易 婷，曹秋娥，李 菲

(云南大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650500)

補(bǔ)骨脂（Psoralea Fructus）是傳統(tǒng)中藥，屬豆科補(bǔ)骨脂植物，又名破故紙、胡韭子等，表面呈黑色或棕褐色，主要生長在山坡、溪邊等地，具有補(bǔ)腎壯陽、溫脾止瀉的功效，此外還有抗腫瘤[1-2]、抗抑郁[3]等作用，外用主要用來治療白癜風(fēng)等皮膚病[3].因此，對補(bǔ)骨脂中各活性成分研究的分析檢測具有重要意義.目前已有近百種成分從補(bǔ)骨脂中分離得到，包括香豆素類、黃酮類、苯并呋喃類和單萜酚類等類型的化合物，其中香豆素類和黃酮類化合物的代表物質(zhì)為補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素和補(bǔ)骨脂乙素等.

目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道對補(bǔ)骨脂中的香豆素和黃酮類成分進(jìn)行分離分析研究，主要包括高效液相色譜法[4-7]、薄層色譜法[8]和高效毛細(xì)管電泳法[9-10]，但已報(bào)道的方法都沒有對補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂定和補(bǔ)骨脂寧這5種活性成分進(jìn)行同時(shí)分離檢測的報(bào)道.毛細(xì)管電泳具有操作簡單、分離效率高、樣品用量少、維護(hù)運(yùn)行成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此本文采用毛細(xì)管電泳法，建立了一個(gè)能同時(shí)分離檢測這5 種活性成分的毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜新方法，優(yōu)化了緩沖溶液和儀器條件，在23 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)5 種活性成分的有效分離和準(zhǔn)確檢測，可用于補(bǔ)骨脂藥材及其復(fù)方制劑中這5種 活性成分的分析檢測.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和材料P/ACETMMDQ 型高效毛細(xì)管電泳儀配有DAD 檢測器（Sciex，美國）；未涂層石英毛細(xì)管，57 cm×?75 μm，有效長度50 cm（河北省永年銳灃色譜器件有限公司）；pHS-2C 型pH 計(jì)（上海雷磁儀器廠）.

藥材補(bǔ)骨脂經(jīng)云南大學(xué)生科院陸樹剛鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifoliaL.）的干燥成熟果實(shí)，魚鰾補(bǔ)腎丸（成分：魚鰾膠、枸杞子、蓮須、肉蓯蓉、巴戟天、杜仲、當(dāng)歸、菟絲子、補(bǔ)骨脂、茯苓、淫羊藿、肉桂、沙苑子、牛膝、附片）和復(fù)方補(bǔ)骨脂顆粒（主要成分：補(bǔ)骨脂、鎖陽、續(xù)斷、狗脊、赤芍、黃精）購于云南昆明福林堂藥店；甲醇、乙腈、硼砂、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司）；補(bǔ)骨脂素（Psoralin，批號zl20150122）、補(bǔ)骨脂甲素（Coryfolin，批號zl20150312）、補(bǔ)骨脂乙素（Corylifolinin，批號zl20150411）、補(bǔ)骨脂定（Psoralidin，批號zl20150318）和補(bǔ)骨脂寧（Corylin，批號zl20150228）標(biāo)準(zhǔn)品（結(jié)構(gòu)式見圖1，購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；超純 水（優(yōu)普）.

圖1 5 種待測組分的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of five investigated compounds

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL 的補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂定和補(bǔ)骨脂寧標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液由甲醇配制，不同質(zhì)量濃度的標(biāo) 準(zhǔn)品工作溶液均由儲(chǔ)備液用甲醇稀釋得到.

1.2.2 樣品溶液 于90 ℃真空干燥箱中烘干補(bǔ)骨脂藥材、魚鰾補(bǔ)腎丸和復(fù)方補(bǔ)骨脂顆粒，分別準(zhǔn)確稱取約1.000 0 g 烘干后的樣品置于250 mL 錐形瓶，加入50 mL 體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液，59 kHZ 超聲提取60 min，過濾，以體積比為50%的甲醇溶液洗滌殘?jiān)? 次，合并濾液和洗滌液，減壓蒸 干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?5 mL.

1.2.3 運(yùn)行緩沖溶液 以20 mmol/L Na2B4O7（用NaOH 調(diào)節(jié)pH 9.31）為緩沖溶液，加入體積分?jǐn)?shù)為25%乙腈和25 mmol/LSDS 為添加劑.

以上溶液在使用前均用0.45 μm 微膜過濾處理；除運(yùn)行緩沖溶液外，其余溶液均置于4 ℃冰箱中 避光保存.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法以20 mmol/L Na2B4O7（用NaOH調(diào)節(jié)pH 9.31）為緩沖溶液，加入體積分?jǐn)?shù)為25%乙腈和25 mmol/L SDS 為添加劑.儀器條件為：分離電壓20 kV，毛細(xì)管柱溫25 ℃，5 s 壓力進(jìn)樣（3.448 kPa），檢測波長300 nm.

儀器開機(jī)和重復(fù)運(yùn)行之間，用0.1 mol/L 的NaOH 溶液、純水和緩沖溶液依次沖洗毛細(xì)管柱4、3 min 和4 min.

2 結(jié)果與討論

2.1 運(yùn)行緩沖溶液的pH 值及濃度對分離的影響由圖1 中5 種目標(biāo)組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)可知，除補(bǔ)骨脂素外，其他4 種目標(biāo)組分都含有酚羥基，在堿性介質(zhì)中容易電離而帶上負(fù)電荷.因此，實(shí)驗(yàn)選擇了在堿性介質(zhì)中進(jìn)行電泳分離測定，在pH 值介于8.26～11.06，Na2B4O7濃度在15～35 mmol/L 的范圍內(nèi)研究了Na2B4O7（用NaOH 調(diào)節(jié)pH）緩沖溶液的pH 和濃度對待測組分分離的影響（圖2）.結(jié)果表明，pH 值和硼砂濃度越高，各組分的遷移時(shí)間逐漸增加.當(dāng)pH 低于9.64 時(shí)，補(bǔ)骨脂甲素和補(bǔ)骨脂寧的電泳峰完全重疊在一起；當(dāng)pH≥10.26 時(shí)，除補(bǔ)骨脂素外，其他4 種目標(biāo)組分都實(shí)現(xiàn)了基線分離.當(dāng)pH 達(dá)到11.06 時(shí)，除補(bǔ)骨脂素外的4 種組分都實(shí)現(xiàn)了有效分離與檢測.但此條件下由于pH 過高導(dǎo)致電流過大，測定時(shí)容易斷流，不利于分析檢測的重現(xiàn).所以，為了提高分離度，縮短分離時(shí)間，并改善基線噪音，實(shí)驗(yàn)選擇以20 mmol/L 的Na2B4O7（用NaOH 調(diào)節(jié)pH=9.31）作為運(yùn)行的緩沖溶液.

圖2 緩沖溶液pH 值對各組分遷移時(shí)間的影響Fig.2 Effect of buffer solution pH on migration time of investigated compounds

圖3 是在濃度為20 mmol/L 的Na2B4O7（用NaOH 調(diào)節(jié)pH 9.31）緩沖溶液中5 種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的電泳圖.可以看出，補(bǔ)骨脂甲素和補(bǔ)骨脂寧的電泳峰此條件下完全重合，并且甲醇和補(bǔ)骨脂素的 電泳峰也沒有得到有效分離.

圖3 濃 度 為20 mmol/L 的Na2B4O7（用NaOH 調(diào) 節(jié)pH 9.31）緩沖溶液中5 種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的電泳譜圖Fig.3 Electropherogram of the standard mixed solution in Na2B4O7（20 mmol/L）buffer solution（adjust pH to 9.31 with NaOH）

2.2 乙腈對分離的影響在濃度為20 mmol/L 的Na2B4O7（用NaOH 調(diào)節(jié)pH 9.31）中，補(bǔ)骨脂甲素和補(bǔ)骨脂寧的電泳峰完全重合，并且甲醇和補(bǔ)骨脂素電泳峰也重合在一起（圖3）.為了改善各組分間的分離，首先在運(yùn)行緩沖溶液中加入乙腈作添加劑，在乙腈體積分?jǐn)?shù)位于10%～30%的范圍內(nèi)，研究了對各組分分離度的改善情況（圖4）.結(jié)果表明，隨著乙腈濃度的增加，各組分的遷移時(shí)間都有所延長，補(bǔ)骨脂甲素和補(bǔ)骨脂寧之間能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離，但對于補(bǔ)骨脂素和溶劑甲醇之間的分離度沒有明顯改善.因此，實(shí)驗(yàn)選擇在運(yùn)行緩沖溶液中添加25%（體積分?jǐn)?shù)）的乙腈來改善分離度，此條件下的標(biāo)準(zhǔn)品 混合液電泳圖見圖5.

圖4 乙腈體積分?jǐn)?shù)對各組分遷移時(shí)間的影響Fig.4 Effect of acetonitrile volume fraction on migration time of investigated compounds

圖5 在20 mmol/L Na2B4O7（用NaOH 調(diào)節(jié)pH 9.31）緩沖溶液中添加25%乙腈后的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液電泳圖Fig.5 Electropherogram of the standard mixed solution in Na2B4O7（20 mmol/L）buffer solution（adjust pH to 9.31 with NaOH）containing 25% acetonitrile

2.3 十二烷基磺酸鈉（SDS）濃度的影響由圖5可見，在上述條件下，除補(bǔ)骨脂素的譜峰還和甲醇峰完全重疊在一起外，其余4 種組分之間都達(dá)到了基線分離.因此，為了改善補(bǔ)骨脂素和中性溶劑甲醇的分離度，在含有體積分?jǐn)?shù)為25%的乙腈的20 mmol/L 的Na2B4O7（用NaOH 調(diào)節(jié)pH 9.31）緩沖溶液中加入SDS，采用膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳模式來改善補(bǔ)骨脂素和甲醇的分離.研究了SDS 濃度在10～30 mmol/L 的范圍內(nèi)對各組分分離效果的影響（圖6）.結(jié)果表明，隨著SDS 濃度的增加，各組分間的分離度逐漸增大，同時(shí)補(bǔ)骨脂素和甲醇電泳峰的分離度也有所提高.但當(dāng)SDS 濃度小于25 mmol/L時(shí)，補(bǔ)骨脂素的電泳峰裂分情況嚴(yán)重，只有SDS濃度增大至25 mmol/L 時(shí)，補(bǔ)骨脂素的峰形相對較好.因此，考慮在運(yùn)行緩沖溶液中再加入濃度為2 5 mmol/L 的SDS 以改善目標(biāo)組分的分離度.

圖6 SDS 濃度對各組分遷移時(shí)間的影響Fig.6 Effect of the SDS concentration on migration time of investigated compounds

2.4 儀器條件在優(yōu)化了上述運(yùn)行緩沖溶液的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)對分離電壓和進(jìn)樣量等儀器條件進(jìn)行了優(yōu)化.結(jié)果表明，在15～28 kV 的范圍內(nèi)，增大分離電壓，各組分的遷移時(shí)間會(huì)縮短，分離度下降且峰形變窄；在進(jìn)樣時(shí)間為3～9 s 的范圍內(nèi)逐漸增加，各組分的峰面積均增加且峰形展寬，降低了補(bǔ)骨脂素和溶劑甲醇之間的分離度.綜上，實(shí)驗(yàn)最終選擇了20 kV 的分離電壓、3.448 kPa 壓力進(jìn)樣5 s.

在上述優(yōu)化后的電泳條件下，5 種活性成分的標(biāo) 準(zhǔn)品混合物電泳圖見圖7.

圖7 5 種活性成分的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的電泳圖[緩沖溶液組成：含有25%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈和25 mmol/L SDS 的20 mmol/L 的Na2B4O7（用NaOH 調(diào) 節(jié)pH 9.31）緩沖溶液]Fig.7 Electropherogram of standard mixed solution of five active components

2.5 工作曲線在最終優(yōu)化條件下，對方法的特征性進(jìn)行了考察.將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋得到一系列不同質(zhì)量濃度的5 種組分的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，在最終優(yōu)化條件下的運(yùn)行緩沖溶液中進(jìn)行電泳分離檢測，以各組分的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制 了該方法的工作曲線，結(jié)果見表1.

表1 待測組分的工作曲線和精密度Tab.1 Working curve and precision of investigated compounds

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 重復(fù)性驗(yàn)證 配制了6 份質(zhì)量濃度相同的供試品5 種待測組分標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液（相當(dāng)于100%濃度水平）進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表2.可見，6 次測定結(jié)果5 種待測組分的峰面積的RSD 值均小于5%，保留時(shí)間的RSD 值均小于3%，說明方法的 重復(fù)性符合要求.

表2 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果（n=6）Tab.2 The results of epeatability verification (n=6)

2.6.2 中間精密度驗(yàn)證 采用同一分析人員不同日期、不同分析人員對5 種待測組分標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液（質(zhì)量濃度為25 μg/mL）進(jìn)行了測定，驗(yàn)證方法的中間精密度，結(jié)果分別見表3 和表4.

由表3 可見，同一分析人員連續(xù)2 天，每天進(jìn)樣測定6 次，所得全部測定結(jié)果5 種待測組分標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液峰面積的RSD 值為1.8%～4.7%，保留時(shí)間的RSD 值為1.1%～3.1%.由表4 可見，兩個(gè)不同分析人員，每人進(jìn)樣測定6 次，所得全部測定結(jié)果的峰面積的RSD 值為1.7%～4.3%，保留時(shí)間的RSD 值為1.3%～3.3%.上述結(jié)果表明，本方法 的精密度符合要求.

表3 中間精密度驗(yàn)證（同一人不同日期測定結(jié)果，n=6）Tab.3 Intermediate precision verification (n=6)

表4 中間精密度驗(yàn)證（不同分析人員測定結(jié)果，時(shí)間：2020.12.30）Tab.4 Intermediate precision verification（results determined by different analysts,December 30，2020）

2.6.3 穩(wěn)定性驗(yàn)證 取同一份補(bǔ)骨脂藥材樣品，在0，2，4，6，8 h 分別進(jìn)樣以測定補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂定和補(bǔ)骨脂寧的含量，結(jié)果見表5.可見，5 種待測組分的含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏 差均小于5.0%，表明方法的穩(wěn)定性符合要求.

表5 穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果（n=5）Tab.5 The results of stability verification（n=5）

2.6.4 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 以測定實(shí)際樣品加標(biāo)回收率驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度.各補(bǔ)骨脂藥材及其復(fù)方制劑的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6.可見，5 種待測組分的加標(biāo)回收率都在95.2%～104.8%之間，加標(biāo)回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%，表明方法的準(zhǔn)確度符 合要求.

表6 樣品中5 種目標(biāo)成分回收率測定結(jié)果（n=3）Tab.6 The recoveries of five investigated compounds in samples（n=3）

2.6.5 最低檢測限和定量限 將最低質(zhì)量濃度的補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂定和補(bǔ)骨脂寧對照品溶液分別進(jìn)行逐步稀釋，按上述所建立的方法進(jìn)行檢測.按照LOD=3.3δ/S（δ為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差；S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）計(jì)算了方法的檢出限，按照LOD=10δ/S計(jì)算了方法的定量限，結(jié)果見表7.結(jié)果表明，方法的檢測限和定 量限符合要求.

表7 最低檢測限和定量限Tab.7 The results of limits of detection and quantification.

2.7 樣品分析為了驗(yàn)證方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，將上述所建立的方法用于1.2 的3 種樣品溶液中5種目標(biāo)組分的分離測定.各補(bǔ)骨脂藥材及其復(fù)方制劑的測定結(jié)果見表8.補(bǔ)骨脂藥材樣品的電泳圖見圖8.測定結(jié)果說明本文建立的方法可以用于補(bǔ)骨脂 中這5 種組分的含量測定，具有一定的實(shí)用價(jià)值.

圖8 中藥材補(bǔ)骨脂樣品的電泳圖Fig.8 Electropherogram of Chinese traditional medicine psoralen

3 結(jié)論

本文采用毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜分離模式，在詳細(xì)優(yōu)化了運(yùn)行電解質(zhì)溶液組成和儀器條件下，建立了一個(gè)能同時(shí)分離檢測藥材補(bǔ)骨脂及其制劑中補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂定和補(bǔ)骨脂寧5 種活性成分的新方法.該方法可以在23 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)補(bǔ)骨脂藥材及其復(fù)方制劑中這5 種目標(biāo)組分基線分離與有效檢測，具有較高的實(shí)用價(jià)值，為補(bǔ)骨脂及相關(guān)制劑中這些有效成分的定性和定量分析提供了新方法.