.72%), 繼發(fā)性耐藥MUT-GIST 10例(3.47%), 野生型GIST(WT-GIST)34例(11.81%)。244例原發(fā)性MUT-GIST中, c-kit基因突變231例(外顯子9、11、13、17突變分別為25、189、7、10例), PDGFRA基因突變13例(外顯子12、18突變分別為3、10例)。見圖2。剔除繼發(fā)性耐藥MUT-GIST和WT-GIST, 對244例原發(fā)性MUT-GIST進(jìn)一步分析。

244例原發(fā)性MUT-GIST患者中，男144例，女100例，年齡30～85歲，平均(59.14±9.66)歲，腫瘤最大徑1～26 cm, 平均(7.73±4.06) cm。腫瘤最常見的部位是胃，其次是小腸、直腸、十二指腸和結(jié)腸，其余19例患者的腫瘤位于胃腸外部位或不能明確原發(fā)灶(包括腹膜后、腸系膜和網(wǎng)膜)。見表2。

表2 244例原發(fā)性MUT-GIST患者臨床病理學(xué)特征

2.2 基因突變分析結(jié)果

2.2.1 原發(fā)性MUT-GIST基因突變分析結(jié)果: 244例原發(fā)性MUT-GIST外顯子突變比例、突變類型見圖3、圖4。244例原發(fā)性MUT-GIST外顯子突變類型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=262.629,P<0.05), 見表3。

表3 244例原發(fā)性MUT-GIST外顯子突變類型比較

25例c-kit基因外顯子9 MUT-GIST中, A502-Y503重復(fù)突變22例(88.00%)、F506L點(diǎn)突變1例(4.00%)、C452-S453缺失突變2例(8.00%)。189例c-kit外顯子11 MUT-GIST突變類型復(fù)雜多樣，包括缺失突變111例(58.73%)、點(diǎn)突變65例(34.39%)、重復(fù)突變3例(1.59%)、插入突變4例(2.12%)和混合突變6例(3.17%)。缺失突變和點(diǎn)突變是c-kit外顯子11最常見的突變類型，大多數(shù)c-kit外顯子11突變表現(xiàn)為del W557-K558缺失突變(60例，占31.75%)。外顯子11突變涉及550～579位密碼子，累積突變頻次557次，熱點(diǎn)區(qū)域集中在557～560位密碼子，占54.76%(305/557)，見表4、圖5。7例c-kit外顯子13 MUT-GIST均為K642E點(diǎn)突變。10例c-kit外顯子17 MUT-GIST均為點(diǎn)突變，其中D816E點(diǎn)突變1例(10.00%)、D816V點(diǎn)突變1例(10.00%)、N822K點(diǎn)突變8例(80.00%)。3例PDGFRA外顯子12 MUT-GIST中，V561D點(diǎn)突變1例(33.33%)、S566R，567-571缺失混合突變1例(33.33%)、S566Q，567-571缺失混合突變1例(33.33%)。10例PDGFRA外顯子18 MUT-GIST中，Del I843-D846缺失突變1例(10.00%)、V824V點(diǎn)突變2例(20.00%), Y849C點(diǎn)突變2例(20.00%)、D842V點(diǎn)突變5例(50.00%)。

表4 c-kit外顯子11密碼子突變頻次

2.2.2 繼發(fā)性耐藥MUT-GIST基因突變分析結(jié)果: 10例繼發(fā)性耐藥MUT-GIST均為術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移病例，患者均接受甲伊馬替尼分子靶向治療。9例原發(fā)性突變?yōu)閏-kit外顯子11突變(90.00%),1例原發(fā)性突變?yōu)閏-kit外顯子9突變(10.00%); 繼發(fā)性c-kit外顯子13突變2例(20.00%), 繼發(fā)性c-kit外顯子17突變2例(20.00%), 繼發(fā)性c-kit外顯子18突變6例(60.00%)。10例患者的臨床病理及基因突變信息見表5。

表5 10例繼發(fā)性耐藥MUT-GIST患者的臨床病理及基因突變信息

2.3 基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

2.3.1 基因突變位點(diǎn)與臨床病理特征的關(guān)系: 原發(fā)性MUT-GIST基因突變位點(diǎn)與腫瘤原發(fā)部位、腫瘤最大徑、核分裂像計(jì)數(shù)有關(guān)(P<0.05), 與其他臨床病理特征無關(guān)(P>0.05)。c-kit外顯子11突變更易發(fā)生在胃來源的GIST，其次為小腸; c-kit外顯子9突變最常見于小腸來源的GIST; c-kit外顯子13、17突變常見于胃來源的GIST; PDGFRA突變常見于胃來源的GIST。c-kit外顯子11、9、13、17突變易發(fā)生在腫瘤最大徑>5～10 cm的GIST。c-kit外顯子11突變更易發(fā)生在核分裂象0～5個(gè)/50 HPFs的GIST，其次為核分裂象>5～10個(gè)/50 HPFs的GIST; c-kit外顯子9突變最常見于核分裂象>5～10個(gè)/50 HPFs的GIST; c-kit外顯子13多見于核分裂象>5～10個(gè)/50 HPFs的GIST, c-kit外顯子17突變常見于核分裂象0～5個(gè)/50 HPFs的GIST。PDGFRA突變常見于核分裂象0～5個(gè)/50 HPFs的GIST。見表6。

表6 244例原發(fā)性MUT-GIST患者基因突變位點(diǎn)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3.2 基因突變類型與臨床病理特征的關(guān)系: 原發(fā)性MUT-GIST基因突變類型與患者年齡、腫瘤原發(fā)部位、腫瘤最大徑、核分裂像計(jì)數(shù)、改良NIH危險(xiǎn)分級有關(guān)(P<0.05)，與其他臨床病理特征無關(guān)(P>0.05)?！?0歲患者突變類型由多到少依次為點(diǎn)突變、缺失突變、重復(fù)突變、混合突變和插入突變, >60歲患者則依次為缺失突變、點(diǎn)突變、重復(fù)突變、混合突變和插入突變。點(diǎn)突變和缺失突變最常發(fā)生在胃來源的GIST, 而小腸來源的GIST中以缺失突變和重復(fù)突變更常見。腫瘤最大徑≤5 cm的GIST最常見的突變類型為點(diǎn)突變，腫瘤最大徑>5 cm的GIST最常見的突變類型為缺失突變。核分裂象0～5個(gè)/50 HPFs的GIST最常見的突變類型為點(diǎn)突變，核分裂象>5個(gè)/50 HPFs的GIST最常見的突變類型為缺失突變。NIH危險(xiǎn)分級為極低危、低危組中最常見的突變類型為點(diǎn)突變，中危、高危組最常見的突變類型為缺失突變。見表7。

表7 244例原發(fā)性MUT-GIST患者基因突變類型與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 GIST危險(xiǎn)分級的Logistic回歸分析

考慮到改良NIH危險(xiǎn)分級是由腫瘤原發(fā)部位、腫瘤大小、核分裂象計(jì)數(shù)和腫瘤是否破裂這4個(gè)因素計(jì)算得來，因此剔除腫瘤原發(fā)部位、腫瘤大小、核分裂象計(jì)數(shù)后將性別、年齡、突變類型、外顯子這4個(gè)因素作為協(xié)變量，以改良NIH危險(xiǎn)分級極低危與低危組、中危與高危組為因變量進(jìn)行二元Logistic回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，年齡>60歲、缺失突變、c-kit 外顯子11突變患者的改良NIH危險(xiǎn)分級風(fēng)險(xiǎn)分別增高2.060、3.264、3.819倍。見表8。

表8 GIST危險(xiǎn)分級的Logistic回歸分析

3 討 論

GIST是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，顯示Cajal間質(zhì)細(xì)胞分化, c-kit或PDGFRA功能獲得性突變被認(rèn)為是GIST發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因子[1]。相關(guān)研究[3-5]報(bào)道, GIST患者c-kit突變發(fā)生率為75%～95%, 最主要發(fā)生于外顯子11，其次為外顯子9、13、17, 偶可見外顯子14、18突變; PDGFRA突變發(fā)生率為3%～10%, 多見于外顯子12、18, 外顯子14突變少見。本研究中，原發(fā)性c-kit突變占80.21%, 原發(fā)性PDGFRA突變占4.51%, 野生型占11.81%, 繼發(fā)性耐藥突變型占3.47%。

考慮到PCR反應(yīng)假陰性結(jié)果導(dǎo)致“假野生型”的可能，本研究剔除野生型GIST, 僅對突變型GIST進(jìn)行分析。本研究發(fā)現(xiàn), c-kit基因突變以外顯子11最為常見，其次為外顯子9，少見外顯子13、17, PDGFRA突變則相對少見，其中外顯子18較外顯子12突變常見，同時(shí)c-kit突變與PDGFRA突變呈現(xiàn)出互斥性，與相關(guān)研究[6]結(jié)論一致。c-kit基因外顯子9突變以A502-Y503重復(fù)突變?yōu)橹?88.00%), 且腫瘤原發(fā)部位多位于小腸，與SZUCS Z等[7]研究結(jié)果一致。c-kit基因外顯子11突變類型、位點(diǎn)最為復(fù)雜多樣，突變類型以缺失突變和點(diǎn)突變?yōu)橹?，突變熱點(diǎn)區(qū)域集中在557～560位密碼子，其中以W557-K558缺失突變最為常見，與相關(guān)報(bào)道[8]一致。c-kit基因外顯子13、17均為點(diǎn)突變, PDGFRA以外顯子18的D842V突變?yōu)橹?，與報(bào)道[8]一致。

c-kit和PDGFRA基因突變狀態(tài)是目前GIST靶向治療最有力的療效預(yù)測因子[9]。c-kit基因外顯子11突變患者對伊馬替尼最敏感, c-kit基因外顯子9及野生型GIST對伊馬替尼反應(yīng)性不佳，而PDGFRA外顯子18的D842V突變則對伊馬替尼原發(fā)耐藥。準(zhǔn)確的基因檢測是制定個(gè)體化治療策略的重要依據(jù)，也是分子靶向治療發(fā)揮療效的重要前提[10-11], 基因檢測應(yīng)當(dāng)貫穿于GIST綜合治療的全過程中。值得重視的是，在對基因檢測結(jié)果進(jìn)行解讀時(shí)需要謹(jǐn)慎對待“野生型GIST”, 臨床醫(yī)生需認(rèn)識(shí)到一代測序的局限性和假陰性的存在，對于有條件的野生型GIST可考慮二代測序[12]。

c-kit和PDGFRA基因突變狀態(tài)對判斷GIST患者的自然預(yù)后具有指導(dǎo)意義。ANDERSSON J等[13]研究指出, c-kit基因外顯子11缺失突變患者的預(yù)后較差。本研究發(fā)現(xiàn)，外顯子11突變患者改良NIH危險(xiǎn)分級為中危、高危者占74.60%, 而外顯子11突變以缺失突變最多(58.73%)，提示外顯子11缺失突變與GIST患者不良預(yù)后有關(guān)。ANDERSSON J等[13]同樣認(rèn)為，c-kit基因外顯子9突變具有更高的侵襲性生物學(xué)行為。本研究結(jié)果顯示, c-kit基因外顯子9突變患者改良NIH危險(xiǎn)分級為中危、高危者占92.00%, 提示外顯子9突變與GIST患者不良預(yù)后有關(guān)。由于PDGFRA基因突變率低、樣本量少，目前關(guān)于其突變狀態(tài)與GIST患者預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較少。孫祥飛等[14]研究59例PDGFRA突變型GIST發(fā)現(xiàn)，腫瘤均來源于胃，其中D842V突變占61.0%, 腫瘤≤5 cm者占55.9%, 核分裂象計(jì)數(shù)≤5個(gè)/50 HPFs者占83.0%, 改良NIH危險(xiǎn)度分級以極低危和低危為主，提示PDGFRA突變型GIST惡性程度相對較低，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低。本研究Logistic回歸分析結(jié)果顯示，年齡大于60歲、缺失突變、c-kit外顯子11突變的GIST患者，其改良NIH危險(xiǎn)分級風(fēng)險(xiǎn)分別增高2.06、3.264、3.819倍。但該結(jié)果還需進(jìn)一步開展多中心、大樣本量研究進(jìn)行支持。

目前，大多數(shù)學(xué)者[15-20]認(rèn)為，伊馬替尼繼發(fā)性耐藥的最主要機(jī)制是c-kit、PDGFRA基因的二次突變，對伊馬替尼耐藥病灶的c-kit基因分析顯示，最常見的突變類型是點(diǎn)突變，以外顯子13、14 和17居多，分別占38.3%、13.4%、54.5%。本研究中，繼發(fā)性耐藥突變均為點(diǎn)突變，外顯子18、13、17分別占60.00%、20.00%、20.00%, 發(fā)生耐藥突變的時(shí)間間隔平均為25.5個(gè)月。

綜上所述, GIST患者發(fā)生c-kit、PDGFRA基因突變的概率高，突變位點(diǎn)、類型復(fù)雜多變。本研究對原發(fā)性MUT-GIST、繼發(fā)性耐藥MUT-GIST的突變類型、突變位點(diǎn)以及相關(guān)臨床病理學(xué)特征進(jìn)行詳盡描述與分析，提示基因突變類型對評估GIST患者預(yù)后及靶向治療反應(yīng)性均有指導(dǎo)意義，可為GIST全程化管理提供分子病理學(xué)參考。未來，基于基因驅(qū)動(dòng)的GIST全程化管理模式勢必越來越多地受到重視，可進(jìn)一步改善GIST患者的預(yù)后。