紀(jì)開(kāi)燕，楊 玲，吳姣姣，蔣明星，韓秀林，魯 濤

(云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南省微生物研究所，云南 昆明 650091)

格爾德霉素（geldanamycin，GM）是由放線菌產(chǎn)生的苯醌安莎類(lèi)抗生素，因其具有極強(qiáng)的抗腫瘤活性，自發(fā)現(xiàn)以來(lái)就引起了研究者廣泛關(guān)注，是有很好開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景的藥物.GM 的作用靶點(diǎn)是Hsp90，其能夠特異性地抑制Hsp90 氨基端ATP 酶活性[1-2]，多種腫瘤相關(guān)蛋白皆需依賴Hsp90 ATP 酶來(lái)行使其功能.Hsp90 ATP 酶活性受到抑制導(dǎo)致該類(lèi)蛋白降解，最終引起腫瘤細(xì)胞死亡[3-5].但是，此類(lèi)化合物有肝毒性較強(qiáng)、水溶性差等缺點(diǎn)，阻礙了臨床的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，因此有必要研究其生物合成途徑，以期對(duì)其進(jìn)行基因改造或?qū)ふ移漕?lèi)似物[6-7].對(duì)GM 及其類(lèi)似物生物合成的深入研究有助于對(duì)此類(lèi)化合物的進(jìn)一步研發(fā).

關(guān)于GM 的生物合成途徑已經(jīng)有了一些研究[8-12]，這些研究表明LuxR 家族調(diào)控子GdmRⅠ和GdmRⅡ及TetR 家族調(diào)控子GdmRⅢ在格爾德霉素的生物合成中都起到正調(diào)控作用.我們克隆并測(cè)序了自溶鏈霉菌（Streptomyces autolyticus）CGMCC 0516 中格爾德霉素生物合成基因簇[13-14]，并證明了其中GdmRⅠ、GdmRⅡ及GdmRⅢ同樣在格爾德霉素的生物合成中都起到正調(diào)控作用[15].但是，此類(lèi)化合物生物合成的一些調(diào)控細(xì)節(jié)尚未完全解析.

在自溶鏈霉菌GM 生物合成基因簇中存在一個(gè)功能未知的基因orf17.該基因編碼的蛋白屬于MarR（multiple antibiotic resistance regulator）多重耐藥調(diào)控蛋白.MarR 蛋白家族是原核生物的一個(gè)多效性轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，通過(guò)與靶標(biāo)DNA 結(jié)合從而阻遏轉(zhuǎn)錄[16]，參與細(xì)菌多種生命進(jìn)程的調(diào)控，如抗藥性和毒力因子相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控等，在致病菌適應(yīng)外界壓力的過(guò)程中也起到關(guān)鍵作用[17-19].在本工作中，我們對(duì)自溶鏈霉菌中Orf17 的功能進(jìn)行了研究，成功構(gòu)建了orf17突變株，并對(duì)突變株不同階段的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了HPLC 分析；同時(shí)，采用RT-PCR對(duì)格爾德霉素生物合成相關(guān)基因在orf17突變株中的表達(dá)進(jìn)行了分析；此外，分離純化了突變株中產(chǎn)量提高的3 個(gè)化合物，并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定.研究結(jié)果初步表明Orf17 正調(diào)控自溶鏈霉菌中格爾德霉素的生物合成，可能負(fù)調(diào)控自溶鏈霉菌中洋橄欖 葉素的生物合成.

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件所用的菌株及質(zhì)粒見(jiàn)表1.質(zhì)粒pHY773 和pSA267 分別由中國(guó)科學(xué)院上海植物生理與生態(tài)研究所覃重軍老師和云南大學(xué)尹敏老師惠贈(zèng).鏈霉菌產(chǎn)孢使用ISP4（BD Difco，USA）培養(yǎng)基，于28 ℃平板培養(yǎng)；種子液培養(yǎng)基為T(mén)SB（BD Difco，USA）培養(yǎng)基，在28 ℃下振蕩培養(yǎng)；發(fā)酵所用培養(yǎng)基為61﹟培養(yǎng)基（酵母粉2 g，魚(yú)蛋白胨2 g，可溶性淀粉5 g，大豆粉5 g，葡萄糖20 g，CaCO32 g，NaCl 4 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，pH=7.8，雙蒸水定容至1 000 mL），在28 ℃下振蕩培養(yǎng).大腸桿菌（Escherichia coli）培養(yǎng)使用Luria-Bertani（LB）液體/固體培養(yǎng)基（酵母提取物5 g，NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，pH=7.0，去離子水定容至1 000 mL，配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入10 g/L 瓊脂）.若無(wú) 特別說(shuō)明，大腸桿菌培養(yǎng)條件均為37 ℃.

表1 菌株和質(zhì)粒Tab.1 Strains and plasmids

1.2 引物PCR 引物見(jiàn)表2，使用Primer Premier 5 .0 軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成.

表2 本研究使用的引物Tab.2 Primers used in this study

1.3 化學(xué)試劑及酶所用的抗生素質(zhì)量濃度分別為：阿伯拉霉素（Apra）25 μg/mL，卡那霉素（Kan）25 μg/mL，氨芐青霉素（Amp）50 μg/mL，硫鏈絲菌素（Thio）10 μg/mL，萘啶酸（Nal）15 μg/mL，氯霉素（Cm）20 μg/mL.所用抗生素均先配制成母液，其中氯霉素和硫鏈絲菌素分別用乙醇和DMSO 配制，萘啶酸用0.1 mol/L 的NaOH 溶解，其它抗生素均用無(wú)菌水配制，儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆?LATaq和ExTaqDNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、XhoⅠ、BamH Ⅰ、PstⅠ和EcoR Ⅰ，以及試劑盒Universal RNA Extraction Kit 和PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Perfect Real Time）等均購(gòu)自大連寶生物公司.TransTaqDNA Polymerase High Fidelity（HiFi）購(gòu)自北京全式金生物公司.細(xì)菌基因組、高純質(zhì)粒小量制備和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自北京百泰 克公司.

1.4orf17突變株構(gòu)建及產(chǎn)物檢測(cè)以自溶鏈霉菌CGMCC 0516 為出發(fā)菌株，采用PCR-targeting 方法敲除orf17基因構(gòu)建其突變株，方法參照文獻(xiàn)[22].對(duì)野生型菌株和orf17突變株進(jìn)行液體發(fā)酵，先將菌株于ISP4 平板上劃線，28 ℃下培養(yǎng)36～48 h 后，再挑取單菌落劃線于ISP4 固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d，待其產(chǎn)孢后用已滅菌的10%甘油將孢子洗出備用；然后按1%的接種量將新鮮孢子液接入50 mL TSB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min 搖瓶培養(yǎng)36～48 h 獲得種子液；以1%的接種量將種子液接入50 mL 61#發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min 搖瓶培養(yǎng)3～13 d 獲得發(fā)酵液.離心收集發(fā)酵液的上清和菌體，上清用等體積乙酸乙酯萃取2 遍，菌體用丙酮浸泡過(guò)夜，萃取液分別于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，甲醇溶解后合并待測(cè).使用Agilent 1 200 高效液相（Luna XBD-C18Φ4.60×250 mm 5-Micron）分析樣品，梯度洗脫流動(dòng)相為水和甲醇，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm.洗脫過(guò)程分3 步：第1 步，30%～100%甲醇，洗脫0～25 min；第2 步，100%甲醇，洗脫25～30 min；第3 步，30%甲醇，洗脫 30～35 min.

1.5 RT-PCR自溶鏈霉菌總RNA 的提取、cDNA的合成及RT-PCR 檢測(cè)均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操 作.

1.6 化合物的分離純化將orf17突變株進(jìn)行液體發(fā)酵，取第5、7、9 天的發(fā)酵液，按前述方法獲得粗提液.然后將粗提液進(jìn)行TLC 層析（展開(kāi)劑：V(石油醚)∶V(丙酮)=7∶3；V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=7∶3；V(氯 仿)∶V(甲 醇)=95∶5；V(氯 仿)∶V(丙酮)=95∶5；V(氯仿)∶V(丙酮)=9∶1；V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1）.根據(jù)TLC 層析結(jié)果，選擇正向硅膠進(jìn)行梯度洗脫劃段，流動(dòng)相分別為純氯仿、氯仿/甲醇（V(氯仿)∶V(甲醇)=40∶1；20∶1；15∶1；9∶1）及純甲醇.采用凝膠柱對(duì)收集到的40∶1 段和20∶1段進(jìn)行進(jìn)一步分離.之后用反向硅膠C18 對(duì)其進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相分別為乙腈-水（V(乙腈)∶V(水)=7∶3，8∶2，9∶1）及純乙腈.最后用半制備LC3000 liquid chromatograph system進(jìn)行制備，流動(dòng)相為70%～100%乙腈-水，獲得化合物純品.之后通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)確定這3 個(gè)化合物的相對(duì)分子質(zhì)量，再根據(jù)1H NMR、13C-DEPT NMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY 和ROESY 對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析.

2 結(jié)果與分析

2.1orf17基因在格爾德霉素生物合成中的作用為了了解自溶鏈霉菌CGMCC 0516 格爾德霉素生物合成基因簇中orf17基因的功能，我們采用一步PCR 法構(gòu)建了其orf17敲除突變株，經(jīng)PCR 擴(kuò)增（圖1）和序列測(cè)定驗(yàn)證，此突變株構(gòu)建正確.

圖1 orf17 突變株的PCR 驗(yàn)證Fig.1 Verification of the orf17 mutant by PCR amplification

HPLC 檢測(cè)野生型菌株和orf17突變株的發(fā)酵產(chǎn)物，結(jié)果顯示：在整個(gè)發(fā)酵期間，突變株中格爾德霉素的產(chǎn)量相較野生型菌株明顯降低（圖2（a）～（i）），其中第5 天格爾德霉素的產(chǎn)量比野生型減少了53.7%；第7 天產(chǎn)量減少了52.8%；第9 天產(chǎn)量減少了44.1%；第11 天產(chǎn)量減少了56.7%（圖2（j））.說(shuō)明Orf17 可能參與了格爾德霉素生物合成中相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，并且起到了正調(diào)控作用.

雖然在orf17突變株中格爾德霉素的產(chǎn)量明顯降低，但仍可以在發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)到該化合物，表明其合成途徑并沒(méi)有被完全阻斷，并且在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，格爾德霉素的產(chǎn)量變化趨勢(shì)與野生型是一致的，這說(shuō)明格爾德霉素的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的代謝過(guò)程，眾多細(xì)胞因子都參與了該合成途徑的基因調(diào)控，Orf17 只是其中一個(gè)調(diào)控蛋白.此外，有3 個(gè)化合物（化合物1、化合物2 和化合物3）在突變株中的產(chǎn)量與野生型相比大大提高，在發(fā)酵第9天 時(shí)最為明顯（圖2（g））.

圖2 野生型和orf17 突變株中化合物的HPLC 分析Fig.2 Analysis of the production of compounds in the wide-type strain and the orf17 mutant

2.2 格爾德霉素生物合成相關(guān)基因在orf17突變株中的表達(dá)為了尋找Orf17 可能調(diào)控的靶基因，我們根據(jù)生物信息學(xué)分析選取了10 個(gè)與格爾德霉素生物合成相關(guān)的基因，分析了其在野生型和orf17突變株中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異.這些基因分別為：前體合成基因almK和almH（與almI、almJ和almG共同參與甲氧基丙二酸-ACP 生物合成）；聚酮鏈骨架合成基因almAⅠ（編碼聚酮合酶）；調(diào)控基因almRⅠ、almRⅡ和almRⅢ（編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白AlmRⅠ、AlmRⅡ和AlmRⅢ）；后修飾基因almN（編碼氨甲酰轉(zhuǎn)移酶）、almM（編碼黃素依賴的單加氧酶）、almP（編碼P450 加氧酶）和almF（編碼氨基合酶）.我們分別收集培養(yǎng)3、5、7d 的野生型和orf17突變株菌體，提取菌體總RNA，對(duì)其進(jìn)行初步定量后將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以特異性引物（表2）對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增.結(jié)果顯示（圖3），在發(fā)酵的第3、5、7 天almAI、almN、almK和almP4 個(gè)基因在野生型和orf17突變株中均有表達(dá)，但突變株中almAⅠ表達(dá)量逐漸降低；突變株中almM、almH、almRⅠ基因第3 和5 天有表達(dá)，第7 天沒(méi)有表達(dá)，而這3 個(gè)基因在野生型中均有表達(dá)；突變株中almF、almRⅡ和almRⅢ基因只在第3 天有表達(dá)，而這3 個(gè)基因在野生型中均有表達(dá).因此，orf17基因的突變均不同程度的影響了almAI、almF、almRⅡ、almRⅢ、almM、almRⅠ和almH這7 個(gè)基因的表達(dá)，表明Orf17 可能調(diào)控了等7 個(gè)基因的表達(dá).Orf17 對(duì)這些基因的調(diào) 控作用可能是直接的，也可能是間接的.

圖3 RT-PCR 分析格爾德霉素生物合成相關(guān)基因在野生型和突變株中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)Fig.3 RT-PCR analysis of the transcriptional levels of genes in the geldanamycin gene cluster in the wild-type strain and the orf17 mutant

2.3orf17突變株中產(chǎn)量升高的化合物分析在對(duì)orf17突變株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)orf17突變株中出峰時(shí)間在25.2、27.1 min 和29.3 min的化合物（分別命名為化合物1，2 和3）與野生型相比產(chǎn)量明顯提高，并且與格爾德霉素的產(chǎn)量變化相反，說(shuō)明Orf17 可能對(duì)這3 個(gè)化合物的生物合成起到負(fù)調(diào)控作用（圖4）.

圖4 野生型和orf17 突變株中不同發(fā)酵階段化合物1，2，3 的產(chǎn)量Fig.4 The production of compound 1,2,3 in the wide-type strain and the orf17 mutant at different fermentation stage

通過(guò)對(duì)orf17突變株發(fā)酵產(chǎn)物的分離和純化，我們獲得了這3 個(gè)化合物的純品.ESI-MS 分析表明化合物1、1 和3 的相對(duì)分子質(zhì)量分別為1 024、1 038 和1 052（分別基于m/z1 023 [M– H]-、1 061[M+Na]+和1 051 [M– H]-）.1H NMR、13C-DEPT NMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY 和ROESY 分析表明化合物1為洋橄欖葉素（elaiophylin），分子式為C54H88O18；化合物2為11′-o-甲基洋橄欖葉素（11′-o-methylelaiophylin）分子式為C55H90O18，化合物3為11,11′-o-二甲基洋橄欖葉素（11,11′-odimethylelaiophylin），分子式為C56H92O18.3 個(gè)化合物 都為洋橄欖葉素及其衍生物.

3 結(jié)論和討論

本研究以自溶鏈霉菌為材料，探究其次生代謝產(chǎn)物格爾德霉素生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵基因orf17的功能和調(diào)控作用.我們首先構(gòu)建了orf17突變株，通過(guò)HPLC 檢測(cè)了野生型和orf17突變株在不同發(fā)酵階段產(chǎn)物的變化.相較野生型而言，orf17突變株中格爾德霉素的產(chǎn)量大幅減少，說(shuō)明Orf17 在格爾德霉素的生物合成中起正調(diào)控作用.為了尋找Orf17 可能調(diào)控的靶基因，選取了10 個(gè)與格爾德霉素生物合成相關(guān)基因almAI、almF、almM、almN、almH、almK、almP、almRⅠ、almRⅡ和almRⅢ，分析了它們?cè)谝吧秃屯蛔冎曛械霓D(zhuǎn)錄表達(dá)差異.結(jié)果顯示almAI、almF、almM、almH、almRⅠ、almRⅡ和almRⅢ這7 個(gè)基因的表達(dá)受到了orf17突變的影響，說(shuō)明Orf17 可能對(duì)這些基因直接或間接地起到了調(diào)控作用.Orf17 蛋白對(duì)這些基因的具體調(diào)控作用還有待后續(xù)進(jìn)一步研究.

有趣的是，HPLC 檢測(cè)表明，出峰時(shí)間在25.2，27.1 min 和29.3 min 的化合物在orf17突變株中產(chǎn)量提高，最終我們分離得到這3 個(gè)化合物并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析，它們是洋橄欖葉素及其衍生物.這說(shuō)明Orf17 在正調(diào)控格爾德霉素的生物合成的同時(shí)，對(duì)洋橄欖葉素的生物合成也有負(fù)調(diào)控作用.這是格爾德霉素生物合成基因簇內(nèi)的Orf17 能夠調(diào)控洋橄欖葉素的生物合成的首次報(bào)道.在鏈霉菌中次級(jí)代謝物的生物合成往往是被高度調(diào)節(jié)的，如果不同的代謝產(chǎn)物生物合成途徑使用共同的前體，那么前體物質(zhì)的供應(yīng)可能會(huì)對(duì)這些途徑產(chǎn)生影響.格爾德霉素生物合成的起始單元為3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA），其合成起始于葡萄糖.而在洋橄欖葉素的合成過(guò)程中，葡萄糖通過(guò)磷酸化、dTDP 化、脫水、還原、差向異構(gòu)化等反應(yīng)生成2-脫氧-L-巖藻糖，再經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶催化加入到洋橄欖葉素分子中[23].同時(shí)，在格爾德霉素和洋橄欖葉素的生物合成中，均以丙二酰輔酶A 和甲基丙二酰輔酶A 為延伸單元.因此，這兩條生物合成途徑之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系.以拮抗模式對(duì)它們的生物合成進(jìn)行調(diào)節(jié)，可以在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏期間選擇性合成所需的次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)適應(yīng)性周?chē)沫h(huán)境.Orf17 雖然是一個(gè)在特定基因簇內(nèi)的調(diào)控子，但卻是一個(gè)多效性調(diào)控子，這種不同生物合成途徑的交叉調(diào)控，進(jìn)一步表明鏈霉菌中次生代謝產(chǎn)物生物合成調(diào)節(jié)的復(fù)雜性和靈活性，也是鏈霉菌能夠更好適應(yīng)環(huán)境變化的調(diào)控機(jī)制.本研究讓我們更加深入地了解格爾德霉素的生物合成機(jī)制，也為今后通過(guò)遺傳手段改造苯醌安莎類(lèi)抗生素提供了理論依據(jù).