樟芝深層發(fā)酵液萃取物對食源性致病菌的抑制效果*

陸春雷，趙雨菡，姜金源，徐思玥，任怡琳，王娟娟，冒雅妍，郭影琪，李華祥**

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122）

樟芝（Antrodia cinnamomea），又名牛樟芝、牛樟菇，屬于擔子菌綱（Basidiomycetes） 非褶菌目（Polyporales） 多孔菌科 （Polyporaceae） 薄孔菌屬（Antrodia），是我國臺灣地區(qū)特有的一種食藥兼用大型真菌，具有保肝、抗氧化、抗癌、抗腫瘤、降血脂及調節(jié)免疫等多種生物活性[1-2]。牛樟芝的唯一天然寄主牛樟樹是我國臺灣地區(qū)的特有樹種，數(shù)量稀少且盜伐嚴重，加之野生樟芝生長極其緩慢，導致其子實體資源稀缺、價格昂貴、供不應求[3]。為彌補野生樟芝子實體資源，大規(guī)模人工培養(yǎng)樟芝顯得尤為必要。而基于無性孢子接種的深層發(fā)酵法可快速獲得大量樟芝菌絲體，因此成為目前最主要的樟芝人工培養(yǎng)方式[4-6]。

采用深層發(fā)酵法生產牛樟芝時，人們通常通過離心或過濾的方式獲得樟芝菌絲體，并從樟芝菌絲體中提取三萜、多糖、馬來酸和琥珀酸衍生物及泛醌衍生物等活性物質[3，7]。對分離出樟芝菌絲體后的發(fā)酵液，通常僅單一地提取胞外多糖甚至丟棄處理。而事實上，樟芝深層發(fā)酵液中還含有一些其他活性物質，如5-氧-四氫呋喃-2-甲酸、苯乙酸、4-羥基苯乙醇、2，4-二羥基苯基乙基酮、3-甲基-2，4-二羥基乙酰苯、2，3，4-三氟苯甲酸異丙酯、5，7，8-三甲基-6-氧雜萘鄰酮基乙酸酯、順-10-十二碳烯酸四氫吡喃酯等[8-9]。

此外，趙能等[10]發(fā)現(xiàn)，樟芝發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對13種致病菌（蠟樣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、無乳鏈球菌、短小芽孢桿菌、福氏志賀氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、副溶血性弧菌、溶血性葡萄球菌、銅尿假單胞菌、乙型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌） 均有不同程度的抑制作用。

李娟等[11]也發(fā)現(xiàn)，樟芝發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對7種多重耐藥性人體致病細菌（肺炎克雷伯菌、溶血性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、糞腸球菌、鮑曼不動桿菌、綠膿桿菌） 均有顯著抑制作用，提取物的抑菌效果甚至優(yōu)于氯霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、鏈霉素、四環(huán)素及卡那霉素等抗生素。以上研究結果表明，樟芝深層發(fā)酵液中含有抑菌效果較為顯著的活性物質。

但對于樟芝發(fā)酵液的抑菌活性研究，目前除上述報道外[10-11]，鮮見其他相關研究報道。趙能等[10]所用的原料為發(fā)酵培養(yǎng)60 d的發(fā)酵液，李娟等[11]所用的原料亦為發(fā)酵培養(yǎng)50 d的發(fā)酵液，發(fā)酵周期過長，成本較高；此外，上述研究均只研究了樟芝發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性。

為了進一步開發(fā)樟芝深層發(fā)酵液的實用價值及完善樟芝發(fā)酵液的抑菌活性研究，以成本低廉、深層發(fā)酵10 d的樟芝發(fā)酵液為原料，分別采用氯仿、乙酸乙酯及石油醚等不同極性的有機溶劑萃取樟芝發(fā)酵液活性物質，并研究不同有機溶劑萃取物對食源性致病菌的抑菌活性。研究拓展了樟芝在食品領域的應用范圍，為樟芝發(fā)酵液的進一步有效利用及開發(fā)奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

樟芝（Antrodia camphorate） AC01、金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、霍亂弧菌 （Vibrio cholerae） 23794、 河 流 弧 菌 （ Vibrio fluvialis）1.1609、創(chuàng)傷弧菌 （Vibrio vulnificus） 10383、副溶血性弧菌 （Vibrio parahaemolyticus）、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）1.1593、河流弧菌（Vibrio fluvialis）21612、最小弧菌（Minimal vibrio） 21613、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella sp.）及阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）21545、阪崎腸桿菌21569、阪崎腸桿菌22919，均為揚州大學食品科學與工程學院食品微生物應用與控制實驗室保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、LBS培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基購自生工生物工程（上海） 股份有限公司；樟芝發(fā)酵培養(yǎng)基[12]：葡萄糖2%、酵母浸出粉0.2%、MgSO40.15%、KH2PO40.3%，pH 4.5。

1.2 方法

1.2.1 樟芝的發(fā)酵培養(yǎng)

將靜置培養(yǎng)14 d～20 d的樟芝PDA斜面菌種接種到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，26℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 d，再將產生的孢子按1×106個/mL的接種量接種到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，26℃、150 r·min-1培養(yǎng)10 d后，收集樟芝菌絲體及發(fā)酵液[12]。

1.2.2 樟芝發(fā)酵液活性物質萃取

先將原始樟芝發(fā)酵液旋蒸濃縮3倍體積，再量取100 mL濃縮后的發(fā)酵液，按發(fā)酵液∶有機溶劑1∶1的比例分別加入氯仿、石油醚及乙酸乙酯，于37℃恒溫振蕩器中震蕩2 h，取有機溶劑層萃取液，蒸干并稱重。重復上述提取操作3次，所得干物質用適量體積的二甲基亞砜（DMSO）復溶，使萃取物終濃度為 50 mg·mL-1[12]。

1.3 供試菌的培養(yǎng)及稀釋

將霍亂弧菌、河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌、哈氏弧菌、河流弧菌及最小弧菌接種于LBS培養(yǎng)基中，將金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌及阪崎腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，于37℃靜置培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)好的細菌用無菌生理鹽水以10倍梯度稀釋涂布法（共稀釋10個梯度，每個稀釋梯度3個重復）進行菌落計數(shù)，隨后根據菌落計數(shù)結果將各菌液用生理鹽水稀釋到菌體濃度為1×105CFU·mL-1后用于后續(xù)試驗。

1.4 抑菌譜的測定

采用牛津杯法測定樟芝發(fā)酵液萃取物的抑菌譜[13]。吸取100 μL稀釋好的各細菌菌懸液并均勻涂布于LB固體瓊脂平板上（弧菌所用培養(yǎng)基為LBS培養(yǎng)基），再用鑷子將無菌牛津杯輕輕放在培養(yǎng)基上并做好標記并編號，將200 μL樟芝發(fā)酵液不同溶劑萃取物加入相應編號的牛津杯中，設置DMSO溶劑對照組，每組設置3個重復。隨后將平板放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃靜置培養(yǎng)12 h后，取出觀察并測量抑菌圈的直徑，根據抑菌圈直徑判斷樟芝提取物對測試菌的抑制效果。

1.5 最小抑菌濃度的測定

采用二倍稀釋法測定樟芝發(fā)酵液萃取物對測試菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[14]。將樟芝發(fā)酵液萃取物原液按二倍梯度稀釋，再分別吸取100 μL不同稀釋濃度的樟芝發(fā)酵液萃取物溶液及稀釋好的各細菌菌懸液于96孔板的小孔中，以添加100 μL DMSO的孔作為溶劑對照組，以添加100 μL無菌生理鹽水的孔作為空白對照組，每組設6個重復。再將96孔板置于搖床中，37℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h，取出檢測OD600值，并根據OD600值計算抑菌率（I，%），計算公式為：

式中：A1為空白對照組OD600值；A2為處理組OD600值。

同時輔以肉眼觀察各孔中的菌落生長情況。將溶劑無抑菌效果（抑菌率為0）且提取液完全抑菌（抑菌率為100%）時所對應的最低濃度視為相應的最小抑菌濃度。

1.6 平板菌落計數(shù)法測定抑菌率

為了進一步明確樟芝發(fā)酵液不同溶劑萃取物的抑菌效果，采用平板菌落計數(shù)法[15-16]對抑菌率進行測定以驗證其抑菌效果。在裝有5 mL LB液體培養(yǎng)基（弧菌所用培養(yǎng)基為LBS培養(yǎng)基） 的20 mL試管中接種100 μL稀釋好的各細菌菌液，再分別加入100 μL樟芝發(fā)酵液石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及氯仿萃取物，并設置空白對照（添加100 μL生理鹽水） 和溶劑對照（添加100 μL的DMSO），每組設置3個重復。將試管置于搖床中，37℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 h，取樣進行平板涂布及菌落計數(shù)，根據菌落數(shù)結果計算不同樟芝發(fā)酵液萃取物對測試菌株的抑菌率。

2 結果分析

2.1 樟芝發(fā)酵液萃取物抑菌譜的測定

按1.4中的方法，檢測不同樟芝發(fā)酵液萃取物對14種食源性致病菌的部分抑菌譜，結果見表1。

由表1可知，樟芝發(fā)酵液氯仿萃取物的抑菌范圍最廣，對14株測試菌均有明顯抑制效果；其次為樟芝發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物，對除大腸桿菌和阪崎腸桿菌以外的10株測試菌均有明顯抑制效果；樟芝發(fā)酵液石油醚萃取物僅對金黃色葡萄糖球菌、大腸桿菌、沙門氏菌及阪崎腸桿菌有抑制效果?？傮w而言，樟芝發(fā)酵液萃取物對測試菌均有抑制效果，其中對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌最為顯著。

2.2 樟芝發(fā)酵液萃取物的最小抑菌濃度

在檢測出3種樟芝發(fā)酵液萃取物的抑菌譜后，采用二倍稀釋法進一步檢測了不同樟芝發(fā)酵液萃取物對測試菌株的最小抑制濃度，結果見表2。

表2 樟芝不同發(fā)酵液萃取物對測試菌的最小抑菌濃度Tab.2 The minimum inhibitory concentrations of different extracts from submerged fermentation broth of Antrodia camphorata on test bacteria

由表2可知，樟芝發(fā)酵液氯仿萃取物確實對所有測試菌有良好的抑制效果。其中，對7種弧菌的抑制作用稍弱，最小抑菌濃度均為3.125 mg·mL-1；對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌及阪崎腸桿菌的抑制效果較好，最小抑菌濃度均為1.565 mg·mL-1。樟芝發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對所有弧菌有較好的抑制效果，最小抑菌濃度均為1.565 mg·mL-1；對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及沙門氏菌亦有顯著抑制效果，最小抑菌濃度均為3.125 mg·mL-1。樟芝發(fā)酵液石油醚萃取物的抑菌譜較窄，且抑菌效果比氯仿萃取物及乙酸乙酯萃取物弱，僅對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌及阪崎腸桿菌有明顯抑制效果，且最小抑菌濃度相對較大，均為 12.5 mg·mL-1。

2.3 樟芝發(fā)酵液萃取物抑菌率的測定

為了進一步明確各樟芝發(fā)酵液萃取物的抑制效果，采用平板菌落計數(shù)法，測定各樟芝發(fā)酵液萃取物在最小抑菌濃度下對測試菌的抑菌率。從上述試驗結果可知，各樟芝發(fā)酵液萃取物對不同編號的阪崎腸桿菌及不同種類的弧菌作用效果一致。因此在本試驗中，以副溶血性弧菌為弧菌類測試菌的代表，以阪崎腸桿菌21569為阪崎腸桿菌的代表進行測試，結果見表3。

表3 不同樟芝發(fā)酵液萃取物對測試菌的抑制率Tab.3 The antibacterial rate of different extracts from submerged fermentation broth of Antrodia camphorata

由表3的數(shù)據可以看出，樟芝發(fā)酵液各萃取物在最小抑菌濃度下對目標菌的抑制率為（63.8±2.9）%～（92.7±4.3）%，對沙門氏菌的抑制率最高，為 （83.2±4.1）%～（92.7±4.3）%。其中，樟芝發(fā)酵液氯仿萃取物對其目標菌的抑制率均在75%以上，對沙門氏菌的抑制率最大，達到（92.7±4.3）%；樟芝發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對沙門氏菌的抑制率也最大，為（83.2±4.1）%，對副溶血性弧菌亦有較為顯著的抑制效果，抑菌率為（82.7±2.8）%；樟芝發(fā)酵液石油醚萃取物對金黃色葡萄球菌的抑制率最低，為（63.8±2.9）%，對沙門氏菌的抑制率最高，為（91.3±3.8）%，其萃取物對其他目標菌的抑制率均在71%以上。

3 討論

樟芝由于具有出眾且多樣的生物活性，近年來已成為食（藥） 用菌領域的研究熱點。研究表明，樟芝除具有解酒保肝等功能外，還具有突出的抑菌活性[17]。

如Geethangili等[18]發(fā)現(xiàn)，樟芝氯仿提取物及正己烷提取物對引起胃炎的幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）有顯著抑制作用；Lien等[19]發(fā)現(xiàn)樟芝乙醇提取物、乙酸乙酯提取物及氯仿提取物均對口腔細菌變異鏈球菌（Streptococcus mutans） 和牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis） 有顯著抑制作用，其最小抑菌濃度為 4 μg·mL-1～16 μg·m-1；楊淑賢等[20]發(fā)現(xiàn)樟芝中三萜對金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用，且對金黃色葡萄球菌的抑制效果最顯著；汪雯翰等[21]發(fā)現(xiàn)樟芝氯仿及正丁醇提取物對金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌均有顯著的抑制效果。樟芝菌絲體中含有豐富的抑菌活性物質。

已有的報道中對樟芝在發(fā)酵過程中產生的胞外抑菌活性物質研究較少。因此，為了進一步開發(fā)樟芝的價值并完善樟芝發(fā)酵液活性物質的抑菌活性研究，分別采用氯仿、乙酸乙酯及石油醚等不同極性的有機溶劑萃取樟芝發(fā)酵液活性物質，并檢測其對食源性致病菌的抑菌活性。結果表明，樟芝發(fā)酵液氯仿萃取物抑菌譜最廣，對14株測試菌均有顯著的抑制效果；其次為樟芝發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物，可抑制14株測試菌中的10株菌株。2種萃取物對目標菌株的最小抑菌濃度最低可達1.565 mg·mL-1，抑菌效果較為顯著。研究結果是對樟芝抑菌活性研究的重要補充，并證實了樟芝在深層發(fā)酵過程中會產生抑菌效果顯著的胞外活性物質，拓展了樟芝的應用范圍及價值，為進一步分離樟芝抑菌活性物質并用于開發(fā)新型食品抑菌劑提供了理論依據并奠定了基礎。

4 結論

采用牛津杯法及二倍梯度稀釋法檢測了不同樟芝發(fā)酵液萃取物對14株食源性致病菌的抑制效果及最小抑菌濃度。結果發(fā)現(xiàn)，樟芝發(fā)酵液氯仿萃取物的抑菌譜最廣，對14株致病菌均有較好的抑制效果，其次為樟芝發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物。樟芝發(fā)酵液萃取物的最小抑菌濃度為1.565 mg·mL-1～12.500 mg·mL-1。采用平板菌落計數(shù)法測定了不同樟芝發(fā)酵液萃取物對測試菌的抑菌率。結果表明，樟芝發(fā)酵液各萃取物在最小抑菌濃度下對目標菌的抑制率為（63.8±2.9）%～（92.7±4.3）%，對沙門氏菌的抑制率最高，為 （83.2±4.1）%～（92.7±4.3）%，對副溶血性弧菌亦有較顯著的抑制效果。