健腰密骨片中丹酚酸B的質(zhì)量控制方法建立

趙曉玲 商曉慧 詹常森

摘 要 目的：建立健腰密骨片中丹酚酸B 的質(zhì)量控制方法。方法：通過(guò)條件摸索，建立復(fù)方健腰密骨片中丹酚酸B薄層色譜定性鑒別方法和高效液相色譜定量檢測(cè)方法。結(jié)果：制劑中丹酚酸B在薄層層析板上顯示一清晰斑點(diǎn)、且重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)、陰性對(duì)照無(wú)干擾。HPLC測(cè)定顯示丹酚酸B在0.191～15.291 mg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=1 190.30X-253.63，r=0.999 9；平均加樣回收率及RSD分別為96.72%和1.46%。 結(jié)論：新建的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為健腰密骨片中丹酚酸B的質(zhì)量控制方法，可以更好地保證制劑的整體質(zhì)量，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

關(guān)鍵詞 健腰密骨片 丹酚酸B 薄層色譜鑒別 高效液相色譜

中圖分類號(hào)：R927.2； R286 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2021）13-0073-04

Establishment of a quality control method for the determination of salvianolic acid B in Jianyao Migu tablets

ZHAO Xiaoling， SHANG Xiaohui， ZHAN Changsen

（Shanghai Hutchison Pharmaceuticals， Shanghai 201401， China）

ABSTRACT Objective： To establish a quality control method of salvianolic acid B in Jianyao Migu tablets. Methods： A thin-layer chromatography （TLC） method for qualitative identification and an HPLC method for the quantitative determination of salvianolic acid B were established by condition tests. Results： Salvianolic acid B in the preparation showed a clear spot on TLC， which was reproducible and specific without the interference of negative control. The calibration curve of salvianolic acid B by HPLC was linear in the range of 0.191-15.291 μg and regression equation was Y=1 190.30X-253.63， r=0.999 9. The average recovery ratio was 96.72% and the relative standard deviation was 1.46%. Conclusion： The established new methods are simple， rapid， accurate and reproducible and can be used as the quality control of salvianolic acid B in Jianyao Migu tablets and can better guarantee the overall quality of the preparation and has strong practicability.

KEy WORDS Jianyao Migu tablets； salvianolic acid B； thin-layer chromatography； HPLC

健腰密骨片是由上海市名中醫(yī)、上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院施杞教授在繼承石氏傷科“以氣為主、以血為先”理論精髓的基礎(chǔ)上，結(jié)合50多年臨床實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)方，該方由黃芪、淫羊藿、墨旱蓮、丹參等6味中藥組成，具有“益氣健腰補(bǔ)腎，化瘀通絡(luò)止痛”的功效。方中黃芪為君藥，補(bǔ)中益氣，利水消腫，標(biāo)本兼顧。淫羊藿為臣藥，發(fā)揮其補(bǔ)腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋續(xù)骨、祛風(fēng)除濕的功效，上述兩味藥在制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)發(fā)過(guò)程中已建立定量檢測(cè)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

丹參具有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，涼血消癰，清心除煩，養(yǎng)血安神等功效。丹酚酸B為《中國(guó)藥典》2015年版一部丹參含量測(cè)定項(xiàng)檢測(cè)物質(zhì)之一[1-2]。雖然已有很多文獻(xiàn)已對(duì)丹參及丹酚酸B的含量測(cè)定方法進(jìn)行研究報(bào)道[3-5]，但作為復(fù)方健腰密骨片的使藥，其質(zhì)量也應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)以保證復(fù)方藥效的穩(wěn)定，從而協(xié)助君、臣藥以加強(qiáng)治療作用，也可直接治療次要兼證。本文通過(guò)試驗(yàn)摸索擬建立健腰密骨片中丹參的薄層色譜鑒別方法和丹酚酸B的高效液相色譜含量測(cè)定方法，利用新建立的薄層鑒別方法和含量測(cè)定方法完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為制劑的全方位質(zhì)量控制提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)（重慶利迪現(xiàn)代水技術(shù)設(shè)備有限公司）；Mettler Toledo AL204天平、Mettler Toledo XS205天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；電熱恒溫水浴鍋HHS型（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；真空干燥烘箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；超聲機(jī)SK-7210HP（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

德國(guó)默克硅膠板G60（10 cm×10 cm），購(gòu)自默克化工技術(shù)（上海）有限公司；丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：11562-201716，供含量測(cè)定用，含量以94.1%計(jì)）和丹參對(duì)照藥材（批號(hào)：120923-201615，供薄層鑒別用），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；健腰密骨片（批號(hào)：S180501、S19110101、S19110102、S19110401、S19110402、S191102）由上海和黃藥業(yè)有限公司提供；乙腈為色譜純?cè)噭―ikma公司）；水為超純水；磷酸為色譜純?cè)噭?；其它試劑均為分析純?/p>

1.2 方法

1.2.1 丹酚酸B薄層鑒別

1）薄層鑒別供試品溶液 取健腰密骨片適量，研細(xì)，取5 g，加甲醇50 mL，超聲處理（功率350 W，頻率53 kHz）30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL（乳化層轉(zhuǎn)移至水層），合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為不同批號(hào)薄層鑒別供試品溶液1～5。

2）薄層鑒別丹酚酸B對(duì)照品溶液 取丹酚酸B對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為薄層鑒別丹酚酸B對(duì)照品溶液。

3）薄層鑒別丹參對(duì)照藥材和薄層鑒別陰性溶液 另取丹參對(duì)照藥材1 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)约状? mL溶解作為薄層鑒別丹參對(duì)照藥材溶液。按處方比例，除去丹參，按處方制得薄層鑒別丹參陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液制備方法，同法制得薄層鑒別丹參陰性溶液。

4）薄層色譜法 取各薄層鑒別受試溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上[2]，以甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（4∶6∶8∶1∶4）為展開(kāi)劑，預(yù)平衡15 min后放入硅膠板，展層后取出，晾干，噴5%三氯化鐵乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.2.2 丹酚酸B含量測(cè)定

1.2.2.1 色譜條件

Agilent TC C18柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；以乙腈-0.1%磷酸水溶液（22∶78）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 mL。

1.2.2.2 溶液制備

1）對(duì)照品溶液 精密稱定丹酚酸B對(duì)照品（含量以94.1%計(jì)）15.94 mg，置于10 mL容量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，即得每1 mL含0.15 mg的丹酚酸B對(duì)照品溶液。

2）供試品溶液 精密稱定健腰密骨片1.5 g，置具塞三角錐形瓶中，加入60%甲醇50 mL后稱重；超聲提取30 min，放冷，再稱重，用60%甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

3）陰性樣品溶液 按健腰密骨片的處方制得不含丹參的陰性樣品，按供試品溶液處理方法制備陰性樣品溶液。

2 結(jié)果

2.1 薄層鑒別

薄層鑒別供試品與薄層鑒別丹酚酸B對(duì)照品、薄層鑒別丹參對(duì)照藥材在薄層色譜的相同位置顯示相同顏色的斑點(diǎn)，而薄層鑒別丹參陰性對(duì)照無(wú)斑點(diǎn)，表明陰性對(duì)照對(duì)薄層色譜沒(méi)有干擾（圖1）。

2.2 專屬性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 mL進(jìn)樣測(cè)定，陰性樣品溶液在對(duì)照品相同的保留時(shí)間處未見(jiàn)色譜峰，說(shuō)明對(duì)色譜測(cè)定無(wú)干擾（圖2）。

2.3 線性關(guān)系考察

分別配制質(zhì)量濃度為19.1、38.2、76.5、152.9、305.8、611.6、1 529.1 mg/mL丹酚酸B溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣量（mg）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=1 190.30X-253.63 r=0.999 9。結(jié)果表明丹酚酸B在0.191～15.291 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積并計(jì)算其RSD。結(jié)果丹酚酸B RSD為0.07%，表明該測(cè)定方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的健腰密骨片平行制備6份供試品溶液，色譜測(cè)定并計(jì)算丹酚酸B含量，其平均含量為4.93 mg/mL，RSD為0.84%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定含量已知的同一批健腰密骨片（批號(hào)S180501）樣品9份，按約為樣品丹酚酸B含量的0.8、1.0、1.2倍量分別加入對(duì)照品適量，進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果表明平均回收率為96.72%、RSD為1.46（表1）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液置于室溫（25 ℃），分別于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄丹酚酸B的峰面積。經(jīng)計(jì)算其RSD為1.25%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 含量測(cè)定

對(duì)3批健腰密骨片樣品中的丹酚酸B含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，丹酚酸B含量相對(duì)穩(wěn)定，質(zhì)量可控（表2）。

3 討論

在復(fù)方中藥新藥研制過(guò)程中，小試研究、中試放大以及向大生產(chǎn)轉(zhuǎn)化時(shí)，通常會(huì)碰到三個(gè)問(wèn)題：①大生產(chǎn)浸膏得率比小試、中試得率高，導(dǎo)致浸膏粉物料性質(zhì)有差異，影響制劑成型過(guò)程和穩(wěn)定性，并影響制劑的制成量，從而影響制劑規(guī)格；②由于大生產(chǎn)是連續(xù)化生產(chǎn)線生產(chǎn)，工藝參數(shù)不同于實(shí)驗(yàn)室，因此需要考慮復(fù)方中質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的全覆蓋及合理性；③大生產(chǎn)需要考慮安全、清潔、環(huán)保、節(jié)能和易操作。正因?yàn)樯鲜鲈?，研究并完善?fù)方中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)全覆蓋對(duì)新藥成果的產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化顯得非常必要。

本研究通過(guò)調(diào)節(jié)pH使丹酚酸B充分轉(zhuǎn)移至乙醚層，實(shí)現(xiàn)快速分離；所建立的薄層鑒別方法比文獻(xiàn)[6-7]操作簡(jiǎn)便，可用于復(fù)方健腰密骨片中丹參藥材的專屬鑒別；所建立的HPLC含量測(cè)定方法所用時(shí)間較文獻(xiàn)報(bào)道短[8]、流動(dòng)相配比簡(jiǎn)單更具有實(shí)用性，具有基本配置的高效液相色譜儀即可滿足測(cè)定需求，便于方法轉(zhuǎn)移。在供試品制備方法考察試驗(yàn)中，曾比較20%、40%、60%和80%甲醇對(duì)丹酚酸B提取收率的影響，結(jié)果表明60%甲醇提取收率最高；也試驗(yàn)了不同提取時(shí)間（15、30、45及60 min）對(duì)提取收率的影響，結(jié)果顯示30 min能有效提取丹酚酸B，故本試驗(yàn)選擇60%甲醇超聲提取30 min。

丹酚酸B作為丹參藥材含量檢測(cè)的成分之一，已有多年的研究基礎(chǔ)。本研究以復(fù)方健腰密骨片為樣品，以使藥丹參質(zhì)量監(jiān)控為目標(biāo)，建立用于復(fù)方制劑質(zhì)量檢測(cè)的定性薄層層析鑒別方法和定量HPLC含量測(cè)定方法，以便達(dá)到復(fù)方制劑質(zhì)量可控的目的，為該品種的全方位質(zhì)量控制提供參考。

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