水分活度對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌群生長(zhǎng)的影響

王杠杠， 王似錦， 馬仕洪

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

洋蔥伯克霍爾德菌群(Burkholderiacepaciacomplex，Bcc)是包括洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)在內(nèi)的一系列表型類似且16S rRNA高度同源的革蘭陰性菌的總稱[1-3]，臨床上是引起囊性纖維化(cystic fibrosis)患者、慢性肉芽腫(chronic granulomatous)患者及免疫力低下患者嚴(yán)重感染的條件致病菌[4]。因其復(fù)雜且可變的基因組，Bcc可適應(yīng)低氧環(huán)境，實(shí)現(xiàn)呼吸道上皮黏附，且對(duì)臨床多種抗生素存在耐藥性[5]。一旦感染，患者生命安全會(huì)受到巨大威脅。Bcc廣泛存在于制藥環(huán)境尤其是水系統(tǒng)中，近年來(lái)，屢有發(fā)生藥品及衛(wèi)生用品因污染該菌而召回的案例[6]。目前，Bcc已經(jīng)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)明確為不可接受微生物(objectionable microorganism)，F(xiàn)DA提醒生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)注意非無(wú)菌水基藥品Bcc污染的風(fēng)險(xiǎn)[7]。目前針對(duì)Bcc的控制手段和研究方向主要集中在檢出、鑒定及耐藥性方面，傾向于對(duì)原輔料、中間產(chǎn)品和成品的控制及感染后的治療，而對(duì)于處方控制的關(guān)注較少[8-11]。長(zhǎng)期以來(lái)，水分含量是反映藥品質(zhì)量安全和穩(wěn)定的重要參數(shù)，然而對(duì)于控制藥品微生物污染，水分活度(water activity，Aw)比水分含量更有意義。Aw是相同溫度下產(chǎn)品水蒸氣壓與純水蒸氣壓的比值。1957年，澳大利亞科學(xué)家Scott[12]提出，微生物存在最低生長(zhǎng)Aw，低于該限值微生物將不能生長(zhǎng)。降低Aw會(huì)導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)延滯期延長(zhǎng)，代謝活性降低，生長(zhǎng)速率減慢[13]。因此，Aw測(cè)量和控制可作為微生物風(fēng)險(xiǎn)控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14]。美國(guó)藥典<1112>章節(jié)中指出，測(cè)量非無(wú)菌藥品Aw有助于優(yōu)化處方以提高防腐體系的抑菌效果，降低處方(尤其是液體、膏、乳液和霜)受微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)[8]。本實(shí)驗(yàn)室曾在樣品中分離了一株洋蔥伯克霍爾德菌，其能夠在該樣品的防腐體系中存活和生長(zhǎng)[15]，這意味著B(niǎo)cc對(duì)于含有抑菌劑的非無(wú)菌藥品依然存在風(fēng)險(xiǎn)。研究Aw與Bcc生長(zhǎng)間的關(guān)系可能為此類產(chǎn)品優(yōu)化處方、提高抑菌效果、降低污染風(fēng)險(xiǎn)提供重要依據(jù)。本研究選取2個(gè)Bcc的典型種作為研究對(duì)象，其中洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)2株，新洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacenocepacia)1株，分別在氯化鈉、甘油、蔗糖調(diào)節(jié)的不同Aw條件下培養(yǎng)，通過(guò)全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀繪制生長(zhǎng)曲線，探究不同調(diào)節(jié)劑作用下Bcc最低生長(zhǎng)Aw及Aw對(duì)其生長(zhǎng)曲線的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)2株：CICC10857(=ATCC25416)、201708

01-1(環(huán)境分離菌株)；新洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacenocepacia)1株：20180108-11(環(huán)境分離菌株)。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 氯化鈉(sigma，美國(guó))；甘油(國(guó)藥，上海)；蔗糖(北京糖業(yè)，北京)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB(BD，美國(guó))。

1.1.3 儀器與設(shè)備 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀(Bioscreen，芬蘭)；Aqualab 4TE Duo水分活度測(cè)定儀(Decagon Devices，美國(guó))；BJ-2202S電子天平(Sartorius，德國(guó))；生物安全柜(Nuaire，美國(guó))；復(fù)合型低溫恒溫培養(yǎng)箱(Yamato，日本)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 以氯化鈉、甘油、蔗糖為調(diào)節(jié)劑，配制Aw不同的TSB，滅菌后測(cè)量25 ℃時(shí)Aw。實(shí)驗(yàn)用3組TSB滅菌后Aw實(shí)測(cè)值見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用TSB滅菌后水分活度

1.2.2 菌懸液制備與接種 將凍干菌種接種至10 mL TSB中，32.5 ℃培養(yǎng)18 h，稀釋成105cfu/mL的菌懸液。將不同Aw梯度的TSB與菌懸液加入全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀配套蜂窩板中，每孔加入培養(yǎng)基300 μL、菌懸液10 μL(接入菌量約為103cfu/孔)，每種培養(yǎng)基2個(gè)平行孔。

1.2.3 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析 將蜂窩板放入全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，設(shè)置儀器培養(yǎng)溫度為32.5 ℃，每隔30 min測(cè)量1次吸光度(OD600)，連續(xù)測(cè)量72 h。測(cè)量結(jié)束后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，以O(shè)D600對(duì)時(shí)間作圖，繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bcc最低生長(zhǎng)水分活度

圖1為3株Bcc分別在氯化鈉、甘油、蔗糖調(diào)節(jié)的不同Aw條件下的生長(zhǎng)曲線。初始OD600在0.06～0.10，OD600在72 h內(nèi)始終小于0.11則認(rèn)為該條件下菌株不生長(zhǎng)。當(dāng)Aw≥0.990時(shí)，3組Bcc生長(zhǎng)曲線無(wú)顯著差異，生長(zhǎng)曲線呈S型，培養(yǎng)10 h左右OD600開(kāi)始明顯增加，至30 h左右達(dá)到峰值。氯化鈉組Aw<0.978時(shí)3株Bcc均不生長(zhǎng)；甘油組Aw<0.944時(shí)，3株Bcc均不生長(zhǎng)，Aw=0.944時(shí)僅20170801-1生長(zhǎng)，其余2株不生長(zhǎng)；蔗糖組，Aw<0.971時(shí)3株Bcc均不生長(zhǎng)，Aw=0.971時(shí)僅20180108-11生長(zhǎng)，其余2株不生長(zhǎng)。

圖1 不同水分活度(Aw)條件下Bcc生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bcc under different Aw

由此得到不同調(diào)節(jié)劑作用下3株Bcc最低生長(zhǎng)Aw(表2)。氯化鈉組最低生長(zhǎng)Aw為0.978，甘油組、蔗糖組3株菌結(jié)果略有差異，甘油組最低生長(zhǎng)Aw為0.944～0.955，蔗糖組最低生長(zhǎng)Aw為0.971～0.978。與氯化鈉和蔗糖相比，在甘油作為調(diào)節(jié)劑時(shí)，Bcc可在更低Aw條件下生長(zhǎng)。

表2 不同調(diào)節(jié)劑作用下Bcc最低生長(zhǎng)水分活度(Aw)

2.2 水分活度對(duì)Bcc生長(zhǎng)曲線的影響

在高于最低生長(zhǎng)Aw條件下，Bcc生長(zhǎng)曲線基本呈S形，OD600隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)不同程度增加。以可測(cè)量時(shí)間(time to detection, TTD)、曲線峰值、曲線斜率作為指標(biāo)評(píng)價(jià)Aw對(duì)Bcc生長(zhǎng)曲線的影響。

所有生長(zhǎng)曲線中，甘油組20170801-1在Aw=0.944時(shí)終點(diǎn)OD值最低，約為0.14。取0.11～0.14的中間值0.125作為設(shè)定值，OD600達(dá)到該設(shè)定值的時(shí)間即為該條件下TTD，TTD與延滯期及生長(zhǎng)速率相關(guān)[16]。Aw對(duì)TTD的影響見(jiàn)圖2。氯化鈉組TTD在9～48 h，甘油組TTD在9～56 h，蔗糖組TTD在9～57 h。隨Aw降低TTD延長(zhǎng)，且在接近最低生長(zhǎng)Aw時(shí)，TTD延長(zhǎng)程度增加，3株Bcc之間TTD差異更明顯。不同調(diào)節(jié)劑作用下無(wú)明顯差異。

圖2 水分活度(Aw)對(duì) Bcc生長(zhǎng)曲線TTD的影響Fig.2 Effect of Aw on growth curve TTD of Bcc

曲線峰值一定程度上反映了平臺(tái)期菌液濃度。Aw對(duì)曲線峰值的影響見(jiàn)圖3。氯化鈉組峰值在0.36～2.04，甘油組峰值在0.17～2.36，蔗糖組峰值在0.19～1.98。3株Bcc曲線峰值差異明顯，20170801-1峰值明顯小于其余2株，但Aw對(duì)其峰值影響規(guī)律基本一致：在Aw≥0.988時(shí)，曲線峰值隨Aw降低變化不明顯，部分曲線峰值小幅度上升；在Aw接近最低生長(zhǎng)Aw時(shí)，曲線峰值隨Aw降低明顯下降。不同調(diào)節(jié)劑作用下無(wú)明顯差異，且均在Aw≈0.990時(shí)峰值達(dá)到最大值。

圖3 水分活度(Aw)對(duì)Bcc生長(zhǎng)曲線峰值的影響Fig.3 Effect of Aw on growth curve peak value of Bcc

取生長(zhǎng)曲線S形中段(接近直線上升部分)進(jìn)行線性擬合，所得斜率即為生長(zhǎng)曲線斜率，該斜率反映了該階段比生長(zhǎng)速率。Aw對(duì)曲線斜率的影響見(jiàn)圖4。氯化鈉組斜率為0.011 4～0.125 3，甘油組斜率0.002 4～0.124 8，蔗糖組斜率0.003 5～0.138 3。 3株Bcc曲線斜率差異明顯，20170801-1斜率明顯小于其余2株，但Aw對(duì)其斜率影響規(guī)律基本一致：在Aw≥0.988時(shí)，曲線斜率隨Aw降低變化不明顯，部分曲線峰值小幅度上升；但隨Aw繼續(xù)降低，曲線峰值隨之明顯下降。不同調(diào)節(jié)劑作用下無(wú)明顯差異，且均在Aw≈0.990時(shí)峰值達(dá)到最大值。

圖4 水分活度(Aw)對(duì)Bcc生長(zhǎng)曲線斜率的影響Fig.4 Effect of Aw on growth curve slope of Bcc

3 討 論

本研究表明，培養(yǎng)溫度為32.5 ℃時(shí)，Bcc在不同調(diào)節(jié)劑作用下最低生長(zhǎng)Aw為0.978(氯化鈉)、0.944～0.955(甘油)、0.971～0.978(蔗糖)，菌株之間有微小差異。本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中，通過(guò)定性實(shí)驗(yàn)表明菌株20170801-1在30～35 ℃最低生長(zhǎng)Aw為0.974～0.978(氯化鈉)、0.944(甘油)、0.962～0.965(蔗糖)[17]，與本研究結(jié)果基本一致，且與假單胞菌屬的最低生長(zhǎng)Aw接近[8]。

對(duì)3種調(diào)節(jié)劑所得結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，氯化鈉和蔗糖作用下Bcc最低生長(zhǎng)Aw接近，與之相比甘油作用下則更低。這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致：在討論Aw作用時(shí)，氯化鈉與蔗糖對(duì)大多數(shù)細(xì)菌的影響是相似的，但甘油對(duì)于革蘭陽(yáng)性球菌抑制作用更強(qiáng)，而對(duì)于革蘭陽(yáng)性桿菌及革蘭陰性桿菌抑制作用更弱[18]。

由于OD600生長(zhǎng)曲線與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)所得生長(zhǎng)曲線有所區(qū)別，在細(xì)胞濃度較低時(shí)，OD600無(wú)法及時(shí)反映細(xì)胞數(shù)量變化[16]。因此本研究無(wú)法直接探討Aw對(duì)Bcc生長(zhǎng)延滯期、生長(zhǎng)速率等經(jīng)典參數(shù)的影響，而是選擇TTD、曲線峰值、曲線斜率作為間接指標(biāo)。隨Aw降低，Bcc生長(zhǎng)曲線TTD延長(zhǎng)，曲線峰值及斜率整體呈下降趨勢(shì)。研究結(jié)果可以一定程度上估計(jì)Aw對(duì)Bcc生長(zhǎng)曲線在延滯期、生長(zhǎng)速率的影響，但仍有局限性，后續(xù)可通過(guò)建立Bcc生長(zhǎng)模型進(jìn)一步研究。明確Aw對(duì)Bcc生長(zhǎng)的影響，有助于非無(wú)菌藥品生產(chǎn)企業(yè)在藥品處方設(shè)計(jì)、生產(chǎn)等階段正確評(píng)估Bcc污染的風(fēng)險(xiǎn)，為建立有效控制措施提供依據(jù)。