夏曉娟，李 梅，楊 通，胡 蓉，孟 爽，楊云慧

(云南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500)

嗎啡是罌粟提取物中具有藥理活性和毒物活性的主要生物堿[1-2].罌粟種子中含有嗎啡、可待因等生物堿，是造成鴉片成癮的主要因素[3].嗎啡具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用[4-5]，是最早用于臨床的麻醉劑[6].目前，世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦將嗎啡用于緩解癌癥引起的疼痛[7-8].但是過量食用嗎啡會(huì)導(dǎo)致急性中毒[9-11]，1 名成年人食用60 mg 嗎啡就會(huì)導(dǎo)致中毒，食用250 mg 就會(huì)致死.為預(yù)防在醫(yī)療過程中的嗎啡中毒和對(duì)吸毒可疑人員進(jìn)行排查，建立快速、簡(jiǎn)單且靈敏地檢測(cè)人體血液以及尿液中嗎啡含量的方法十分必要.迄今為止國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了酶聯(lián)免疫法（ELISA）[12]，毛細(xì)管電泳（CE）[13]，免疫熒光層析[14]，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）[15]等檢測(cè)嗎啡的方法.但是這些檢測(cè)方法的樣品前期準(zhǔn)備復(fù)雜耗時(shí)，需要依賴復(fù)雜的儀器和經(jīng)受充分訓(xùn)練的專業(yè)人員，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[16].電化學(xué)傳感器是基于待測(cè)物本身的電化學(xué)性質(zhì)，將化學(xué)量轉(zhuǎn)變成電學(xué)量進(jìn)行檢測(cè)的裝置，具有靈敏度高、成本低、快速及樣品處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在基礎(chǔ)研究、生物、臨床化學(xué)、化學(xué)分析等領(lǐng)域[17]，是目前最熱門的研究領(lǐng)域之一.研究人員用各種材料修飾電極并用于嗎啡的檢測(cè)，這克服了使用裸玻碳電極進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量時(shí)電子轉(zhuǎn)移速率慢以及電極污染等缺點(diǎn)[18].Aliabadi 等[19]將水凝膠作為吸收性聚合物基質(zhì)與碳糊混合制備電極，該電極成功地應(yīng)用于1滴尿樣中嗎啡的測(cè)定，檢測(cè)范圍為5.0～200 μmol/L，檢測(cè)限為1 μmol/L.Atta N F 等[20]利用微波輻射法制備了氧化石墨烯-鈀（RGO-Pd）對(duì)嗎啡進(jìn)行電化學(xué)研究.該電極線性范圍為0.34～12 μmol/L，檢測(cè)限為12.95 nmol/L.Basiri 等[21]用多壁碳納米管修飾電極表面對(duì)嗎啡進(jìn)行檢測(cè)，該電極在50～920 nmol/L 的濃度范圍內(nèi)檢測(cè)關(guān)系呈線性，檢測(cè)限為10 nmol/L.

卟啉及其金屬卟啉類化合物是芳香族雜環(huán)化合物，它們的母體結(jié)構(gòu)為卟吩，擁有吡咯環(huán)和次甲基橋聯(lián)起來的大共軛體系[22]，其衍生物種類眾多且具有自身獨(dú)特的結(jié)構(gòu).卟啉類化合物因其芳香性強(qiáng)、容易吸附和堅(jiān)固的結(jié)構(gòu)，并且其金屬配位化合物種類繁多，多被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、仿生學(xué)、催化以及化學(xué)等領(lǐng)域[23-24].陽衛(wèi)軍等[25]發(fā)現(xiàn)鐵卟啉材料的催化活性優(yōu)于鈷、錳、鉻卟啉等金屬卟啉.它可在空氣中直接使烷烴氧化，然后快速分解得到過氧化物[26].目前，已有研究報(bào)道將卟啉材料修飾電極用于電化學(xué)方法進(jìn)行分析檢測(cè).張水鋒等[27]將卟啉修飾電極用于水中溶解氧的測(cè)定；錢江紅等[28]使用鈷卟啉修飾電極進(jìn)行多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)的測(cè)定.目前，尚未見到使用鐵卟啉修飾電極進(jìn)行嗎啡的測(cè)定的報(bào)道.本研究以鐵卟啉作為電極的修飾材料，可以增加電極的比表面積，并提供電子快速轉(zhuǎn)移的表面，由此構(gòu)建的電化學(xué)傳感器被用于檢測(cè)人體血清 中嗎啡的含量.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器5，10，15，20-四苯基卟啉-Fe 購(gòu)自上海的麥克林生化科技有限公司；鹽酸嗎啡（中國(guó)北京公安部物證鑒定中心）；二次蒸餾水（自制）；硝酸（重慶川東化工集團(tuán)有限公司）；無水乙醇（天津市風(fēng)船試劑科技有限公司）；六水合氯化鋁（AlCl3·6H2O）、甲醇（CH3OH）、磷酸緩沖溶液（phosphate buffer saline PBS）、殼聚糖（Chitosan）等均購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；三氯甲烷（CHCl3）和鹽酸（HCl）購(gòu)于重慶川東化工有限公司.以上試劑均為分析純.血清由云南師范大學(xué)校醫(yī)院提供.

玻碳電極（天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司）；CHI660D 型電化學(xué)工作站（上海市辰華儀器公司）；真空干燥箱DZF-6020（上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司）；甘汞電極（上海魯碩實(shí)業(yè)有限公司）；T 超聲波清洗器（上海市科道超聲儀器有限公司）；透射電鏡JEM2100（日本電子株式會(huì)社）；鉑絲電極（上海魯碩實(shí)業(yè)有限公司）；GL-20M 離心機(jī)（湖南省長(zhǎng)沙市湘 儀離心機(jī)有限公司）.

1.2 鐵卟啉（PAF-40-Fe）的合成參考文獻(xiàn)[29]合成鐵卟啉.在100 mL 的三頸圓底燒瓶中分別加入400 mg 的5，10，15，20-四苯基卟啉-Fe 和1.6 g AlCl3，將干燥的40 mL 干燥的CHCl3加入到燒瓶中，用氮?dú)獗Ｗo(hù)60 ℃條件下反應(yīng)48 h，待冷卻至室內(nèi)溫度條件下，離心后接著分別用無水乙醇、3 mol/L 的HCl 溶液和甲醇洗滌3 次，將產(chǎn)物在1 20 ℃真空中干燥，得到的黑色粉末即為鐵卟啉.

1.3 卟啉（PAF）的合成參考文獻(xiàn)[29]合成PAF.稱取間-四苯基卟吩（385 mg，0.62 mmol）和AlCl3（3.00 g，4.5 mmol）一同放入100 mL 的兩頸圓底燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的情況下向圓底燒瓶中加入40 mL 干燥的三氯甲烷，采用60 ℃油浴反應(yīng)48 h.反應(yīng)結(jié)束后，攪拌下冷卻至室溫，離心收集粗產(chǎn)物.將得到的粗產(chǎn)物分別用無水乙醇、3 mol/L的HCl 和甲醇洗滌3 次，之后將產(chǎn)物在120 ℃真空 中干燥，得到黑色粉末，即為PAF.

1.4 鐵卟啉修飾電極的制備首先準(zhǔn)備好3 mm的玻碳電極（GCE）在3 000 目的砂紙上面打磨干凈，然后分別用粒徑為1.5 μm、0.5 μm 以及50 nm 的Al2O3拋光粉將電極打磨拋光成鏡面.接下來依次在稀硝酸溶液、乙醇以及超純水中分別超聲洗滌3 min，等待自然風(fēng)干后備用.將鐵卟啉加入水中超聲至完全分散于水溶液，取鐵卟啉分散液與0.5%的殼聚糖混勻，再用移液槍取10 μL 該溶液滴在已經(jīng) 打磨晾干的電極表面上，晾干后備用.

1.5 嗎啡的檢測(cè)室溫下，使用緩沖溶液配制不同濃度嗎啡溶液，以鐵卟啉/GCE 電極、甘汞電極、鉑絲電極等構(gòu)成三電極體系，首先在-0.1 V 下于含嗎啡的PBS 緩沖溶液中（pH 7.0）富集90 s，接著采用差分脈沖伏安法（DPV）檢測(cè)嗎啡在0.2～0.8 V間 的電流響應(yīng).實(shí)驗(yàn)流程如圖1 所示.

圖1 鐵卟啉修飾電極的制備及檢測(cè)流程圖Fig.1 Flow chart of preparation of Fe porphyrin modified electrode and determination

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

2.1.1 鐵卟啉的X 射線粉末衍射表征 對(duì)合成的產(chǎn)物進(jìn)行X 射線粉末衍射表征（XRD），其測(cè)試掃描速度為1°/min，掃描的范圍為5°～ 40°，掃描結(jié)果如圖2 所示，并沒有明顯的衍射峰，其XRD 曲線與文獻(xiàn)[29]的基本一致，說明這種材料為無定形 結(jié)構(gòu).

圖2 鐵卟啉的X 射線粉末衍射表征Fig.2 X-ray powder diffraction characterization of Fe porphyrins

2.1.2 鐵卟啉的紅外表征 對(duì)合成產(chǎn)物的紅外進(jìn)行表征，在紅外燈照射下稱取1 mg 本文合成的鐵卟啉材料和100 mg 純KBr 混合均勻后研磨，使用紅外壓片磨具將該混合物壓成透明樣片，通過FT-IR 吸收光譜儀測(cè)定紅外光譜.如圖3 所示，當(dāng)偶聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的時(shí)候，苯環(huán)的C—H 和C—C 在1 650～1 400 cm-1和800～700 cm-1范圍內(nèi)的振動(dòng)的位置和吸收率移向較低的波數(shù)移動(dòng)并且峰強(qiáng)減小.在產(chǎn)物中我們觀察到在750 cm-1附近的另一個(gè)峰，這歸因于對(duì)位取代的苯環(huán).苯環(huán)偶聯(lián)在一起形成延伸的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu).此外，金屬卟啉的Fe—N 特征振動(dòng)在1 001 cm-1，表明金屬陽離子是卡在卟啉環(huán)的中間，證明聚合物合成成功.

圖3 鐵卟啉的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum characterization of Fe porphyrins

2.1.3 鐵卟啉的形貌特征 采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察了實(shí)驗(yàn)合成的鐵卟啉材料的微觀形貌（圖4）.從透射電鏡中可以看出PAF 材料的形貌沒有固定的形狀，表明材料的無序性，與XRD 測(cè)試結(jié)果相吻合.

圖4 鐵卟啉在不同放大倍數(shù)下的透射電子顯微鏡圖Fig.4 Transmission electron microscopy of Fe porphyrins at different magnification (left:12 000×;right:60 000×)

2.2 嗎啡的電化學(xué)行為圖5 顯示了不同修飾電極在630 μmol/L 嗎啡溶液中的DPV 曲線.可觀察到嗎啡的氧化峰電位均在0.49 V.由圖5 可知修飾有鐵卟啉的電極電流響應(yīng)大于卟啉修飾電極以及裸電極的DPV 響應(yīng)曲線，表明Fe 卟啉對(duì)嗎啡的檢測(cè) 具有良好的導(dǎo)電效果.

圖5 不同修飾電極在嗎啡的PBS 緩沖溶液中的差分脈沖伏安曲線Fig.5 The pulse voltammetry curves of different modified electrodes in morphine PBS buffer solution

2.3 嗎啡的循環(huán)伏安行為為了考察鐵卟啉修飾電極的電化學(xué)特性，本實(shí)驗(yàn)采用循環(huán)伏安法（CV）檢測(cè)在-0.2～0.8 V 間電極的電流響應(yīng)，圖6 中曲線a、b、c 分別為鐵卟啉修飾電極、卟啉修飾電極以及裸玻碳電極在含有630 μmol/L 嗎啡的PBS 緩沖溶液（pH 7.0）中的循環(huán)伏安響應(yīng).從圖6 中可看出，嗎啡在Fe 卟啉修飾電極（a）、卟啉修飾電極（b）及裸GCE（c）上均出現(xiàn)氧化峰，a 曲線的氧化峰電流大于b、c 曲線的電流，再次說明鐵卟啉具有很好的催化性.

圖6 不同修飾電極在含有630 μmol/L 嗎啡的PBS 緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線Fig.6 Cyclic voltammetric curves of different modified electrodes in PBS buffer solution containing 630 μmol/L morphine (a:PAF-40-Fe -modified electrode;b:PAFmodified electrode;c:bare electrode)

實(shí)驗(yàn)考察了掃描速度對(duì)嗎啡氧化峰電流的影響，掃描速度從a 到g 分別為20、40、60、80、100、120、140 mV/s，鐵卟啉修飾電極在含有嗎啡的PBS 緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線如圖7 所示.由圖7 可以觀察到嗎啡的氧化峰電流隨著掃描速度的增大而增大，并且從內(nèi)置圖可知嗎啡的氧化峰電流和掃描速度的平方根成正比，因此電流受擴(kuò)散控 制.

圖7 掃描速度對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響（內(nèi)置圖為氧化峰電流對(duì)掃描速度平方根的線性關(guān)系）Fig.7 Influence of scanning speed on sensor response current(The inset shows the linear relationship between the oxidation current and the square root of scan rate)

2.4 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.4.1 鐵卟啉質(zhì)量濃度對(duì)嗎啡電化學(xué)行為的影響 因鐵卟啉的質(zhì)量濃度直接影響該傳感器的響應(yīng)電流的大小，因此在實(shí)驗(yàn)中首先考察了不同質(zhì)量濃度的鐵卟啉對(duì)傳感器響應(yīng)電流值的影響.圖8 為修飾有不同質(zhì)量濃度的鐵卟啉/GCE 在含630 μmol/L嗎啡的PBS 緩沖溶液中（pH 7.0）的差分脈沖響應(yīng).從圖8 中可以看出，鐵卟啉質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，電流響應(yīng)最大.因此本實(shí)驗(yàn)選用1.5 mg/mL 作為 修飾電極的鐵卟啉質(zhì)量濃度.

圖8 鐵卟啉質(zhì)量濃度對(duì)鐵卟啉修飾電極響應(yīng)電流的影響Fig.8 Effect of Fe porphyrin concentration on the response current of Fe porphyrin-modified electrode

2.4.2 緩沖溶液對(duì)鐵卟啉修飾電極響應(yīng)電流的影響 不同緩沖溶液對(duì)傳感器的電流響應(yīng)值也有影響.圖9 為鐵卟啉修飾電極在pH 為7.0 含630 μmol/L嗎啡的PBS 緩沖溶液、丙磺酸鹽緩沖溶液（MOPS）、Tris-HCl、乙磺酸鹽緩沖溶液（HEPES）中的差分脈沖響應(yīng)電流.從圖9 中可以看到，采用PBS 緩沖溶液時(shí)，嗎啡的電流響應(yīng)最大.因此本實(shí)驗(yàn)選擇PBS緩沖溶液作為緩沖溶液.

圖9 緩沖溶液對(duì)鐵卟啉修飾電極響應(yīng)電流的影響Fig.9 Effect of buffer solution on response current of Fe porphyrin-modified electrode

2.4.3 緩沖溶液pH 對(duì)鐵卟啉修飾電極響應(yīng)電流的影響 為了找出電極的最佳緩沖溶液的pH值，本實(shí)驗(yàn)考察了鐵卟啉修飾電極在630 μmol/L 嗎啡溶液在不同pH 的PBS 緩沖溶液下的電流響應(yīng)，從圖10 中可以看出，緩沖溶液的pH 為7.0 時(shí)，電極的電流響應(yīng)最大.因此，本文選擇pH 7.0 為測(cè)定嗎 啡時(shí)PBS 緩沖溶液的酸度條件.

圖10 緩沖溶液pH 對(duì)鐵卟啉修飾電極響應(yīng)電流的影響Fig.10 The effect of buffer pH on response current of Fe porphyrin -modified electrode

2.4.4 富集時(shí)間對(duì)鐵卟啉修飾電極響應(yīng)電流的影響 實(shí)驗(yàn)考察了鐵卟啉修飾電極在-0.1 V、不同富集時(shí)間下于含630 μmol/L 嗎啡的PBS 緩沖溶液中的電流響應(yīng)（pH 7.0），從圖11 可以看出，電流隨富集時(shí)間增加而增大，當(dāng)富集時(shí)間為90 s 時(shí)，電流響應(yīng)達(dá)到最大并趨于穩(wěn)定，因此選擇90 s 為富集時(shí)間.

圖11 富集時(shí)間對(duì)鐵卟啉修飾電極響應(yīng)電流的影響Fig.11 The effect of enrichment time on response current of Fe porphyrin -modified electrode

2.5 鐵卟啉修飾電極檢測(cè)嗎啡鐵卟啉修飾電極在最佳條件下檢測(cè)不同濃度的嗎啡溶液，用差分脈沖伏安法記錄0.2～0.8 V 間傳感器的響應(yīng)電流，結(jié)果見圖12、13.圖12 為嗎啡濃度在1.5～1 500 μmol/L時(shí)測(cè)得DPV 響應(yīng)曲線，圖13 中鐵卟啉修飾電極的響應(yīng)電流與嗎啡濃度在1.5～1 500 μmol/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為I=0.003 2c+0 .089（R2=0.994 5），檢出限為0.5 μmol/L.

圖12 鐵卟啉修飾電極對(duì)不同濃度嗎啡的DPV 響應(yīng)曲線Fig.12 DPV response curves of iron porphyrin modified electrode to morphine of different concentrations

圖13 傳感器檢測(cè)嗎啡的校正曲線Fig.13 The calibration curve of proposed sensor for the detection of morphine

2.6 鐵卟啉修飾電極的選擇性在PBS 緩沖溶液（pH 7.0）中分別加入濃度為1 000 μmol/L 的半胱氨酸（Cys）、多巴胺（DA）、尿酸（UA）、抗壞血酸（AA）、丙氨酸（Ala）、葡萄糖（Glc）、甘氨酸（Gly），和1 000 μmol/L 的嗎啡溶液的響應(yīng)作比較，結(jié)果如圖14 所示.從圖14 中可以看到只有嗎啡在0.49 V處有氧化峰，其余均沒有出峰，證明了該傳感器具有很好的抗干擾能力.

圖14 鐵卟啉修飾電極的選擇性Fig.14 Selectivity of Fe porphyrin-modified electrode

為進(jìn)一步探究該傳感器的選擇性，本次實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)將700 μmol/L 嗎啡溶液與1 000 μmol/L 半胱氨酸、多巴胺、尿酸、丙氨酸、甘氨酸、葡萄糖、抗壞血酸等溶液按照1∶1 比例均勻地混合后的電流響應(yīng)，結(jié)果如表1 所示.嗎啡與干擾物混合后的電流信號(hào)的差值和嗎啡的電流信號(hào)的比值小于5%，表 明了該傳感器具有良好的選擇性.

表1 嗎啡和干擾物混合時(shí)的電流響應(yīng)Tab.1 Current response of morphine mixing with interfering substances

2.7 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性對(duì)修飾有鐵卟啉的電極在630 μmol/L 的嗎啡溶液中連續(xù)測(cè)定5 次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.4%，說明該電極具有很好的重復(fù)性.對(duì)5 根鐵卟啉修飾電極進(jìn)行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為（RSD）為3.5%，證明鐵卟啉修飾電極有良好的重現(xiàn)性，將電極放置了10 d 后，再次在630 μmol/L的嗎啡溶液中測(cè)定，其電流的響應(yīng)信號(hào)依然是最初的電流信號(hào)的82.23%，說明該電極具有較好的穩(wěn)定 性.

2.8 回收率的測(cè)定為了探究該傳感器的使用性能，本實(shí)驗(yàn)在PBS 溶液稀釋的血清中用標(biāo)準(zhǔn)加入法加入不同濃度的嗎啡，采用鐵卟啉/GCE 修飾電極測(cè)定嗎啡的回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，嗎啡的回收率在88.9%～105.3%之間，表明鐵卟啉/GCE 傳感 器對(duì)嗎啡的檢測(cè)具有良好的實(shí)用性.

表2 嗎啡樣品測(cè)定回收率Tab.2 The determination of morphine recovery in samples

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了鐵卟啉材料修飾的玻碳電極，可用于對(duì)嗎啡的直接電化學(xué)檢測(cè)，鐵卟啉材料作為電極的修飾材料，其導(dǎo)電性能較好.通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示該傳感器的選擇性高、重現(xiàn)性好、檢出限低，檢測(cè)時(shí)間為2 min，較為快速.特別是該傳感器具有制備簡(jiǎn)單、使用簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，可以用于真實(shí)血清樣品中嗎啡濃度的快速檢測(cè).