范吉林，朱婷婷，田曉玲，薛振宇，任雯慶，郭經(jīng)奇，張世亮

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 2 50355；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州 3 71600；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南 2 50011）

冠心病（coronary heart disease，CHD）是由于冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)粥樣硬化，從而導(dǎo)致患者心臟出現(xiàn)缺血、缺氧、壞死等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響患者的心功能［1］。2型糖尿?。╰ypeⅡdiabetes，T 2DM）是一種以血糖升高為綜合表現(xiàn)的代謝性疾病，其可以誘發(fā)心臟、血管等病變，是CHD病發(fā)的重要誘因之一［2］，冠心病合并2型糖尿病可致多種系統(tǒng)功能改變，病發(fā)心、腦、腎等組織器官功能衰退［3］。近年來(lái)，隨著人們生活方式的改變和生活水平的提高，冠心病和糖尿病的患病率呈逐年上升的趨勢(shì)。有研究指出，冠心病合并T 2DM患者預(yù)后情況較單純冠心病預(yù)后患者差，并且T 2DM患者罹患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)高于健康人群2～4倍［4］。由此可見(jiàn)，冠心病和T 2DM互為影響，同時(shí)加重各自疾病的發(fā)展［5］。因此在臨床中及早發(fā)現(xiàn)和治療能夠有效預(yù)防和延緩冠心病合并糖尿病患者的壽命［6］。目前臨床中多采用西藥治療，雖能有效緩解患者癥狀，但預(yù)后較差［7］；隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中醫(yī)藥在治療冠心病和T 2DM中療效確切，并且能夠有效改善患者的臨床癥狀和預(yù)后情況。

黃連解毒湯出自葛洪《肘后備急方》，方名首見(jiàn)于《外臺(tái)秘要》，具有瀉火解毒的功效，用于治療三焦火毒之證，主要由黃連、黃芩、黃柏和梔子等4味藥組成，黃連入上焦而瀉心火，黃芩、黃柏清瀉中焦和下焦之火，梔子清瀉三焦火熱，黃連解毒湯是治療三焦火盛的經(jīng)典方劑［8］。研究證明，黃連解毒湯具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、降糖、調(diào)脂、降壓、改善胰島素抵抗和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等作用［9］，在臨床中廣泛應(yīng)用于冠心病、高血壓、糖尿病、高脂血癥等疾病的治療，不僅療效確切，而且安全性較高［9］。黃連解毒湯雖在臨床中廣泛用用，但其作用機(jī)制尚不明確，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究黃連解毒湯治療冠心病合并T 2DM的作用機(jī)制，以期為黃連解毒湯在臨床中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的綜合調(diào)控特征的中藥機(jī)理研究方法，在中藥機(jī)理研究中的應(yīng)用已成為發(fā)展中藥必不可少的方法［10］。這種用于探索“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”之間相互作用關(guān)系的方法與中醫(yī)的整體觀念相契合。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新的研究思路，可以用于解釋中藥復(fù)方的配伍規(guī)律及為中藥尋找新的適應(yīng)證［11］。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討黃連解毒湯“異病同治”冠心病和T 2DM的作用機(jī)制，為黃連解毒湯在臨床中應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 黃連解毒湯藥物活性成分篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）以方中藥物黃連、黃芩、黃柏、梔子為關(guān)鍵詞檢索收集黃連解毒湯的活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性（DL）≥為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，并通過(guò)該數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)得到黃連解毒湯的潛在作用靶點(diǎn)，然后將得到的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 藥物靶點(diǎn)獲取

在OMIM（http：//www.omim.org/）和Gene-Cards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)以“coronary heart disease”“typeⅡdiabetes”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到冠心病和T 2DM的潛在靶點(diǎn)

1.3 黃連解毒湯治療冠心病與T 2DM靶點(diǎn)獲取

運(yùn)用Venn（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線平臺(tái)將化合物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 藥物?成分?靶點(diǎn)?疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將黃連解毒湯中單味藥及活性成分，藥物-疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7，2軟件中，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，利用“Network Analyzer”功能進(jìn)行分析，其中節(jié)點(diǎn)代表藥物、成分、疾病、靶點(diǎn)，邊代表藥物與成分、成分與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與疾病之間的相互作用關(guān)系。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)篩選

將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入至STING（http：//string-db.org）數(shù)據(jù)庫(kù)，將物種限制為“人”（Homo sapiens），構(gòu)建藥物-疾病蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將STING數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到的數(shù)據(jù)，以“tsv”格式導(dǎo)入至Cytoscape3.7.2軟件中，根據(jù)度值大于平均值為條件篩選出核心靶點(diǎn)，并構(gòu)建核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO生物過(guò)程與KEGG通路富集分析

將得到的藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入至DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”，將物種限定為“人”（Homo sapiens），以P≤0.05為條件篩選得到黃連解毒湯治療冠心病合糖尿病的生物過(guò)程；以P≤0.05篩選得到黃連解毒湯治療冠心病合糖尿病的相關(guān)通路，選取前20條繪制表格。

2 結(jié)果

2.1 黃連解毒湯活性成分篩選

以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在TCMSP共檢索得到黃連解毒湯活性成分103個(gè)，其中黃芩36個(gè)，黃連14個(gè)，黃柏38個(gè)，梔子15個(gè)，刪除重復(fù)項(xiàng)最終得到黃連解毒湯活性成分86個(gè)，并通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)得到藥物潛在作用靶點(diǎn)140個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 黃連解毒湯活性成分篩選Tab 1 Active components of Huanglian Jiedu Decoction

2.2 藥物與疾病交集靶點(diǎn)Venn圖

通過(guò)OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索得到冠心病相關(guān)靶點(diǎn)5 342個(gè)、T 2DM相關(guān)靶點(diǎn)114個(gè)，運(yùn)用Venn圖將黃連解毒湯活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與冠心病和T 2DM疾病靶點(diǎn)取交集，得到黃連解毒湯治療冠心病和糖尿病的14個(gè)靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM的靶點(diǎn)Venn圖Fig 1 Venn diagram of Huanglian Jiedu Decoction in tr eating cor onar y hear t disease and T 2DM

2.3 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，其中網(wǎng)絡(luò)中共有91個(gè)節(jié)點(diǎn)（其中黃連解毒湯1個(gè)，疾病2個(gè)，靶點(diǎn)14個(gè)，活性化合物74個(gè)），黃色代表黃芩活性成分，綠色代表黃柏活性成分，粉色代表黃連活性成分，紅色代表?xiàng)d子活性成分，藍(lán)色代表藥物-疾病交集靶點(diǎn)，“六邊形”代表黃連解毒湯，“矩形”代表疾病冠心病和T 2DM。其中槲皮素（MOL 000098）、β-谷甾醇（MOL 000358）、豆甾醇（MOL000449）、黃連素（MOL001454）、小檗堿（MOL 002894）、Worenine（MOL 002668）等活性成分節(jié)點(diǎn)的度值較高，提示這些活性化合物在黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM中發(fā)揮重要作用。見(jiàn)圖2。

圖2 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network diagram of medicine-ingredient-disease-target

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將藥物-疾病相映射得到的14個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STING在線平臺(tái)進(jìn)行蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，圖中共包括14個(gè)節(jié)點(diǎn)，45條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為6.43，節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)蛋白，邊代表蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，見(jiàn)圖3。將STING數(shù)據(jù)庫(kù)得到的文件以“tsv”格式導(dǎo)入至Cytoscape3.7.2軟件中，以Degree值大于6為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到藥物-疾病核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，其中白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、趨化因子2（CCL 2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）節(jié)點(diǎn)的度值分別為12、11、9、10，說(shuō)明這些靶點(diǎn)是黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM的核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖4。

圖3 黃連解毒湯與冠心病和T 2DM蛋白互作分析圖Fig 3 Proteins interaction between Huanglian Jiedu Decoction and coronary heart disease and T2DM

圖4 藥物-疾病核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Network diagram of core target of drug-disease

2.5 GO功能結(jié)果分析

將上述得到的14個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入至DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)進(jìn)行GO功能富集分析，得到生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）條目98個(gè)，以P≤0.05為篩選條件，分別選取前10條繪制成氣泡圖，主要涉及基因表達(dá)的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、胞外空間、細(xì)胞因子活性、類(lèi)固醇激素受體活性等生物過(guò)程。見(jiàn)圖5～7。

圖5 GO生物過(guò)程分析Fig 5 GO biological process analysis

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)14個(gè)交集靶點(diǎn)主要富集在20條信號(hào)通路上（P≤0.05），見(jiàn)表2，其中涉及瘧疾、癌癥信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、胰島素抵抗等通路，其中HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路與冠心病和T 2DM關(guān)系密切，提示黃連解毒湯可能通過(guò)以上通路參與治療冠心病T 2DM。

表2 KEGG通路信息表Tab 2 KEGG pathway results

圖6 GO細(xì)胞組分分析Fig 6 GO Cell components analysis

圖7 GO分子功能分析Fig 7 GO M olecular function analysis

3 討論

冠心病歸屬于中醫(yī)“胸痹”范疇，其病機(jī)多為本虛標(biāo)實(shí)，多由于氣滯、血瘀、痰凝等病理產(chǎn)物導(dǎo)致熱毒內(nèi)蘊(yùn)、灼傷脈絡(luò)，致絡(luò)脈拘攣不同［9］；T 2DM屬于“消渴病”范疇，病機(jī)多為陰虛為本，燥熱為標(biāo)，多由于飲食炙煿厚味，致脾胃蘊(yùn)化失常，蘊(yùn)積化熱，濕熱蘊(yùn)結(jié)化火，火熱易蘊(yùn)結(jié)生毒，熱毒易傷機(jī)體之氣陰［12］；二者病理基礎(chǔ)具有相似之處，多由于“熱毒”致病，可以概括為“熱毒熾盛”［12］，因此，臨床中治療應(yīng)以“清熱解毒”為主。黃連解毒湯作為清熱解毒的經(jīng)典方劑，在臨床中廣泛應(yīng)用于T 2DM、冠心病、老年性癡呆、頸動(dòng)脈斑塊、缺血性中風(fēng)等疾病的治療［13］。路春茹［14］將100例T 2DM合冠心病患者隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，對(duì)照組采用常規(guī)西藥治療，觀察組以黃連解毒湯治療，治療結(jié)果顯示黃連解毒湯具有良好的效果，不僅可以降低患者的血糖水平，而且還可以改變冠心病患者的臨床癥狀。進(jìn)一步證實(shí)黃連解毒湯“異病同治”冠心病和T 2DM的具有良好的臨床療效，但由于其成分較復(fù)雜，作用機(jī)制尚不明確，因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討黃連解毒湯“異病同治”冠心病和T 2DM的作用機(jī)制，為黃連解毒湯在臨床中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法共篩選出黃連解毒湯活性成分103個(gè)和相對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)140個(gè)。其中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、黃連素、小檗堿等活性成分作用最強(qiáng)。研究證明，槲皮素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善心功能、降血脂、抗血栓、抑制心肌肥厚等作用，并且還具有降血糖、減輕胰島素抵抗的作用［15］。小檗堿能夠通過(guò)下調(diào)p38MAPK介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路來(lái)降低炎性細(xì)胞因子的表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡［16］；小檗堿具有抗糖尿病作用，能夠可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/FOXO1/Bim信號(hào)通路改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷［17］。β-谷甾醇是黃連、黃柏、梔子三味藥共有的活性成分，具有抗動(dòng)脈硬化、抗炎、抗氧化、抗高血脂、抗癌、抑制血小板聚集等作用［18］，還可以通過(guò)增加脂肪組織中胰島素受體和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的激活來(lái)增強(qiáng)血糖控制［19］。以上說(shuō)明黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM具有多成分的特點(diǎn)。

黃連解毒湯治療冠心病與T 2DM涉及多靶點(diǎn)，通過(guò)藥物-疾病核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖篩選，得到IL 6、TNF、CCL2、VEGFA、AR等9個(gè)核心靶點(diǎn)。脂肪組織分泌的炎性細(xì)胞因子，例如IL 6和TNF，可能發(fā)揮內(nèi)分泌作用，通過(guò)干擾胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)促進(jìn)胰島素抵抗，從而導(dǎo)致胰島素抵抗的臨床表現(xiàn)［20］；TNF及IL-6炎性因子在血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度表達(dá)，能夠能加血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞的數(shù)量，使血管內(nèi)皮增厚，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化［21］，因此抑制炎癥因子的激活能夠改善胰島素抵抗和延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）包含4個(gè)成 員，包 括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D［22］，通常所說(shuō)的VEGF指的是VEGF-A，VEGF-A能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生及維持血管、改善胰島素抵抗等作用［23］，在冠心病、炎癥性病變、糖尿病組織再生等病理生理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［24］。進(jìn)一步證實(shí)黃連解毒湯是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)治療冠心病和T 2DM。

黃連解毒湯“異病同治”冠心病和T 2DM的靶點(diǎn)GO生物過(guò)程涉及基因表達(dá)的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、胞外空間、細(xì)胞因子活性、類(lèi)固醇激素受體活性等生物過(guò)程，這些生物在黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM中起關(guān)鍵作用。通過(guò)KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，靶點(diǎn)主要富集在瘧疾、癌癥信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、胰島素抵抗等信號(hào)通路。HIF-1由亞基HIF-α和組成性亞基HIF-β組成的異二聚體結(jié)構(gòu)［25］，HIF-1信號(hào)通路在生物發(fā)育、代謝、貧血、損傷等病理生理過(guò)程發(fā)揮重要作用［26］，缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）是缺氧性損傷中發(fā)揮重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其下游靶基因涉及血管控制、血管新生、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞增殖和存活等過(guò)程［27］，能夠減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷；HIF-1α能夠調(diào)控下游功能基因的表達(dá)水平，介導(dǎo)器官和組織對(duì)微循環(huán)缺氧的應(yīng)答，從而參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［28］。研究表明［29］，PI3K-Akt信號(hào)通路的激活參與心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)；也有研究證明，PI3K/AKT信號(hào)通路參與了許多細(xì)胞進(jìn)程的調(diào)控，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞增殖及糖代謝等過(guò)程，其信號(hào)分子異?？梢砸鸸谛牟　⑻悄虿〖鞍┌Y等疾?。?0］。蘇莉等［31］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)活性對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠具有保護(hù)作用。PI3K/Akt信號(hào)通路同時(shí)也是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要通路之一，正常生理情況下，與受體結(jié)合后可以維持血糖平衡和脂類(lèi)代謝［32］，胰島素分泌不足時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路受到抑制，會(huì)促使胰島素抵抗，進(jìn)一步導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生［33］，因此激活PI3K/Akt信號(hào)通路可能有效緩解血糖、血脂和胰島素抵抗。提示PI3K/Akt信號(hào)通路可以雙向調(diào)控冠心病和糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。TNF信號(hào)通路可促使炎性細(xì)胞因子和TNF-α本身等基因的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［34］，TNF-α與胰島素抵抗有密切關(guān)系，機(jī)制可能與TNF-α通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)［35］。以上說(shuō)明黃連解毒湯“異病同治”冠心病和T 2DM的通路不是單一的，可以通過(guò)多通路、多途徑治療冠心病和T 2DM。

“異病同治”作為中醫(yī)基礎(chǔ)理論重要的指導(dǎo)原則，至今仍在臨床中廣泛應(yīng)用，但作用機(jī)制尚不明確［36］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新的研究策略和方法，為中藥復(fù)方“異病同治”的作用機(jī)制提供了新的思路。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)冠心病和T 2DM的共有信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)和糖脂代謝密切相關(guān)，這與目前冠心病與T 2DM的機(jī)制具有一致性。進(jìn)一步證實(shí)黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證黃連解毒湯治療冠心病和T 2DM的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路提供了理論基礎(chǔ)和理論依據(jù)。