不同昆蟲取食對(duì)煙草信號(hào)分子和防御酶的影響

余源嬋，楊茂發(fā), *，商勝華，劉健鋒，于曉飛

(1.貴州大學(xué)昆蟲研究所/貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2. 貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴陽 550025；3. 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081)

煙草NicotianatabacumL.是我國重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，隨著煙草的規(guī)?；N植，煙草病蟲害呈逐年上升趨勢(曾維愛等, 2017)，其中煙蚜MyzuspersicaeSulzer、斜紋夜蛾SpodopteralituraFabricius和棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHübner是煙草種植中常見的3種主要害蟲，分屬刺吸性和食葉性害蟲，具有分布范圍廣、為害周期長等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害煙草生產(chǎn)(郭線茹等, 2006)。目前關(guān)于煙草蟲害防治方法較多，然因化學(xué)防控具有經(jīng)濟(jì)、快速和使用方便等優(yōu)勢仍在多數(shù)地區(qū)得到廣泛應(yīng)用(彭孟祥等, 2019)，嚴(yán)重威脅到煙草產(chǎn)品質(zhì)量安全(李江舟等, 2018)。目前已知煙蚜、斜紋夜蛾及棉鈴蟲已對(duì)多種常用殺蟲劑產(chǎn)生了不同水平的抗性(劉佳等, 2016; 胡紅巖等, 2018; 孟建玉等, 2018)。因此，通過探究蟲害誘導(dǎo)的植物防御機(jī)制以尋求合適的方法使植物產(chǎn)生抗蟲防御警備,可大大減少殺蟲劑的使用，已成為當(dāng)前害蟲綜合防治的研究熱點(diǎn)(王杰等, 2018)。

植食性昆蟲取食植物時(shí)，其口腔分泌物內(nèi)的激發(fā)子可被植物識(shí)別從而激活植物體內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Schuman and Baldwin, 2016)。常見植食性昆蟲口器有咀嚼式和刺吸式兩類，前者取食主要誘導(dǎo)激活植物茉莉酸(jasmonic acid, JA)途徑，使得植物體內(nèi)JA及其化合物含量發(fā)生變化(顧小輝等, 2017)；后者則通過刺吸植物韌皮部汁液獲取植物營養(yǎng)，同時(shí)傳播植物病毒，主要激活植物體內(nèi)水楊酸(salicylic acid, SA)途徑(Leitneretal., 2005)。各種防御信號(hào)途徑之間可相互影響，交叉反應(yīng)，使植物產(chǎn)生多種抗性機(jī)制(彭金英和黃勇平, 2005)。茉莉酸、一氧化氮(nitric oxide, NO)和硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)是植物體內(nèi)普遍存在的信號(hào)分子，參與植物體內(nèi)多種生理活動(dòng)，其中JA除參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育外，還在昆蟲取食和脅迫反應(yīng)中起到信號(hào)傳遞作用(蒲恒滸等, 2019)，可誘導(dǎo)增加植物多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)、脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)、過氧化物酶(peroxidase, POD)及SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵限速酶苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)等多種防御酶的合成直接抵御蟲害(Koramutlaetal., 2014; Kanchiswamyetal., 2015)。NO作為一種重要的信號(hào)分子，不僅參與植物的種子休眠和萌發(fā)以及根的形態(tài)建成等生長發(fā)育過程，還參與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的氣孔運(yùn)動(dòng)以及增加植物抗性(Hasanuzzamanetal., 2018)，其中NO依賴SA的產(chǎn)生激活或強(qiáng)化植物防御反應(yīng)，SA通過改變順烏頭酸酶(aconitase，ACO)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和POD活性進(jìn)而參與NO合成途徑(彭金英和黃勇平, 2005; 張艷敏, 2017)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)煙蚜和斜紋夜蛾取食均可誘導(dǎo)煙葉NO含量升高(張艷敏等, 2017)。H2S信號(hào)分子具有與NO類似的功能，根據(jù)兩者各自濃度在植物中作為信號(hào)或損傷促進(jìn)劑起協(xié)同或拮抗作用(Corpasetal., 2019)。研究證實(shí)NO和H2S水平的增加及其相互作用，可增加煙草對(duì)極端鹽度條件脅迫的耐受性(Da Silvaetal., 2017)。此外，H2S作為JA信號(hào)的下游，調(diào)控?cái)M南芥Arabidopsisthaliana子葉的氣孔發(fā)育(Dengetal., 2020)。以上研究均證實(shí)JA、NO和H2S等防御信號(hào)分子參與了植物抗性的誘導(dǎo)。

植物體通過多種信號(hào)途徑間通訊，激活各種防御基因的表達(dá)并合成積累相關(guān)防御物質(zhì)，如PAL、PPO、POD和LOX等多種防御酶蛋白直接抵御蟲害(林丹, 2018)。植物體內(nèi)的防御蛋白酶經(jīng)昆蟲攝入后，可影響害蟲腸道內(nèi)胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等消化酶活性，擾亂昆蟲原有的腸道環(huán)境極其消化吸收功能，造成蟲體發(fā)育減緩或死亡(桂連友等, 2005)。本文以棉鈴蟲、斜紋夜蛾及煙蚜等3種昆蟲取食后檢測煙草葉片內(nèi)的防御生理指標(biāo)變化來探討不同昆蟲取食誘導(dǎo)的煙草抗蟲生理機(jī)制，旨在為形成煙草蟲害綠色防控綜合技術(shù)體系，替代或減少化學(xué)農(nóng)藥的使用次數(shù)與用量提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年6-9月在貴州大學(xué)昆蟲研究所的實(shí)驗(yàn)用地及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，實(shí)驗(yàn)選用貴州煙區(qū)生產(chǎn)上常用的煙草品種“雄性不育K326(male sterility K326, MS K326)”為材料，于實(shí)驗(yàn)棚育苗池內(nèi)進(jìn)行漂浮育苗，待盤內(nèi)幼苗長至4片真葉時(shí)，用腐殖土進(jìn)行單株盆栽培育。將盆栽煙苗移入孔徑為160目的防蟲網(wǎng)籠中，自然光照，定期澆灌肥料水，待煙苗長至6片真葉后，選取長勢一致的健康煙苗供試(Zong and Wang, 2007)。

試驗(yàn)用煙蚜M.persicae無翅成蚜為實(shí)驗(yàn)棚內(nèi)煙株上籠罩繁殖的自然種群，采自貴州省遵義市進(jìn)化鎮(zhèn)煙田，采用李林森法傳接蚜蟲(李林森, 1983)，煙蚜饑餓3 h后供試。斜紋夜蛾種群為實(shí)驗(yàn)室長期建立的穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)種群，用人工飼料連續(xù)飼養(yǎng)多代，飼料配方參照陳其津等(2000)，略作修改，飼養(yǎng)條件為溫度27±1℃，相對(duì)濕度70%±5%,光周期14 L∶10 D；棉鈴蟲種群購于科云生物，飼養(yǎng)條件為溫度27±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期16 L∶8 D。用新鮮煙葉喂食斜紋夜蛾和棉鈴蟲初孵幼蟲，待蟲體長至3～4齡時(shí)選取大小一致的蟲體單頭進(jìn)行饑餓處理12 h后供試。

在6片真葉期，選取長勢一致的煙苗用于試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置6種處理：(1)煙蚜取食，接15頭饑餓3 h后的無翅成年蚜蟲至煙苗除心葉外的從上至下數(shù)第1片完全展開葉背面(張艷敏等, 2017)；(2)斜紋夜蛾和棉鈴蟲取食，分別接1頭蛻皮12 h內(nèi)的斜紋夜蛾/棉鈴蟲3齡幼蟲至煙苗從上至下數(shù)第1片完全展開葉，用紗袋籠罩處理葉，防止蟲體轉(zhuǎn)移取食(Zong and Wang, 2007)；(3)針刺，用PUL-1000程控水平控制儀拉取的毛細(xì)血管細(xì)針即顯微注射針5根一束，對(duì)供試煙苗從上至下數(shù)第1片完全展開葉進(jìn)行針刺處理，針刺3次為一組，分別在T5 min、T10 min時(shí)進(jìn)行針刺，之后開始正式處理計(jì)時(shí)(Gossetetal., 2009)；(4)打孔，用自制打孔器(d=0.3 cm)在煙苗除心葉外的從上至下數(shù)第1片完全展開葉上打孔，1次/h，打孔3 h模擬蟲體持續(xù)取食(打孔總面積約為斜紋夜蛾、棉鈴蟲組取食面積)；(5)以同期未受為害的健康煙苗相同位置葉片作為對(duì)照(CK)。將相同處理煙株放入無蟲網(wǎng)籠中，保證不同處理間直線距離不少于10 m，所有處理煙苗置于相同實(shí)驗(yàn)用地環(huán)境。處理6、12、24、48和72 h后摘取各處理煙苗從上至下數(shù)第2片完全展開葉組織放入提前準(zhǔn)備好的自封袋中封口后立即放入冰盒，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存待測。以上處理重復(fù)3次，每次重復(fù)各處理煙苗5株。

1.2 樣品處理、生化指標(biāo)測定與計(jì)算方法

1.2.1樣品處理

JA含量測定：將葉片葉肉組織加液氮研磨后分別稱取0.1 g加入1 mL預(yù)冷PBS緩沖液(購于生工；0.01 M, pH 7.4)，快速震蕩搖勻后對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，按照Plant JA ELISA KIT進(jìn)口試劑盒(購于上海晶抗生物公司)說明書要求條件離心(常溫條件下5 000 r/min離心5～10 min)，取上清檢測。NO、H2S、PAL、PPO、LOX和POD等生理指標(biāo)測定:將葉片葉肉組織加液氮研磨后分別稱取 0.1 g加入1 mL各測定指標(biāo)提取液，快速震蕩搖勻后按照一氧化氮(NO)、硫化氫(H2S)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)、脂氧合酶(LOX)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)各微量法測試盒(購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)說明書要求進(jìn)行低溫離心(NO和H2S粗樣品分別于4℃、10 000 r/min下離心15 min和10 min；PAL粗樣品于4℃、10 000 r/min下離心10 min，LOX粗樣品于4℃、16 000 r/min下離心20 min，PPO和POD粗樣品于4℃、8 000 r/min下離心10 min)，然后取上清置于冰上待測。

1.2.2生化指標(biāo)測定與計(jì)算方法

JA測定采用酶聯(lián)免疫分析法(張興麗, 2013)，按照Plant JA ELISA KIT進(jìn)口試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定產(chǎn)物特定波長的吸光值(JA: 450 nm)，代入測定已知濃度(y)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值(x)繪制的直線回歸方程(y=1 427.4x-190.09,R2=0.9964)中，計(jì)算出樣品濃度(pmol/L FW)。NO、H2S兩種信號(hào)分子含量和PAL、LOX、PPO、POD等酶活性測定按照對(duì)應(yīng)的各試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定產(chǎn)物特定波長的吸光值(NO: 550 nm; H2S: 665 nm; PAL: 290 nm; LOX: 280 nm; PPO: 525 nm; POD: 470 nm)，最后根據(jù)說明書提供的公式：NO含量(μmol/g FW)=0.25×(ΔA+0.0103)÷W、H2S含量(nmol/g FW)=681.6×ΔA÷W；PAL(U/g FW)=26.6×ΔA÷W、LOX(U/g FW)=33.33×ΔA÷W、PPO(U/g FW)=120×ΔA÷W(注前面公式中ΔA=A測定-A對(duì)照，W為樣品質(zhì)量)；POD(U/g FW)=4 000×ΔA÷W(注ΔA=A2 min-A1 min，W為樣品質(zhì)量)，計(jì)算樣品中對(duì)應(yīng)的各信號(hào)分子含量和防御酶活性(溫娟等, 2017)。每樣品重復(fù)檢測2次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)不同處理間的差異顯著性，利用GraphPad Prism 7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中信號(hào)分子含量的影響

2.1.1不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中JA含量的影響

棉鈴蟲取食條件下，煙葉內(nèi)JA含量呈升高降低趨勢，48 h時(shí)含量顯著升高達(dá)到峰值，較對(duì)照含量上升了10.55%，之后有所降低；斜紋夜蛾取食下，JA在12 h時(shí)含量顯著低于對(duì)照和打孔含量，之后回升接近對(duì)照。煙蚜取食下，煙葉內(nèi)JA含量升高總體受到抑制，24 h時(shí)抑制顯著，含量較對(duì)照含量降低了10.38%，針刺JA含量則逐漸升高，直到48 h時(shí)含量回升與對(duì)照含量接近。說明不同昆蟲取食誘導(dǎo)煙葉內(nèi)JA含量變化存在差異，棉鈴蟲取食明顯誘導(dǎo)JA含量升高，斜紋夜蛾取食抑制JA含量升高，之后含量回升接近對(duì)照，煙蚜取食則抑制了煙葉內(nèi)JA含量升高(表1)。

表1 不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中信號(hào)分子JA含量的影響(單位：pmol/L)

2.1.2不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中NO含量的影響

棉鈴蟲取食后煙葉內(nèi)NO含量呈逐漸升高后持平趨勢，取食24 h時(shí)，NO含量升至峰值，較對(duì)照升高1.48倍；斜紋夜蛾取食煙草后煙葉內(nèi)NO含量升高整體受到一定抑制，處理12 h時(shí)含量顯著低于對(duì)照，較同時(shí)段對(duì)照含量降低了33.33%，處理72 h時(shí)NO含量回升至與對(duì)照接近，打孔NO含量在處理48 h時(shí)達(dá)到含量峰值，以上3種處理中的NO峰值出現(xiàn)前后順序?yàn)椋好掴徬x>打孔>斜紋夜蛾。煙蚜取食后NO含量在6 h時(shí)明顯受到抑制，12 h時(shí)含量升高與對(duì)照含量接近，之后呈逐漸下降趨勢，而針刺N(yùn)O含量在前兩個(gè)時(shí)段中出現(xiàn)一定下降趨勢，之后逐漸升高。實(shí)驗(yàn)表明,棉鈴蟲取食誘導(dǎo)NO升高明顯，斜紋夜蛾取食下NO含量受到一定抑制后升高不明顯，煙蚜則是抑制煙葉內(nèi)NO含量升高(表2)。

表2 不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中信號(hào)分子NO含量的影響(單位：μmol/g)

2.1.3不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中H2S含量的影響

不同昆蟲取食煙草‘MS K326’均可誘導(dǎo)煙草內(nèi)H2S含量發(fā)生顯著變化(表3)。其中，斜紋夜蛾幼蟲取食6 h時(shí)煙草內(nèi)H2S含量與對(duì)照差異顯著，含量高達(dá)對(duì)照含量的1.74倍，之后煙葉內(nèi)H2S含量均呈一定下降趨勢，而棉鈴蟲取食則是呈持續(xù)性下降趨勢，6 h時(shí)達(dá)到含量峰值較對(duì)照顯著升高。打孔處理下H2S含量變化呈緩慢升高后降低趨勢，其峰值低于斜紋夜蛾和棉鈴蟲取食處理組。煙蚜取食下，H2S含量呈逐漸升高后降低趨勢，在處理48 h時(shí)含量最高，為對(duì)照含量的1.77倍，針刺含量僅在處理6 h時(shí)顯著高于對(duì)照。上述結(jié)果表明棉鈴蟲和斜紋夜蛾撕咬取食較煙蚜刺吸取食能較快誘導(dǎo)煙葉內(nèi)H2S含量升高。

表3 不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中信號(hào)分子H2S含量的影響(單位：nmol/g)

2.2 不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中防御酶的影響

2.2.1不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中PAL活性的影響

棉鈴蟲和斜紋夜蛾取食后葉片內(nèi)PAL活性均在72 h時(shí)達(dá)到峰值，棉鈴蟲取食下PAL活性開始呈持續(xù)上升趨勢，48 h時(shí)活性驟減，之后迅速升高，除48 h外其余各時(shí)段下PAL活性均顯著高于對(duì)照；斜紋夜蛾取食6 h時(shí)煙葉內(nèi)PAL活性與較對(duì)照明顯受到抑制，12 h時(shí)活性有所升高，24 h時(shí)活性受到抑制，之后處理時(shí)段下逐漸升高；無論棉鈴蟲還是斜紋夜蛾取食后，葉片內(nèi)PAL活性升幅均高于對(duì)照和打孔處理組，斜紋夜蛾誘導(dǎo)的PAL活性峰值高于棉鈴蟲。煙蚜取食下煙葉內(nèi)PAL活性在12 h時(shí)明顯受到抑制，之后緩慢升高，48 h明顯升高后活性與棉鈴蟲取食株接近，之后降低，其活性峰值高于對(duì)照和針刺。表明棉鈴蟲和斜紋夜蛾取食誘導(dǎo)的PAL活性較煙蚜高，打孔的PAL活性高于針刺組，煙蚜處理較針刺組明顯誘導(dǎo)PAL活性升高，由此可推測昆蟲唾液分子和較大的機(jī)械損傷創(chuàng)口更易誘導(dǎo)煙葉內(nèi)PAL活性升高(圖1)。

圖1 不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中防御酶PAL活性的影響Fig.1 Dynamics of the PAL activity of tobacco ‘MS K326’ leaves infested by different insects at different feeding time points注：圖中各數(shù)據(jù)誤差線來源于SD。不同柱狀圖上的英文小寫字母不同表示在同一時(shí)間不同處理下在0.05水平上差異顯著，相同柱狀圖上的英文大寫字母不同表示相同處理不同時(shí)間段下在0.05水平上差異顯著。下同。Note: Error lines in the figure were from SD. Different lowercase letters on different bar charts indicated significant differences at the 0.05 level under different treatments at the same time, different uppercase letters on the same histogram indicated significant differences at the level of 0.05 at different time periods of the same treatment. The same below.

2.2.2不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中LOX活性的影響

棉鈴蟲處理24 h后，煙葉內(nèi)LOX活性升至峰值(60.64 U/g)與對(duì)照接近，之后活性升高受到抑制；斜紋夜蛾取食后煙葉內(nèi)LOX活性呈現(xiàn)波動(dòng)性降低升高，12 h時(shí)LOX活性明顯受到抑制，72 h時(shí)活性升至峰值(63.28 U/g)與對(duì)照接近，打孔的LOX活性在12 h明顯下降，之后緩慢升高，72 h后活性與對(duì)照接近。煙蚜取食6 h時(shí)快速誘導(dǎo)煙葉內(nèi)LOX活性顯著升高達(dá)到峰值(72.40 U/g)，較對(duì)照上升了54.01%，其余時(shí)段內(nèi)活性接近或略低于對(duì)照；針刺前期煙葉內(nèi)LOX活性與其他處理組相同，均受到一定抑制，之后活性回升。表明棉鈴蟲和斜紋夜蛾取食下煙葉內(nèi)LOX酶活性在一定時(shí)間內(nèi)較對(duì)照明顯受到抑制，而煙蚜取食可快速誘導(dǎo)煙葉內(nèi)LOX活性快速顯著升高(圖2)。

圖2 不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中防御酶LOX活性的影響Fig.2 Dynamics of the LOX activity of tobacco ‘MS K326’ leaves infested by different insects at different feeding time points

2.2.3不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中PPO活性的影響

棉鈴蟲和斜紋夜蛾取食后煙葉內(nèi)PPO活性均升高，棉鈴蟲取食后煙葉PPO活性在6 h時(shí)較對(duì)照受到明顯抑制，48 h時(shí)出現(xiàn)活性峰值(190.66 U/g)；斜紋夜蛾取食下PPO活性自6 h時(shí)開始升高，12 h時(shí)達(dá)到峰值(195.32 U/g)，之后保持穩(wěn)定；打孔的煙葉內(nèi)PPO活性在24 h升至最高，其峰值低于咀嚼口器昆蟲取食誘導(dǎo)的PPO活性。煙蚜取食煙株后煙葉內(nèi)PPO活性呈現(xiàn)升高-降低-升高的趨勢，取食6 h時(shí)，煙葉內(nèi)PPO活性升至最高(156.61 U/g)，較同時(shí)段對(duì)照明顯升高；針刺誘導(dǎo)煙葉內(nèi)PPO活性變化與煙蚜取食的情況存在一定差異，但同在處理6 h時(shí)活性升高且接近煙蚜組活性(活性略低于煙蚜取食)，之后變化情況與煙蚜組相似。以上結(jié)果說明，不同昆蟲均能引起煙葉內(nèi)防御酶PPO活性升高，其中斜紋夜蛾誘導(dǎo)的煙株防御酶活性升高最高(圖3)。

圖3 不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中防御酶PPO活性的影響Fig.3 Dynamics of the PPO activity of tobacco ‘MS K326’ leaves infested by different insects at different feeding time points

2.2.4不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中POD活性的影響

棉鈴蟲取食初期煙葉內(nèi)POD活性受到明顯抑制，之后逐漸升高，48 h時(shí)升至峰值(99.65 U/g)接近同時(shí)段對(duì)照，斜紋夜蛾取食煙株后煙葉內(nèi)POD活性呈現(xiàn)降低后升高趨勢，24 h時(shí)升至最高(169.33 U/g)，較對(duì)照顯著升高1.11倍；打孔煙葉內(nèi)POD酶活性升高，呈現(xiàn)波動(dòng)性變化，活性峰值介于棉鈴蟲與斜紋夜蛾之間。煙蚜取食煙株后煙葉內(nèi)POD活性較對(duì)照被誘導(dǎo)顯著升高，12 h時(shí)為活性峰值點(diǎn)(161.48 U/g)，接著活性降低，之后逐漸升高；針刺煙葉POD活性呈現(xiàn)升高-降低-升高取食，其活性峰值較煙蚜處理組滯后。由此可見，不同昆蟲取食均可誘導(dǎo)煙葉內(nèi)POD酶活性升高，其中斜紋夜蛾取食煙草誘導(dǎo)POD酶活性峰值最高(圖4)。

圖4 不同昆蟲取食對(duì)煙草‘MS K326’葉片中防御酶POD活性的影響Fig.4 Dynamics of the POD activity of tobacco ‘MS K326’ leaves infested by different insects at different feeding time points

3 結(jié)論與討論

蟲害誘導(dǎo)的寄主植物體內(nèi)各信號(hào)物質(zhì)變化直接影響到植物防御信號(hào)的通路轉(zhuǎn)導(dǎo)及相關(guān)防御基因的表達(dá)，從而增加植物防御抗性(Lietal., 2016)。研究不同蟲害對(duì)煙草信號(hào)物質(zhì)及防御酶活性變化的影響為篩選與昆蟲相關(guān)的生防化學(xué)激發(fā)子提供參考依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用生化分析法研究了棉鈴蟲、斜紋夜蛾和煙蚜3種蟲害對(duì)煙草防御信號(hào)物質(zhì)JA、NO、H2S和防御酶PAL、PPO、LOX、POD的影響。結(jié)果表明，棉鈴蟲取食可誘導(dǎo)煙草JA、NO和H2S含量均升高；斜紋夜蛾取食下，煙葉JA降低，NO含量升高不明顯，H2S含量顯著升高；煙蚜為害后JA、NO含量降低，H2S含量在48 h時(shí)升至最高，而棉鈴蟲和斜紋夜蛾取食下H2S含量在6 h時(shí)迅速升高。說明棉鈴蟲比斜紋夜蛾和煙蚜更易誘導(dǎo)煙草內(nèi)各信號(hào)分子含量增加，煙草對(duì)棉鈴蟲取食非常敏感，能夠?qū)ζ錇楹ρ杆僮龀龇磻?yīng)，而斜紋夜蛾和煙蚜則在一定程度上抑制了煙草防御信號(hào)，此外棉鈴蟲和斜紋夜蛾咀嚼較煙蚜刺吸可快速誘導(dǎo)煙葉內(nèi)H2S迅速響應(yīng)。這些結(jié)論與前人報(bào)道的棉鈴蟲為害煙草后JA含量明顯升高(Zong and Wang, 2007)，煙粉虱Bemisiatabaci以60頭/葉的為害密度刺吸危害辣椒后，葉片內(nèi)JA含量較對(duì)照降低，與張海波等(2018)等研究結(jié)果相似。但張艷敏等(2017)在溫室大棚條件下研究發(fā)現(xiàn)煙蚜和斜紋夜蛾取食下煙葉內(nèi)信號(hào)分子JA和NO含量升高后降低，這可能是由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境不同及各類處理煙苗株距導(dǎo)致的誘導(dǎo)效果存在差異。此外本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同蟲害均可誘導(dǎo)H2S信號(hào)物質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，且反應(yīng)時(shí)間與取食方式密切相關(guān)。

植物在受到害蟲取食為害時(shí)，通過改變其體內(nèi)PAL、LOX、POD和PPO等多種防御酶活性從而提高植物抗性(溫娟等, 2017; 郭祖國等, 2018)。前人研究報(bào)道了棉鈴蟲取食誘導(dǎo)棉花葉片內(nèi)POD、LOX、PAL等酶活性升高，煙粉虱為害辣椒和黃瓜后POD活性下降(沙品潔等, 2012; 劉明楊等, 2016)。本實(shí)驗(yàn)中，棉鈴蟲和斜紋夜蛾兩者取食煙草誘導(dǎo)的煙草防御存在差異。兩者分別取食煙草后，導(dǎo)致煙葉內(nèi)JA途徑關(guān)鍵酶LOX活性降低，PPO活性升高(斜紋夜蛾取食升高明顯)，SA途徑關(guān)鍵酶PAL活性升高，棉鈴蟲誘導(dǎo)煙葉內(nèi)POD活性降低至與CK接近，斜紋夜蛾則誘導(dǎo)POD活性增加，其中多數(shù)防御酶對(duì)斜紋夜蛾的取食防御應(yīng)答較強(qiáng)。宗娜等(2004)研究發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲、煙青蟲及斜紋夜蛾3種咀嚼口器昆蟲取食對(duì)煙草煙堿的誘導(dǎo)情況存在差異原因在于棉鈴蟲和煙青蟲下唇腺中存在葡萄糖氧化酶可能抑制煙堿的誘導(dǎo)，而斜紋夜蛾取食則促進(jìn)煙堿的誘導(dǎo)，下唇腺提取液中未檢測到該酶活性。因此推測導(dǎo)致該實(shí)驗(yàn)結(jié)果有可能是因?yàn)榇嬖谟诓煌彩承岳ハx口腔分泌物中的特異激發(fā)子有一定關(guān)系(Singhetal., 2008; 李靜等, 2011)。此外，本實(shí)驗(yàn)中煙蚜取食后，各防御酶活性均被誘導(dǎo)升高，其中PAL活性在處理12 h時(shí)受到抑制，48 h時(shí)活性有所升高，JA途徑關(guān)鍵酶LOX和PPO、POD活性在取食6 h時(shí)顯著升高，之后受到不同程度的抑制，POD活性在24 h抑制最為明顯后又逐漸升高，該誘導(dǎo)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室之前研究已發(fā)表的結(jié)果相似。以上結(jié)果均說明不同昆蟲取食誘導(dǎo)的煙葉內(nèi)防御信號(hào)分子及防御酶活性變化存在顯著差異，煙草對(duì)3種蟲害產(chǎn)生的防御具有專一性。

本研究從蟲害對(duì)煙草誘導(dǎo)生理防御方面揭示了不同蟲害誘導(dǎo)的煙株抗性差異，為棉鈴蟲、斜紋夜蛾和煙蚜等對(duì)種煙草害蟲的暴發(fā)、植株本身誘導(dǎo)的防御反應(yīng)監(jiān)測提供了有效依據(jù)。由于不同昆蟲與煙草的相互關(guān)系存在差異，在以煙草誘導(dǎo)防御機(jī)制為重點(diǎn)的綠色防控中，建議應(yīng)針對(duì)性地提出防治措施。同時(shí)，外源H2S供體(NaHS)可誘導(dǎo)擬南芥A.thaliana內(nèi)源H2S含量升高增強(qiáng)對(duì)假單胞菌Pseudomonassyringae的抗性(Shietal., 2015)。合理噴施外源JA、NO和H2S等信號(hào)物質(zhì)可提高植株抗性(李順欣等, 2017; 彭仁義, 2018)，該實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)蟲害可誘導(dǎo)煙葉內(nèi)源H2S含量升高，因此在煙草蟲害防治中，可考慮合理噴施H2S等相關(guān)外源信號(hào)物質(zhì)來提高植物抗蟲性，開展相關(guān)綠色防控以此降低蟲害所造成的損失。