■葛長榮 柳成東 程志斌

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201）

斷奶仔豬細(xì)菌性腹瀉致使生長遲滯、死亡率高，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失（Roussel等，2017；Barba-Vidal等，2018）。其中，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）破壞腸道菌群平衡、損傷腸道正常形態(tài)、引發(fā)炎癥反應(yīng)，對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)的危害最突出（Liu等，2018；Luise等，2019）。以往針對(duì)性應(yīng)用顯著抑制ETEC的多種飼用抗生素，能夠降低斷奶仔豬腹瀉，進(jìn)而改善生產(chǎn)性能（Xu等，2020；Wang等，2020a；Wang等，2020b）。然而，隨著我國飼料工業(yè)全面禁止促生長藥物飼料添加劑的使用（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告），研發(fā)替代抗生素新產(chǎn)品的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?、?shí)驗(yàn)技術(shù)及其效果成為行業(yè)焦點(diǎn)（Liu等，2018；Luise等，2019；柳成東等，2020a）。

飼用益生菌是一類用以維持動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡和改善動(dòng)物機(jī)體生理生化的功能性添加劑（Barba-Vidal等，2018；葛長榮等，2019；柳成東等，2020b）。大量科學(xué)試驗(yàn)表明（黃遵錫等，2017；Czech等，2018；Wang等，2019；黃遵錫等，2020；Tsukahara等，2020），養(yǎng)殖衛(wèi)生狀況良好的試驗(yàn)豬場，應(yīng)用益生菌替代飼用抗生素，斷奶仔豬獲得了良好的生長性能及生產(chǎn)效益。然而，放眼全球及我國，實(shí)際養(yǎng)豬業(yè)的衛(wèi)生狀況差異較大，以往基于環(huán)境衛(wèi)生控制良好的科學(xué)試驗(yàn)及報(bào)道是否能支撐益生菌在斷奶仔豬生產(chǎn)中的普遍應(yīng)用，值得采用更多的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀⒖刂撇町惢脑囼?yàn)條件，進(jìn)一步深入研究。本文綜述了經(jīng)典的ETEC感染試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮u(píng)估斷奶仔豬應(yīng)用益生菌的部分成果，以期為益生菌替代飼用抗生素的應(yīng)用提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 ETEC感染斷奶仔豬試驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h2>

通過口服適合劑量的ETEC K88、ETEC K99等典型毒株，模擬實(shí)際養(yǎng)殖衛(wèi)生較差的生產(chǎn)狀況，誘發(fā)斷奶仔豬嚴(yán)重腹瀉及生長遲滯，來構(gòu)建ETEC感染斷奶仔豬試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并用于益生菌等功能性添加劑的效果評(píng)估及機(jī)制研究（Liu等，2018；Luise等，2019）。為了保障試驗(yàn)數(shù)據(jù)的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和普遍性，成功構(gòu)建ETEC感染斷奶仔豬試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷年P(guān)鍵點(diǎn)包括（Liu等，2018；Luise等，2019）：①毒株的選擇與評(píng)估。ETEC感染試驗(yàn)所用毒株的類型（包括ETEC K88、ETEC K99）及毒力，需在仔豬口服試驗(yàn)之前進(jìn)行合理的實(shí)驗(yàn)室評(píng)估，以獲得仔豬致瀉的普遍性。②毒株的口服量。依據(jù)感染毒株類型、毒力及試驗(yàn)所選仔豬，確定適合的口服劑量，以獲得腹瀉的模型效果，且需要避免較高的死亡率。③試驗(yàn)仔豬的選擇。試驗(yàn)仔豬的品種、性別，斷奶日齡、體重，感染日齡、體重及持續(xù)感染時(shí)間等諸多因素，不僅影響模型的構(gòu)建，更加影響益生菌等功能性添加劑應(yīng)用的評(píng)估效果。

基于以上因素，表1匯總的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)聚焦ETEC感染對(duì)斷奶仔豬生長性能、腸道菌群、腸道形態(tài)和炎癥細(xì)胞因子的影響以及應(yīng)用益生菌的作用效果。

2 ETEC感染對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響及益生菌的作用效果

2.1 ETEC感染對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

首先，ETEC感染造成斷奶仔豬生長遲滯。表1匯總數(shù)據(jù)顯示，與不感染ETEC的對(duì)照組（Control group，C）相比，感染組（Challenged group，CH）仔豬平均日增重的下降幅度11.9%～30.7%（Wang等，2009；Lee等，2012）。Wang等（2009）對(duì)21日齡斷奶仔豬、感染2×109CFU/頭、持續(xù)感染10 d，發(fā)現(xiàn)CH組仔豬平均日增重比C組顯著降低11.9%。Lee等（2012）對(duì)34日齡斷奶仔豬、感染5×109CFU/頭、持續(xù)感染14 d，結(jié)果顯示CH組仔豬平均日增重比C組顯著降低30.7%。進(jìn)一步分析，Wang等（2009）和Lee等（2012）報(bào)道顯示：與C組相比，CH組仔豬平均日采食量的下降幅度9.5%～16.0%。因此，ETEC感染導(dǎo)致的采食量下降是仔豬生長遲滯的原因之一。

其次，ETEC感染造成斷奶仔豬料重比上升。表1匯總顯示，ETEC感染造成仔豬料重比的上升幅度1.6%～21.3%（Lee等，2012；Pan等，2017）。Pan等（2017）對(duì)30日齡斷奶仔豬、感染1×1010CFU/頭、持續(xù)感染3 d，結(jié)果顯示：與C組相比，CH組仔豬的料重比增加1.6%。Lee等（2012）報(bào)道，與C組相比，CH組仔豬的料重比顯著增加21.3%。此外，Pan等（2017）和Pu等（2018）報(bào)道，CH組仔豬腹瀉指數(shù)比C組增加了44.0～83.3百分點(diǎn)。

表1 ETEC感染對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響及益生菌的作用效果

上述結(jié)果及分析表明：口服ETEC不同程度地降低了采食量、增加了腹瀉發(fā)生概率，顯然均不利于仔豬對(duì)飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，這是ETEC感染仔豬生長性能低下的原因之一，且具體指標(biāo)的降低幅度由仔豬感染程度決定（Lee等，2012；Pan等，2017；Pu等，2018）。分析ETEC感染模型的條件表明，仔豬感染程度受到諸多因素影響，包括試驗(yàn)仔豬斷奶日齡和體重、感染日齡和體重、ETEC感染劑量和持續(xù)處理時(shí)間等（見表1）。

2.2 益生菌對(duì)ETEC感染斷奶仔豬生長性能的影響

表1匯總數(shù)據(jù)顯示：與C組相比，感染ETEC并使用益生菌的處理組（ETEC challenged and probiotics supplemented group，CH+P）仔豬平均日增重的變化幅度-2.0%～+20.8%（Lee等，2012；Pan等，2017）。Lee等（2012）通過持續(xù)感染14 d的ETEC模型研究顯示：與C組相比，使用單一益生菌植物乳桿菌的CH+P組仔豬平均日增重顯著增加20.8%。Pan等（2017）通過感染3 d的ETEC模型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與C組相比，使用復(fù)合益生菌的CH+P組仔豬的平均日增重只下降了2.0%，且統(tǒng)計(jì)差異不顯著。

與C組相比，CH+P組仔豬平均日采食量的變化幅度-5.6%～+12.7%（Wang等，2009；Che等，2017），料重比的變化幅度-9.6%～+0.7%（Lee等，2012；Che等，2017），且C組和CH+P組之間平均日采食量和料重比均差異不顯著。值得關(guān)注的是，Pan等（2017）和Pu等（2018）的報(bào)道顯示：益生菌顯著降低ETEC感染仔豬的腹瀉率，且單一使用抑菌性能較強(qiáng)的凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)改善仔豬腹瀉的效果優(yōu)于復(fù)合益生菌（地衣芽孢桿菌和釀酒酵母菌）（表1）。

分析以上ETEC感染模型的仔豬生長性能數(shù)據(jù)表明（表1）：ETEC感染仔豬的腹瀉增加以及采食量下降、料重比升高，是斷奶仔豬生長遲滯的關(guān)鍵原因。飼用益生菌通過降低腹瀉的發(fā)生而改善了仔豬增重，且這一改善效果受到益生菌種類、添加量及仔豬感染程度的影響。以上提示：益生菌在體內(nèi)、體外抑菌的作用及降低斷奶仔豬腹瀉的效果是未來研究的重點(diǎn)，這也凸顯本文綜述ETEC感染試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹匾裕↙iu等，2018；Luise等，2019）。

3 ETEC感染對(duì)斷奶仔豬腸道菌群的影響及益生菌的作用效果

3.1 ETEC感染對(duì)斷奶仔豬腸道菌群的影響

腸道菌群平衡是斷奶仔豬腸道健康及良好生長性能的重要保障（Pluske等，2018；Guevarra等，2019）。ETEC等致病性大腸桿菌是仔豬腸道的主要有害菌，不利于生長性能；乳酸桿菌和雙歧桿菌是仔豬腸道的優(yōu)勢有益菌，對(duì)保障斷奶仔豬腸道健康及良好生長性能具有重要意義。表2匯總數(shù)據(jù)顯示：①就大腸桿菌而言，與C組相比，CH組仔豬糞便中上升幅度400.0%～2 042.9%（Zhang等，2010；周棟，2015）；盲腸食糜中上升幅度99.5%～1 021.2%（Pan等，2017；Pu等，2018）；空腸食糜中上升約866.7%（Pu等，2018）；結(jié)腸食糜中上升幅度350.0%～408.0%（Che等，2017；徐琴，2017）。②就乳酸桿菌而言，與C組相比，CH組仔豬糞便中下降幅度75.0%～84.5%（Zhang等，2010；周棟，2015）；盲腸食糜中下降幅度80.0%～98.5%（Pan等，2017；Pu等，2018）；空腸食糜中下降約56.7%（Pu等，2018）；結(jié)腸食糜中下降幅度77.5%～87.5%（Che等，2017；徐琴，2017）。③就雙歧桿菌而言，與C組相比，CH組仔豬糞便中下降幅度67.5%～91.3%（Zhang等，2010；周棟，2015）；盲腸食糜中下降約27.7%（Pu等，2018）；空腸食糜中下降約11.4%（Pu等，2018）；結(jié)腸食糜中下降約20.7%（Che等，2017；徐琴，2017）。以上數(shù)據(jù)表明，ETEC感染仔豬的腸道菌群失衡，表現(xiàn)在有害菌大腸桿菌的數(shù)量上升、有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量下降，這是仔豬高腹瀉的關(guān)鍵原因。

表2 ETEC感染對(duì)斷奶仔豬腸道菌群的影響及益生菌的作用效果

3.2 益生菌對(duì)ETEC感染斷奶仔豬腸道菌群的影響

Pu等（2018）通過5 d的ETEC感染試驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C明，與對(duì)照組相比，飼糧添加1×106CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌顯著降低ETEC感染仔豬腸道食糜的大腸桿菌數(shù)量，同時(shí)顯著增加乳酸桿菌和雙歧桿菌。Che等（2017）通過3 d的ETEC感染模型發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，1×107CFU/g飼用酵母菌顯著降低ETEC感染仔豬腸道食糜的大腸桿菌數(shù)量，但對(duì)乳酸桿菌和雙歧桿菌沒有顯著作用效果。Pan等（2017）通過3 d的ETEC感染模型發(fā)現(xiàn)，飼糧添加9×106CFU/g復(fù)合益生菌（地衣芽孢桿菌和釀酒酵母菌）能恢復(fù)ETEC感染的仔豬腸道菌群至對(duì)照組正常的水平。上述報(bào)道表明：①總體而言，飼用益生菌具有進(jìn)一步優(yōu)化和（或）維持?jǐn)嗄套胸i腸道菌群的作用，且這一作用效果受益生菌種類、添加量及仔豬腸道菌群失衡程度的影響；②復(fù)合益生菌對(duì)維持或優(yōu)化腸道菌群的作用效果不一定優(yōu)于單一飼用益生菌，這顯然與益生菌的抑菌性能有關(guān)。據(jù)此，本課題組查找了有關(guān)凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌等抑菌性能評(píng)估的體外試驗(yàn)報(bào)道。

益生菌抑菌性能評(píng)估的體外試驗(yàn)常見方法包括：牛津杯法（Majeed等，2016；Fu等，2018）、最小抑菌濃度法（郭豐慶等，2020）、殺菌能力法（Pan等，2013）、平板劃線法（陳桂芳等，2018）等。大量牛津杯法體外抑菌實(shí)驗(yàn)報(bào)道顯示，凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)ETEC K88具有直接抑制作用，其抑菌效果達(dá)到“中度敏感”水平（汪攀等，2017；張韻等，2017）；國外少量體外抑菌實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)顯示，地衣芽孢桿菌對(duì)ETECK88的抑菌作用達(dá)到“中度敏感”或“低度敏感”水平（Wang等，2010；Shobharani等，2015）；目前，沒有酵母菌直接抑制ETEC效果的體外實(shí)驗(yàn)報(bào)道。有綜述認(rèn)為飼用酵母菌在畜禽腸道內(nèi)主要通過與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)和結(jié)合位點(diǎn)，間接實(shí)現(xiàn)腸道菌群的平衡（袁園等，2018；汪棋等，2020）。此外，Pothoulakis等（1993）體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酵母菌分泌的二種蛋白酶具有降解腸毒素的作用，這對(duì)飼用酵母菌平衡腸道菌群可能有積極作用。

綜合以上凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌3種益生菌體內(nèi)調(diào)控腸道菌群數(shù)據(jù)、體外抑菌作用的效果，提示復(fù)合益生菌的飼用效果不一定優(yōu)于單一益生菌。未來飼用益生菌應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)是明確單一益生菌的抑菌效果、揭示單一益生菌抑菌作用機(jī)制，隨后合理組合不同菌株及比例，達(dá)到協(xié)同抑制多種腸道有害菌的最佳效果。

4 ETEC感染對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響及益生菌的作用效果

4.1 ETEC感染對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

腸黏膜絨毛高度、隱窩深度是表征腸道形態(tài)的最直觀指標(biāo)（Ji等，2019；黃遵錫等，2020）。完整且較長的絨毛高度和適當(dāng)?shù)碾[窩深度有利于營養(yǎng)物質(zhì)的充分吸收；相反，腸黏膜上皮細(xì)胞被破損會(huì)顯著降低絨毛高度，且增加隱窩深度，這是隱窩干細(xì)胞增殖、增生對(duì)腸絨毛上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)作用（Chen等，2019；Ji等，2019）。表3匯總數(shù)據(jù)顯示：與C組相比，CH組仔豬空腸絨毛高度的下降幅度11.7%～26.0%（Che等，2017；Pan等，2017）；回腸絨毛高度的下降幅度11.0%～34.3%（Che等，2017；Pan等，2017）；然而，隱窩深度的變化，兩組之間未達(dá)到統(tǒng)計(jì)差異的水平。由此可見，ETEC感染仔豬模型條件下，腸道損傷最直觀的表現(xiàn)是小腸絨毛高度的顯著降低。由于小腸絨毛上皮細(xì)胞主要功能之一是營養(yǎng)的消化與吸收，顯然小腸絨毛降低不利于營養(yǎng)消化與吸收，這也是ETEC感染仔豬生長遲滯的主要原因之一。

表3 ETEC感染對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響及益生菌的作用效果

4.2 益生菌對(duì)ETEC感染斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

Che等（2017）通過高劑量1×1011CFU/頭的ETEC感染模型發(fā)現(xiàn)，與C組相比，飼糧添加1×107CFU/g酵母菌的CH+P組仔豬空腸絨毛高度顯著降低17.3%、回腸絨毛高度顯著降低20.3%。Barba-Vidal等（2017）通過低劑量3×1010CFU/頭的ETEC感染模型發(fā)現(xiàn)，與C組相比，使用8×106CFU/g長雙歧桿菌的CH+P組仔豬回腸絨毛高度降低11.5%，但兩組之間統(tǒng)計(jì)差異不顯著。Pan等（2017）采用更低劑量1×1010CFU/頭的ETEC感染模型發(fā)現(xiàn)，與C組相比，飼糧添加9×106CFU/g復(fù)合益生菌的CH+P組仔豬空腸絨毛高度降低1.6%、回腸絨毛高度降低2.7%，且兩組之間空腸和回腸的絨毛高度數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)差異均不顯著。以上結(jié)果表明：飼用益生菌一定程度上恢復(fù)了ETEC感染仔豬的損傷腸道，且這一作用效果受到ETEC攻毒劑量造成的腸損傷程度影響。

5 ETEC感染對(duì)斷奶仔豬炎癥細(xì)胞因子的影響及益生菌的作用效果

5.1 ETEC感染對(duì)斷奶仔豬血清炎癥細(xì)胞因子的影響

炎癥細(xì)胞因子是表征仔豬感染程度及免疫保護(hù)的一類重要指標(biāo)，炎癥細(xì)胞因子一般可分成二類，即促炎因子和抗炎因子（Tanaka等，2018；Ouyang等，2019；王乙茹等，2020）。表4匯總了ETEC感染仔豬試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭醒撼Ｒ?guī)檢測的TNF-α、IL-6、INF-γ等促炎因子和IL-10抗炎因子的濃度，結(jié)果顯示：①就促炎因子TNF-α而言，與C組相比，CH組仔豬血液中濃度的上升幅度28.6%～159.9%（Wang等，2009；周棟，2015）；②就促炎因子IL-6而言，與C組相比，CH組仔豬血液中濃度的上升幅度17.4%～83.0%（Zhang等，2010；Lee等，2012）；③就促炎因子INF-γ而言，與C組相比，CH組仔豬血液中濃度的上升幅度81.7%～82.0%（Wang等，2009；Lee等，2012）；④與C組相比，CH組仔豬血液中IL-10抗炎因子濃度下降17.4%（周棟，2015）。以上數(shù)據(jù)表明：血液炎癥細(xì)胞因子可以反映ETEC及所產(chǎn)腸毒素造成的斷奶仔豬炎癥反應(yīng)，且炎癥反應(yīng)程度受到試驗(yàn)仔豬感染日齡和體重、ETEC處理劑量和持續(xù)時(shí)間等因素影響。

5.2 益生菌對(duì)ETEC感染斷奶仔豬血清炎癥細(xì)胞因子的影響

進(jìn)一步分析表4數(shù)據(jù)顯示：除了Wang等（2009）的報(bào)道，與C組相比，應(yīng)用各類益生菌的CH+P組仔豬血液TNF-α濃度的變化幅度-7.9%～+50.0%（Zhang等，2010；周棟，2015），與CH組仔豬TNF-α變化幅度28.6%～159.9%相比較，有了較大程度的緩解作用；且促炎因子IL-6和INF-γ也顯示相似的規(guī)律。以上結(jié)果提示，益生菌對(duì)ETEC感染仔豬的炎癥反應(yīng)有一定緩解作用。

表4 ETEC感染對(duì)斷奶仔豬血清炎癥細(xì)胞因子含量的影響及益生菌的作用效果

由于益生菌的種類繁多、代謝產(chǎn)物復(fù)雜，因此不同種屬的益生菌對(duì)炎癥細(xì)胞因子的緩解效果及機(jī)制有較大差異，表4匯總數(shù)據(jù)也證明了這一點(diǎn)觀點(diǎn)?，F(xiàn)有的綜述文獻(xiàn)表明（Vieco-Saiz等，2019；付一鳴等，2019），益生菌對(duì)ETEC感染仔豬炎癥細(xì)胞因子的影響及緩解機(jī)制包括：①益生菌與外源腸道有害菌的競爭定植機(jī)制；②益生菌對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制；③益生菌代謝產(chǎn)物對(duì)腸毒素的清除機(jī)制；④益生菌及代謝產(chǎn)物激活腸黏膜組織細(xì)胞的抗炎機(jī)制。尤其需要關(guān)注的是，單一益生菌（例如：丁酸梭菌）可能具備以上一種或多種機(jī)制，影響炎癥細(xì)胞因子表達(dá)而緩解ETEC感染仔豬的炎癥反應(yīng)（王騰浩，2015）。因此，合理地將多個(gè)益生菌復(fù)配可能獲得更好的抗炎促生長效果（周棟，2015），誠然這需要更加深入細(xì)致的研究。

6 小結(jié)

鑒于實(shí)際養(yǎng)豬生產(chǎn)差異化的衛(wèi)生狀況，在禁抗的全球行業(yè)發(fā)展趨勢下，本文綜述了ETEC感染試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮u(píng)估斷奶仔豬應(yīng)用益生菌的部分成果。ETEC感染處理顯著降低斷奶仔豬生長性能、破壞腸道菌群平衡、損傷腸道組織形態(tài)、引發(fā)炎癥反應(yīng)；應(yīng)用益生菌通過平衡腸道菌群、維持腸道形態(tài)、緩解炎癥反應(yīng)等作用，一定程度上改善了ETEC感染仔豬的生長性能。本文為益生菌在實(shí)際養(yǎng)豬生產(chǎn)中的評(píng)估與應(yīng)用，提供了更多的思路。