李墨釗，熱米拉·阿扎提，鄭曉冬，周文文*

（1浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州 310058 2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 武漢 430070）

新疆奶疙瘩是一類歷史悠久的結(jié)晶狀發(fā)酵酸奶，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)價值豐富，可加速人體代謝，提升人體抵抗力及提供維生素和礦物質(zhì)，成為深受哈薩克族和維吾爾族等少數(shù)民族喜愛的傳統(tǒng)食品。乳酸菌作為食品發(fā)酵中的重要微生物，是乳制品生產(chǎn)過程中的優(yōu)勢菌種。作者對新疆奶疙瘩開展研究，從中分離出多種乳酸菌，通過特定生化指標的測定篩選出有益生特性的優(yōu)質(zhì)乳酸菌資源[1]。課題組阿扎提等[2]對奶疙瘩中相關(guān)菌株進行分離純化，篩選獲得鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）R4 和瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）S4 等代表性菌株。秀麗隱桿線蟲具有生命周期短，易于培養(yǎng)和與哺乳動物的高相似性等特征，可作為益生菌動物模型建立的良好材料，一直被認為是人體衰老領(lǐng)域研究的首選模式生物[3]。

本試驗選用奶疙瘩樣品，對其含有的益生菌進行高通量測序，研究其菌群多樣性，確定優(yōu)勢菌群。前期對不同益生菌種的耐酸耐膽鹽、疏水性、抑菌性及抗氧化等生化特性進行測定，從中分離篩選得到具有良好益生特性的菌株鼠李糖乳桿菌R4。本文以秀麗隱桿線蟲為研究模型，研究R4 對其正常生理、生化指標（線蟲壽命、產(chǎn)卵量、運動能力、熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激抵抗能力）的影響，探究R4的抗衰老作用，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析其延壽機制，為進一步開發(fā)高效微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑 奶疙瘩樣品來自新疆維吾爾族自治區(qū)5 個地區(qū)（烏魯木齊市、伊犁市、塔城市、阿泰勒地區(qū)和石河子南山地區(qū)） 的牧民家庭（圖1），制作工藝采取家庭式傳統(tǒng)方法發(fā)酵，輸送途中用冰袋保藏，在實驗室中4 ℃保存。

圖1 來源于新疆不同區(qū)域的5 個奶疙瘩樣品Fig.1 Five samples of milk knots from different regions in Xinjiang

瓊脂糖、蛋白酶K、MgCl2、Platinum-DNApolymerase、dNTP-mix、PCR Buffer I、Chelex 裂解液、脫脂乳、M9 緩沖溶液、線蟲凍存緩沖液、S medium、同期化漂白液、NGM 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基，杭州索萊爾博奧生物技術(shù)有限公司。鼠李糖乳桿菌R4（L.rhamnosus R4），本實驗室分離保存。大腸桿菌（E.coli ）OP50 和野生型秀麗隱桿線蟲（C.elegans Bristol）N2 株，浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院杜愛芳教授惠贈。

1.1.2 主要設(shè)備與儀器 MLS-3750 型全自動滅菌鍋，日本Sanvo 公司；電子天平，德國Sartotious公司；AF-100 型離心機，中國湘儀集團；Research plus 8 道移液器，德國Eppendorf 公司；WB-14 恒溫水浴鍋，德國Memmert 公司；Spectra mas Plus 384 型酶標儀，美國MD 公司；AF-100 型制冰機，上海Scotsman 公司；HiSeq 2000 型Illumina 測序儀，美國Illumina 公司；PTC-225Thermal PCR 儀，美國伯樂（Bio-Rad） 公司；StepOne 型定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）公司；LRH-250 型培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；U-RFL-T 型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 采用SDS-CTAB 法提取樣品中菌種宏基因組DNA，通過紫外分光光度法測定其濃度，瓊脂糖凝膠電泳判斷其分子質(zhì)量，加入無菌水稀釋至樣品質(zhì)量濃度為1 ng/μL。

1.2.2 16 S rRNA V4 區(qū)、18S rRNA V4 及V9 區(qū)的PCR 擴增及高通量測序 以稀釋后的基因組DNA 為模板，對16S rRNA V4 區(qū)、18S rRNA V4及V9 區(qū)進行PCR 擴增。引物使用帶Barcode 的特異引物，對應(yīng)區(qū)域：ITS1 區(qū)引物是ITS1-5FITS2；ITS2 區(qū)引物是ITS2-3F-ITS2-4；16S V4 區(qū)引物是515F-806R；18S V4 區(qū)引物是528F-706R；18S V9 區(qū)引物是1380F-1510R。使用PCR反應(yīng)預(yù)混液Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer（New England Biolabs 公司）擴增。PCR 過程中使用高效酶，以保證反應(yīng)的擴增效率和準確性。

按照高通量測序標準流程進行測試，構(gòu)建PCR 產(chǎn)物文庫，通過DNA 測序儀IUumina HiSeq 2000 對其進行雙末端測序。為確保reads 的高質(zhì)量，去除低復(fù)雜度、低質(zhì)量序列及接頭序列，得到clean reads，通過Overlap 拼接軟件SOAP denovoV.1.0（華大自主產(chǎn)權(quán)）進行Overlap 拼接[4]。加入兩端PCR 引物并確保引物3’端保守，處理后得到拼接后一致的序列，形成tag 序列并通過Mothur軟件統(tǒng)計其豐度[5]。

1.2.3 線蟲的同期化 秀麗隱桿線蟲在NGM 培養(yǎng)基經(jīng)72 h 以上的培育，部分轉(zhuǎn)移成熟蟲體至新平板開始培育、產(chǎn)卵。用5 mL M9 緩沖液洗至離心管中，1200 r/min 離心3 min，倒去上清。加入5 mL 新配的同期化漂白液，激烈振蕩3 min，再次離心2 min，倒去上清。重復(fù)第1 步離心操作3 次，保留最后一次上清液2 mL，搖勻后轉(zhuǎn)入不含大腸桿菌OP50 的平板中，20 ℃靜置過夜后接種至NGM培養(yǎng)基。20 ℃培養(yǎng)20 d，此時線蟲受精卵發(fā)育至L4 期，同期化完成。

1.2.4 線蟲壽命及產(chǎn)卵、運動、氧化應(yīng)激和熱應(yīng)激等表觀性狀 將線蟲分為對照組和給藥組。OP50為對照組，鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）R4 為實驗組，每組100 條。每天將其轉(zhuǎn)移到新板上，20 ℃培養(yǎng)。當(dāng)成蟲不再產(chǎn)卵后，每2 d 挑取線蟲1 次，直到線蟲全部死亡時停止，使用軟件SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)[6]。重復(fù)壽命實驗3 次，繪制圖表。

將等數(shù)目同期化的對照組和實驗組線蟲挑取到各自平板中，每個平板1 條，產(chǎn)卵后以12 h 為周期轉(zhuǎn)移，直至線蟲不再具有生殖能力。培養(yǎng)所有留有線蟲的平板，統(tǒng)計蟲卵孵化至L4 期的成蟲數(shù)量，即待測線蟲的產(chǎn)卵量。

隨機選取對照組和實驗組中的線蟲，以4 d為1 個周期培養(yǎng)，以其1 min 內(nèi)運動的次數(shù)作為擺動頻率的計數(shù)依據(jù)，分別記錄2 組線蟲的擺動頻率數(shù)據(jù)，觀測其運動能力。

將同期化至L4 的線蟲分為對照組和實驗組，每組有30 條，分別喂食大腸桿菌OP50 和乳酸菌，3 d 后將其轉(zhuǎn)入溶液濃度為20 mmol/L 的過氧化氫中靜置2 h，隨后將線蟲挑到NGM 培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱內(nèi)20 ℃處理16 h，每小時統(tǒng)計線蟲存活率，測定抗氧化應(yīng)激能力[7]。重復(fù)實驗3 次。

同期化對照組和實驗組線蟲至產(chǎn)卵期，各取出30 條轉(zhuǎn)移至NGM 培養(yǎng)基（含OP50）中35 ℃熱敷16 h 以上，統(tǒng)計其存活情況，分析線蟲抗熱激能力。當(dāng)線蟲對機械性刺激不再產(chǎn)生反應(yīng)時，記錄為已死亡[8]。

線蟲成熟后再持續(xù)培養(yǎng)48 h，實驗組加入乳酸菌，對照組加入大腸桿菌OP50。2 組線蟲使用M9 緩沖液洗滌，冷凍、離心、冰浴破碎，提取上清液。SOD 酶活、CAT 酶活、MDA 含量用對應(yīng) 的SOD、CAT 和MDA 檢測試劑盒測定。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組重測序與實時定量PCR 分析 對提取的線蟲樣本RNA 使用DNA 聚合酶I 處理DNA 后用含有Oligo（dT）的磁珠對其mRNA 進行富集；添加打斷試劑，將mRNA 打斷成許多短片段，以這些短片段為模板合成一鏈cDNA；隨后配制相應(yīng)反應(yīng)體系以合成二鏈cDNA，經(jīng)純化回收，修復(fù)黏性末端，cDNA 的3’端添加腺嘌呤“A”，連接接頭，篩選片段大小，進行PCR 擴增反應(yīng)，構(gòu)建cDNA 文庫；對構(gòu)建好的文庫進行質(zhì)檢和測序[9]。將過濾后的數(shù)據(jù)比對到參考基因組上，得到新轉(zhuǎn)錄版本，將其加入?yún)⒖蓟蛐蛄蝎@得完整的參考序列，計算基因表達水平。參考KEGG 注釋情況和官方分類，對差異基因在代謝通路上進行分類，聚集表達相近的基因成類，用R 軟件phyper 函數(shù)富集分析差異基因，研究其作用及其所在信號通路。

對提取的線蟲總RNA 進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，對照已知秀麗隱桿線蟲的衰老相關(guān)基因，對照Wormbase 及GenBank 中的序列用Primer 軟件設(shè)計引物，按照熒光定量PCR 反應(yīng)預(yù)混液Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG with ROX（Invitrogen 公司）試劑盒的方法進行實時定量PCR。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 實驗重復(fù)3 次，取平均值，使用SPSS 16.0 軟件，通過方差分析進行統(tǒng)計學(xué)檢驗。全部實驗數(shù)據(jù)表示為±s，當(dāng)P<0.05 時具統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌相分析

2.1.1 樣品細菌總PCR 擴增結(jié)果 5 個樣品細菌總DNA 經(jīng)PCR 擴增，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2。其中RS1.1、RS1.2、RS1.3、RS1.4 和RS1.5 分別由條帶4，5，6，16 及17 表示，5 個樣品的條帶均清晰明亮。測定樣品的密度分布大于50 ng/μL，總量大于100 μL，說明樣品符合測試要求，可進一步實驗。

圖2 16S rDNA V6 區(qū)PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR products of V6 region in 16S rDNA

2.1.2 高通量測序結(jié)果分析 5 個奶疙瘩樣品經(jīng)測序得到3.10 Gb 原始數(shù)據(jù)，對5 個樣品的全部Effective Tags 序列聚類成為OTUs，并對tags 序列去冗余，選出unique tags 序列[10]。根據(jù)物種注釋特征，對比這5 個樣品序列，比較16S rDNA V6 區(qū)域的初始數(shù)據(jù)和獲得的tags 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)選出的unique tags 序列處于“屬”這一分類單元。選出最大相對豐度前10 名的屬對應(yīng)OTUs 的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的數(shù)據(jù)和對應(yīng)OTUs 的相對豐度信息（圖3）。測序結(jié)果表明奶疙瘩樣品中的鏈球菌屬（Streptococcus）、假單胞屬（Pseudomonas）、乳球菌屬（Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）為其優(yōu)勢菌群。其中，在除RS1.1 樣品外的4 個樣品中乳酸菌屬均為優(yōu)勢菌，即：乳酸菌在RS1.2 樣品中有34.10%，在RS1.3 中有17.93%，在RS1.4 中達54.53%，在RS1.5 中也達40.05%。對比5 個樣品菌群含量，推測RS1.1 中高含量的假單胞菌屬可能是在家庭作坊生產(chǎn)時被污染產(chǎn)生的。

圖3 OTUs 豐度聚類圖Fig.3 Operational taxonomic units abundance clustering diagram

2.2 代表性乳酸菌R4 的性質(zhì)及對線蟲生理、生化指標的影響

2.2.1 鼠李糖乳桿菌R4 的性質(zhì) 前期研究[2]表明，鼠李糖乳桿菌R4 為樣品中乳桿菌屬中功效優(yōu)良的益生菌。在pH 3.0 和0.3%膽鹽濃度條件下分別處理3 h 后，鼠李糖乳桿菌R4 分別具有87.1%和74.9%的存活率，最高的抗氧化活性，對膽固醇和甘油三酯降解率高達50.97%[11]。基于其優(yōu)良性質(zhì)對R4 飼喂的線蟲在不同條件下實驗，進一步探究R4 的功效。

2.2.2 鼠李糖乳桿菌R4 對線蟲產(chǎn)卵量和運動能力的影響 線蟲的產(chǎn)卵量和運動能力可作為線蟲壽命的相關(guān)指標，用于全面評價乳酸菌對其的抗衰老作用。產(chǎn)卵為線蟲機體生長發(fā)育的有效生物指標之一。實驗中，將秀麗線蟲分別放在涂有R4和大腸桿菌OP50 兩種菌株的已滅活組、活菌和上清液的NGM 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，60 h 后分別計數(shù)各培養(yǎng)基中線蟲的產(chǎn)卵數(shù)（圖4）。飼喂R4 活菌的實驗組線蟲產(chǎn)卵數(shù)量為347.2±4.53，而飼喂OP50 活菌的對照組的產(chǎn)卵量為315.4±8.99。飼喂滅活R4 菌株的實驗組產(chǎn)卵量為323.5±3.61，對照組的產(chǎn)卵量為306.2±5.90。上述結(jié)果表明，R4 菌株的3 種處理方式均對線蟲的生殖系統(tǒng)沒有產(chǎn)生明顯影響，反而有一定的促進作用。

圖4 鼠李糖乳桿菌R4 對線蟲產(chǎn)卵量的影響Fig.4 Effect of L.rhamnosus R4 on nematodes brood sizes

線蟲的肌肉功能強、弱可由其運動狀態(tài)測定，其運動能力隨年齡增長而下降，于是將8日齡秀麗線蟲的壽命作為指標，探究R4 對其運動能力的影響[11]。線蟲運動軌跡見圖5，身體擺動頻率的測定結(jié)果顯示：實驗組中喂食R4 的線蟲在20 s 內(nèi)身體擺動頻率為11.73±1.82，均大于對照組（OP50）11.35±0.91，然而無顯著性差異。在第8～12天內(nèi)，與對照組相比，實驗組秀麗線蟲的運動能力和活躍程度顯著增強，死亡數(shù)量顯著降低（圖6）。運動能力的減弱會導(dǎo)致線蟲需要的能量減少和呼吸水平降低，進而氧化損傷減少，這說明R4 延緩線蟲衰老。

圖5 線蟲的運動軌跡（放大為25 倍）Fig.5 The actions of C.elegans（at 25×magnification）

圖6 鼠李糖乳桿菌R4 對線蟲運動能力的影響Fig.6 Effect of L.rhamnosus R4 on the movements of C.elegans

2.2.3 鼠李糖乳桿菌R4 對線蟲壽命的影響 前面研究表明，鼠李糖乳桿菌R4 與大腸桿菌OP50飼喂組相比，R4 飼喂蠕蟲的平均壽命增加，R4供體蟲的壽命為（31.05±0.54）d，比對照蟲的壽命（22.81±0.62）d 長36.1%[2]。本研究對反映線蟲存活能力的重要指標——熱激壽命和氧化應(yīng)激壽命進行探討。在抗熱激實驗中，與對照組的（8.34±1.51）h 相比，R4 明顯延長了線蟲的平均壽命至（12.55±0.68）h。線蟲對過氧化氫導(dǎo)致的氧化損傷的耐受能力也明顯升高39.9%，其平均壽命達（9.78±1.86）h，延緩壽命趨勢明顯（圖7）。在壓力條件下，鼠李糖乳桿菌R4 對線蟲的抗氧化應(yīng)激能力的顯著提高可能是其對延緩線蟲壽命的機制之一[12]，這說明在不良環(huán)境下，奶疙瘩中乳酸菌對線蟲有一定的保護作用。

圖7 不同條件下鼠李糖乳桿菌R4 對線蟲平均壽命的影響Fig.7 Effects of different conditions on the lifespan of C.elegans with L.rhamnosus R4

2.2.4 鼠李糖乳桿菌R4 對線蟲生化指標的影響SOD 與CAT 的表達同線蟲抵御環(huán)境氧化應(yīng)激相關(guān)。用R4 處理后的秀麗線蟲體內(nèi)SOD 與CAT等抗氧化酶的活力顯著提高（圖8），這印證了R4能夠增強線蟲抵御環(huán)境氧化應(yīng)激能力的結(jié)果，說明其通過提高線蟲體內(nèi)SOD 和CAT 等的酶活來提高其抗氧化應(yīng)激水平。對比對照組CAT 酶活（33.57±4.52）U/mg，R4 活菌處理組中CAT 酶活明顯提高到（47.43±0.85）U/mg；上清液處理組中CAT 酶活（23.01±2.87）U/mg 雖比對照組OP50（25.63±3.46）U/mg 稍有減少，但差異不顯著。而R4 滅活組CAT 酶活與OP50 對照組相比大幅降低，表明R4 活菌的CAT 酶活力最強。從圖8可以發(fā)現(xiàn)，喂食R4 活菌、上清液和滅活菌體等3 種處理組的線蟲體內(nèi)MDA 含量均顯著降低，表明鼠李糖乳桿菌R4 具有抗脂質(zhì)過氧化的作用。

圖8 鼠李糖乳桿菌R4 對線蟲體內(nèi)生化指標的影響Fig.8 Effects of L.rhamnosus R4 on antioxidative enzymes of C.elegans

2.3 轉(zhuǎn)錄組與基因轉(zhuǎn)錄分析

轉(zhuǎn)錄組測序顯示，飼喂鼠李糖乳桿菌R4 的線蟲體內(nèi)出現(xiàn)大量與編碼壽命相關(guān)蛋白的基因和次級代謝通路基因轉(zhuǎn)錄變化。這其中影響線蟲壽命的蛋白為乙酰輔酶A 脫氫酶（acdh-1）、卵黃原蛋白（vit-4）、脂肪酸脫氫酶（fat-7）和脂肪酸結(jié)合蛋白等。同時，線蟲在一定濃度的R4 影響下氧化還原，與物質(zhì)代謝的相關(guān)基因也受到影響，主要有：過氧化氫酶（ctl-1）、3-羥酰-輔酶A 脫氫酶（hacd-1）、超氧化物歧化酶（sod-3）、飲食限制下調(diào)蛋白（drd-1）、水化酶（ech-7）以及脂肪酸結(jié)合蛋白（fat-5）。此外，秀麗線蟲體內(nèi)daf-16 基因的表達水平出現(xiàn)明顯上調(diào)（6.12 倍），其在胰島素信號通路中起關(guān)鍵作用。鼠李糖乳桿菌R4 能抑制水化酶和乙酰輔酶A 脫氫酶（Enoyl-CoA Hydratase和Acyl CoA Dehydrogenase） 等合成基因的表達（E 值均為0）。

隨機對線蟲體內(nèi)與抗衰老有關(guān)的基因進行RT-PCR 測試，以增強測序結(jié)果的可信性，發(fā)現(xiàn)顯著影響的6 個基因，如圖9所示。在氧化應(yīng)激條件下，以管家基因gpd-1 為內(nèi)參，用R4 處理的線蟲體內(nèi)sod-3、hsp-16.2、ctl-1 和daf-16 基因的mRNA 水平均明顯升高。該實驗表明在氧化應(yīng)激條件下，R4 在激活線蟲表達sod-3 的同時，也顯著上調(diào)熱激蛋白hsp-16.2 的表達量。sod-3 基因編碼的蛋白具有清除生物體內(nèi)過量的超氧化物自由基的功能，可以阻止細胞的氧化損傷；熱激蛋白在生長溫度過高時幫助新合成的肽鏈正確折疊、伸展以發(fā)揮正常功能，保持生物活性，防止蛋白質(zhì)變性，有效避免細胞受到熱損傷。研究結(jié)果表明：在氧化應(yīng)激條件下，鼠李糖乳桿菌R4 可通過daf-16轉(zhuǎn)錄因子的激活促進下游sod-3 基因的激活，使細胞獲得氧化應(yīng)激保護。

圖9 鼠李糖乳桿菌R4 對線蟲體內(nèi)與衰老相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.9 Influences of L.rhamnosus R4 on the mRNA expression of ageing-associated genes in C.elegans

daf-2 基因主要負責(zé)線蟲體內(nèi)壽命延長和發(fā)育停滯的調(diào)控，與能量攝取緊密聯(lián)系，被認為作用于胰島素信號通路的下游抑制daf-16 表達[13]。然而，實驗結(jié)果顯示，daf-2 對daf-16 沒有產(chǎn)生抑制作用，說明R4 并非直接抑制daf-2 來激活daf-16，同時說明R4 對daf-2 的影響較小，對daf-16的影響較大。由此可推斷鼠李糖乳桿菌R4 對線蟲壽命的調(diào)控可能依賴于daf-16/FOXO 信號通路，通過激活通路下游抵抗壓力的基因來清除自由基，從而減慢衰老。經(jīng)R4 處理后，秀麗線蟲體內(nèi)sir-2.1 與daf-2 基因mRNA 的表達水平的明顯下調(diào)，說明鼠李糖乳桿菌R4 或許通過Insulin/IGF-1通路參與線蟲壽命的正向調(diào)控，延緩衰老。

Insulin/IGF-1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的sod-3 轉(zhuǎn)錄水平的提高同樣證明R4 可以激活下游轉(zhuǎn)錄因子daf-16。影響線蟲發(fā)育的“生物鐘”基因ctl-1 是daf-16 的下游基因，其表達量的上調(diào)也進一步證實R4 激活了daf-16 的轉(zhuǎn)錄活性。本研究表明鼠李糖乳桿菌R4 對線蟲的正向保護作用依賴于daf-16/FOXO 通路。此外，本文推測R4 的作用可能是通過曲線調(diào)節(jié)，即以間接的方式實現(xiàn)調(diào)控。當(dāng)氧化壓力較大時，R4 通過調(diào)節(jié)sir-2.1 基因的表達，從而進一步調(diào)控壽命。通常情況下R4 對壽命的正調(diào)控多被認為是通過sir-2.1 實現(xiàn)的。

3 結(jié)論

本研究對新疆奶疙瘩進行菌群分析，對其中的高活性益生菌鼠李糖乳桿菌R4，以秀麗隱桿線蟲為模型，測試其對線蟲壽命及其它生理、生化指標的影響，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組重測序等手段揭示其對線蟲壽命的調(diào)節(jié)方式。R4 處理的秀麗線蟲的產(chǎn)卵率和運動頻率上升，對熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激脅迫的抵抗力有所提高，同時線蟲體內(nèi)SOD 和CAT 酶活顯著升高，而MDA 的含量下降?？梢奟4 具有較強的延壽作用。實驗顯示：該菌株的活菌不僅可以延緩線蟲壽命，還能夠保護線蟲在不良環(huán)境下免受機體損傷。對壽命和衰老相關(guān)基因的監(jiān)測表明，乳酸菌R4 主要影響daf-16、daf-2、sir-2.1、ctl-1、hsp-16.2 和sod-3，R4 主要通過激活胰島素信號通路（Insulin/IGF pathway）下游的daf-16 基因增強抗應(yīng)激能力和延長壽命。R4 活菌處理組對秀麗線蟲sod-3 mRNA 水平的上調(diào)表明其對daf-16轉(zhuǎn)錄因子的激活作用。而daf-16 的下游基因ctl-1表達量的上調(diào)也證實鼠李糖乳桿菌R4 活菌激活了daf-16 的轉(zhuǎn)錄活性。