■張倩雲(yún) 王鵬飛 從光雷 施壽榮 譚本杰*

（1.廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧 530004；2.中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，江蘇揚州 225125；3.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇揚州 225009）

凌云烏雞產(chǎn)于廣西凌云縣，因其肉質(zhì)細嫩甘甜、味鮮、氣味香濃，黑色素含量較高而著稱。然而廣西地處亞熱帶，夏、秋兩季養(yǎng)殖生產(chǎn)中雞處于熱應(yīng)激的情況較常見，熱應(yīng)激會影響黑色素生成通路α-MSHMC1R-cAMP-TRP中相關(guān)基因的表達，從而使生成的黑色素減少。硒是動物生長代謝與繁殖必需的微量元素，在體內(nèi)主要發(fā)揮抗氧化、緩解應(yīng)激、保護生物膜結(jié)構(gòu)的功能。黎觀紅等[1]在泰和烏骨雞的基礎(chǔ)日糧中分別添加0、0.10、0.30、0.50、0.70 mg/kg和0.90 mg/kg硒，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)當添加濃度不超過0.90 mg/kg時，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性與硒添加水平呈正相關(guān)；李衛(wèi)春[2]發(fā)現(xiàn)日糧添加硒能顯著提高肉雞血漿中GSH-Px、超氧化物歧化酶（SOD）活性及過氧化氫酶（CAT）的活性。張華杰等[3]研究結(jié)果也表明酵母硒能顯著提高血清SOD、GSH-Px活性及總抗氧化能力（T-AOC）。此外，大量研究還發(fā)現(xiàn)，硒可以影響動物體液免疫與細胞免疫的功能[4]。硒缺乏會導(dǎo)致動物機體的免疫抑制，容易受外部環(huán)境影響，使機體抗感染能力減弱。李峰等[5]研究結(jié)果表明，在肉雞基礎(chǔ)日糧添加0.2 mg/kg或0.3 mg/kg酵母硒，其21日齡的胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)顯著高于基礎(chǔ)日糧組，即酵母硒可促進肉雞免疫器官的早期發(fā)育，從而增強免疫能力。在我國的中醫(yī)藥和飲食文化中，有“逢黑必補”的說法，烏骨雞主要的滋補藥用價值是其體內(nèi)的黑色素。酪氨酸是黑色素合成的前體物質(zhì)，在動物體內(nèi)，酪氨酸在酪氨酸酶的催化下，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生物過程合成黑色素。酪氨酸酶是黑色素合成過程中主要的限速酶，是一種銅結(jié)合金屬酶，在黑色素三個重要的合成步驟中發(fā)揮特征性催化作用[6]。硒可以緩解熱應(yīng)激，提高在熱應(yīng)激條件下黑色素的合成。然而關(guān)于日糧酪氨酸水平和硒水平對烏骨雞免疫性能、酶活性及組織黑色素合成影響的研究報道不多，因此研究日糧酪氨酸水平和硒水平以及它們的交互作用對烏雞免疫性能、酶活性及組織黑色素含量的影響，對烏雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。本研究的目的是通過探究硒與酪氨酸的添加水平對13～20周齡凌云烏雞黑色素含量及其相關(guān)酶活性的影響，確定凌云烏雞日糧中酪氨酸與硒的最適添加量，為利用營養(yǎng)調(diào)控手段提高凌云烏雞藥用價值提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗在廣西凌云縣瑞東農(nóng)牧有限公司開展，試驗周期為13周齡至20周齡。試驗采用雙因素交叉設(shè)計分組，日糧硒（購買于安琪酵母股份有限公司，硒濃度為2 000 mg/kg）添加水平為0、0.2、0.3、0.4 mg/kg，酪氨酸（購買于江西百盈生物技術(shù)有限公司，純度為99%）添加水平為0、0.2%、0.4%、0.6%，選取13周齡體重差異不顯著、體況良好的凌云烏雞576只，隨機分為16組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)12只雞，試驗1組為對照組，試驗分組見表1。

表1 試驗設(shè)計及分組

1.2 飼養(yǎng)管理

采用玉米-豆粕-魚粉型日糧，基礎(chǔ)日糧為粉料，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。試驗烏雞均在同一雞舍，試驗之前對籠舍進行全面消毒，采用3層階梯式雞籠，獨立乳頭式飲水器，自由飲水，每天8:00和15:00進行飼喂，定期對雞舍打掃、消毒，保持雞舍環(huán)境干凈衛(wèi)生，其他飼養(yǎng)管理辦法按該公司日常飼養(yǎng)管理章程進行。

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎(chǔ)）

1.3 檢測指標

1.3.1 血液樣品采集與制備

在20周齡末，每個重復(fù)選取1只體況相近的凌云烏雞，禁食12 h，翅靜脈采血5 mL，3 500 r/min離心10 min，將血清分離，做好標簽后放入-20℃冰箱備用保存。

1.3.2 組織樣品采集與制備

在20周齡末，血液采集完成后，在屠宰試驗的過程中，取肝臟、肌肉、皮膚樣品，剝離上面附著的結(jié)締組織，每個組織樣品采集5 g左右，放入提前做好標簽的離心管中，放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ谶M行指標測定時，剪取組織樣品1 g左右，于冰冷生理鹽水中漂洗清除血液，用濾紙吸干水分后精確稱重，用移液槍在燒杯中加入9倍重量的預(yù)冷生理鹽水，將精確稱重后的組織塊轉(zhuǎn)移至燒杯中快速剪碎，再用組織勻漿機研磨為10%的組織勻漿，將組織勻漿用低溫離心機(2 000 r/min)離心10 min，取上清棄沉淀，轉(zhuǎn)移到提前做好標簽的預(yù)冷離心管中，放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血清與組織酪氨酸酶活性測定

采用多巴色素法測定血清與組織中酪氨酸酶活性，將0.5 mL的L-多巴（5 mmol/L）溶液加入5 mL的離心管中，然后加入2.4 mL磷酸緩沖液，濃度為0.1 mol/L，在37℃恒溫箱中孵育10 min后，用移液槍移取0.1 mL血清或組織勻漿液至離心管中振蕩混勻，立刻用分光光度計測定475 nm波長下的吸光度值（A475），連續(xù)讀數(shù)5 min并記錄。以A475每分鐘增加或減少0.001為一個酶活力單位。

1.3.4 血液與組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性測定

采用5,5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸（DTNB）法測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.5 組織黑色素含量測定

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），通過抗原抗體特異性結(jié)合、底物顯色，用酶標儀測得450 nm波長下的吸光度值，制作標準曲線，計算樣品濃度。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，試劑盒購于赫澎（上海）生物科技有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)先用Excel進行初步處理，之后采用SPSS 23.0對處理過的數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，互作效應(yīng)顯著時再采用單因素方差分析以判斷雙因素之間具體的互作表現(xiàn)。用Duncan's法做平均數(shù)的顯著性差異分析，以“平均數(shù)±標準差”來表示處理結(jié)果，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧硒與酪氨酸添加水平對凌云烏雞血清免疫活性指標的影響(見表3)

表3 日糧硒與酪氨酸添加水平對凌云烏雞血清免疫活性指標的影響

由表3分析可知，與對照組相比，處理組對凌云烏雞血清中IgM濃度無顯著影響（P＞0.05），試驗10組使凌云烏雞血清中IgG濃度顯著提高（P＜0.05），試驗8組顯著提高了血清中IgA的濃度（P＜0.05）。硒添加組、酪氨酸添加組，對凌云烏雞血清中免疫活性指標均無顯著影響（P＞0.05），且硒與酪氨酸也不存在互作效應(yīng)（P＞0.05）。但是從整體看，日糧添加硒與酪氨酸對凌云烏雞血清中IgG、IgA的濃度有所提高。

2.2 日糧硒與酪氨酸添加水平對血清和組織中GSH-Px及TYR活性的影響(見表4、表5)

由表4可知，添加不同水平的硒與酪氨酸對凌云烏雞血清與組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性有不同程度的影響。血清中第11組效果最顯著（P＜0.05），肌肉中以第8組效果最顯著（P＜0.05），皮膚中以第9組效果最顯著（P＜0.05），肝臟中第10組效果最顯著（P＜0.05）。硒添加組能使血清與組織中GSH-Px的活性顯著升高（P＜0.05），但是與添加水平相關(guān)，高水平硒組，其酶活性低于低水平組；酪氨酸添加組對血清中GSH-Px的活性有顯著升高的作用（P＜0.05），對組織中GSH-Px的活性無顯著影響（P＞0.05）；硒與酪氨酸對血清與組織中GSH-Px的活性無互作效應(yīng)（P＞0.05）。

表4 日糧硒與酪氨酸添加水平對凌云烏雞血清與組織中GSH-Px活性的影響

由表5分析可知，日糧添加不同水平硒與酪氨酸對凌云烏雞血清、肝臟、皮膚中酪氨酸酶（TYR）的活性有不同程度的影響。血清中以第15組效果最顯著（P＜0.05）；肝臟中第9組效果最顯著（P＜0.05），但是第16組顯著低于對照組（P＜0.05）；皮膚中第12組效果最顯著（P＜0.05）。硒添加組對凌云烏雞血清和組織中TYR活性無顯著影響（P＞0.05）；酪氨酸添加組能顯著提高血清與皮膚中TYR活性（P＜0.05）；硒與酪氨酸對血清、肝臟和皮膚中TYR活性存在互作效應(yīng)，并顯著提高血清和肝臟、皮膚TYR活性（P＜0.05），隨著添加水平增高，其活性會有所下降。

表5 日糧硒與酪氨酸添加水平對凌云烏雞血清與組織中TYR活性的影響

2.3 日糧硒與酪氨酸添加水平對血清和組織中黑色素含量的影響(見表6)

由表6分析可知，日糧添加不同水平硒與酪氨酸對凌云烏雞肌肉、肝臟、皮膚中黑色素含量有不同程度影響。與對照組相比，肌肉中第5組黑色素含量最高（P＜0.05），肝臟中黑色素含量最高的組為第2組（P＜0.05），皮膚中第9組黑色素含量最高（P＜0.05）。硒添加組顯著提高了凌云烏雞皮膚中黑色素含量（P＜0.05）；酪氨酸添加組顯著提高了肌肉中黑色素含量（P＜0.05）；硒與酪氨酸對肌肉、肝臟和皮膚中黑色素的含量的影響存在互作效應(yīng)（P＜0.05），能夠顯著提高凌云烏雞肌肉、肝臟和皮膚中黑色素含量。

表6 日糧硒與酪氨酸添加水平對凌云烏雞組織中黑色素含量的影響

3 討論

3.1 日糧硒與酪氨酸添加水平對凌云烏雞免疫活性指標的影響

IgA、IgM和IgG是血清免疫球蛋白中最重要的3類，IgA主要參與機體黏膜表面的體液免疫應(yīng)答，IgM是初次免疫應(yīng)答中最早產(chǎn)生的免疫球蛋白，IgG是自然感染和人工主動免疫后機體產(chǎn)生的主要抗體[7]。張立恒[8]發(fā)現(xiàn)日糧酪氨酸與苯丙氨酸的水平對絲毛烏骨雞的機體蛋白代謝與免疫功能無顯著影響。楊清麗等[9]發(fā)現(xiàn)，日糧添加硒可以顯著提高產(chǎn)蛋雞血清中總蛋白、白蛋白和IgA、IgM的含量。Cai等[10]對1日齡的肉雞研究時發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.3 mg/kg納米硒，飼喂21 d時各試驗組血清IgG、IgM、IgA含量均無顯著提高，然而飼喂42 d后能顯著提高血清IgG、IgM的含量，并且0.5 mg/kg納米硒組血清IgG、IgM的含量顯著低0.3 mg/kg納米硒組。本試驗結(jié)果表明，日糧中單獨添加硒或單獨添加酪氨酸都不會對血清免疫球蛋白產(chǎn)生影響。與對照組相比，10組對血清中IgG的含量有顯著提高作用，10組日糧硒與酪氨酸添加水平為0.2 mg/kg、0.6%，8組對血清中IgA的含量有顯著提高作用，8組日糧硒與酪氨酸添加水平為0.2 mg/kg和0.2%。由此可知，硒和酪氨酸存在互作效應(yīng)，說明硒提高家禽的免疫功能還跟酪氨酸的含量有關(guān)，本研究結(jié)果表明，單獨添加硒或酪氨酸都不能提高雞的免疫功能。

3.2 酪氨酸與硒添加水平對組織相關(guān)酶活性的影響

谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心是硒半胱氨酸，硒是GSH-Px的必需成分，GSH-Px活力也可以作為衡量機體硒水平的一項指標。硒可以通過作用于GSH-Px來發(fā)揮抗氧化作用，保護動物機體細胞的完整并維持功能正常[11]。張增源[12]的研究結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧中添加0.2 mg/kg和0.3 mg/kg的酵母硒對血清中GSH-Px的活性有顯著提高作用，且酵母硒使用效果比亞硒酸鈉更顯著。Surai[13]發(fā)現(xiàn)富含硒蛋孵化雛雞時，肝臟GSH-Px的活性不僅在孵化時較高，而且在孵化后5 d也比普通蛋所孵化的雛雞高。陳國順等[14]在不同硒源對肉雞抗氧化能力的研究中發(fā)現(xiàn)，酵母硒能顯著提高肉雞肝臟和血清中GSH-Px的活性。硒與日糧中的營養(yǎng)元素可能會發(fā)生互作效應(yīng)，鄭嫩珠等[15]對半番鴨的研究發(fā)現(xiàn)，酵母硒與黃芪多糖組合能顯著提高半番鴨肌肉中GSH-Px的活性。孫春陽等[16]研究發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖氧化酶和酵母硒為主要成分的復(fù)合添加劑，使21日齡和42日齡肉雞血清GSH-Px的活性分別顯著提高了8.9%、12.3%。據(jù)王興華等[17]報道，在日糧中添加0.8 mg/kg的硒能顯著提高白羽肉雞血清和肝臟中GSH-Px的活性。硒的抗氧化作用非常大，因此硒的添加量要適量適度，動物攝入過量硒會對機體產(chǎn)生毒害作用，抑制其抗氧化功能。本試驗結(jié)果表明，日糧中添加硒能顯著提高凌云烏雞血清、肝臟、肌肉和皮膚中GSH-Px的活性；添加酪氨酸顯著提高了血清中GSH-Px的活性，硒與酪氨酸對凌云烏雞血清和組織中GSH-Px的活性無互作效應(yīng)。

酪氨酸是黑色素合成的前體物質(zhì)，在動物體內(nèi)酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生物過程合成。酪氨酸酶是黑色素合成過程中主要的限速酶，是一種銅結(jié)合金屬酶，在黑色素三個重要的合成步驟中發(fā)揮特征性催化作用[6]。趙艷平等[18]在對1～12周齡的泰和烏骨雞研究中發(fā)現(xiàn)，在三個生長階段分別提供1.18%、0.88%和1.25%水平的酪氨酸，能顯著提高烏骨雞血清酪氨酸酶的活性。王蘭梅等[19]發(fā)現(xiàn)，飼喂馬來西亞紅羅非魚0.5%、1%、2%三個酪氨酸水平的餌料，酪氨酸水平為2%組皮膚與血清中酪氨酸酶的活性顯著高于0.5%組。黃燕等[20]研究結(jié)果表明，日糧添加硒能顯著提高烏蒙烏雞皮膚、肌肉、肝和腎中酪氨酸酶的活性。據(jù)黎觀紅等[1]報道，日糧適量添加硒，能夠提高泰和烏骨雞血清及組織酪氨酸酶的活性。許蘭嬌[21]發(fā)現(xiàn)日糧添加硒能夠在一定程度上提高熱應(yīng)激狀態(tài)下泰和烏骨雞組織酪氨酸酶的活性。也有報道稱日糧的銅添加水平對酪氨酸酶的活性產(chǎn)生影響[22-23]。本試驗結(jié)果表明，日糧添加硒對凌云烏雞血清中酪氨酸酶的活性有提高趨勢，添加酪氨酸能顯著提高血清與皮膚中的酪氨酸酶的活性，硒與酪氨酸對凌云烏雞血清、肝臟和皮膚存在互作效應(yīng)。

3.3 酪氨酸與硒添加水平對組織黑色素含量的影響

黑色素具有清除自由基抗氧化、防輻射防誘變、抗衰老、富集微量金屬元素等生物功能[24]。烏骨雞與普通肉雞的最大區(qū)別在于烏骨雞體內(nèi)含有大量的黑色素，烏骨雞在入藥或作為滋補品時，黑色素含量是評價藥用或滋補功效的重要指標。黑色素合成的底物是酪氨酸，因此當烏骨雞合成大量的黑色素時，日糧的酪氨酸供應(yīng)量需要滿足其需求。大量研究表明，動物機體維持氧化/抗氧化平衡對黑色素合成具有重要意義，動物熱應(yīng)激會使機體內(nèi)部氧化代謝增加，造成過氧化物增加，打破機體內(nèi)部氧化/抗氧化平衡，破壞細胞的膜結(jié)構(gòu)[25]。同時，熱應(yīng)激會影響黑色素生成通路α-MSH-MC1R-cAMP-TRP相關(guān)基因的表達，從而影響黑色素的生成[21]。硒最重要的生物功能就是抗氧化功能，消除過多自由基，從而保護生物體的膜結(jié)構(gòu)與功能，可以緩解因熱應(yīng)激而造成的黑色素合成減少。黎觀紅等[26]發(fā)現(xiàn)日糧酪氨酸添加量在一定范圍內(nèi)可以提高泰和烏骨雞組織黑色素含量。Watson等[27]發(fā)現(xiàn)在犬類的日糧中提高酪氨酸+苯丙氨酸的比例，其毛色會因黑色素沉積而呈現(xiàn)黑色。據(jù)Wang等[28]報道，提高餌料中酪氨酸含量會導(dǎo)致羅非魚腹部與背部皮膚黑色素含量的提高。趙艷平等[29-30]對1～4、9～12周齡泰和烏骨雞研究發(fā)現(xiàn)，日糧酪氨酸水平在0.98%～1.25%時，可以顯著提高烏骨雞肌肉、肝臟、心臟、皮膚中黑色素含量。張竹英[31]對泰和烏骨雞進行急性熱暴露研究黑色素含量變化，研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激條件下12 h和24 h，能降低組織抗氧化能力，并且組織黑色素含量有下降的趨勢。許蘭嬌[21]發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加0.3、0.5、0.7 mg/kg硒，可以提高熱應(yīng)激條件下泰和烏骨雞組織黑色素含量。熊小文等[32-33]對5～8、9～12周齡泰和烏骨雞研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加0.3～0.5 mg/kg的硒，可以提高烏骨雞組織黑色素含量。有學者報道，動物組織中硒含量與黑色素含量有一定關(guān)系[34]。本試驗結(jié)果表明，日糧添加硒與酪氨酸能夠提高凌云烏雞組織黑色素含量，且硒與酪氨酸對組織黑色素含量存在互作效應(yīng)。綜合肌肉、肝臟、皮膚黑色素含量分析，試驗9組即當日糧硒與酪氨酸添加量為0.2 mg/kg和0.4%時，凌云烏雞組織黑色素含量相對較高。硒與酪氨酸添加量過高時，凌云烏雞組織黑色素含量減少，這在互作組表現(xiàn)尤為明顯，這可能是硒與酪氨酸添加過量抑制黑色素的生成，或是高水平的硒與酪氨酸互作效應(yīng)能抑制凌云烏雞黑色素生成。

4 結(jié)論

日糧添加硒與酪氨酸在一定程度上可以增強凌云烏雞的免疫力，提高凌云烏雞血清與組織谷胱甘肽過氧化物酶、酪氨酸酶的活性，并提高組織黑色素的含量。綜合谷胱甘肽過氧化物酶、酪氨酸酶的活性及對黑色素的含量分析，基礎(chǔ)日糧中單獨添加0.2 mg/kg硒或者單獨添加0.6%的酪氨酸的效果最好。硒與酪氨酸交互作用得到基礎(chǔ)日糧中添加0.2 mg/kg和0.4%的硒與酪氨酸時效果最好。綜合上述指標分析，當日糧硒與酪氨酸的水平為0.4 mg/kg和0.98%時，可以提高作為烏雞藥用價值重要指標之一黑色素的含量。