曹聯(lián)飛，蘇曉玲，陳道印，趙東緒，華啟云

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；2. 金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江金華 321000)

中華蜜蜂Apisceranacerana，即中蜂，是中國境內(nèi)東方蜜蜂Apiscerana的總稱，廣泛分布于除新疆以外的全國各地，特別是南方的丘陵、山區(qū)(國家畜禽遺傳資源委員會, 2011)。中蜂適合山區(qū)定地飼養(yǎng)，善于采集零星蜜源，抗逆能力強(qiáng)，在我國具有悠久的飼養(yǎng)歷史，已被列入《國家級畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》。近年來，國家非常重視中蜂的遺傳資源保護(hù)工作，建立了多個保種場和保護(hù)區(qū)。浙江是中蜂的傳統(tǒng)分布區(qū)，近幾年中蜂養(yǎng)殖發(fā)展迅猛，已由2013年的10多萬群增長到2018年的40多萬群(施金虎等, 2019)。

遺傳多樣性研究是中蜂資源有效保護(hù)和合理開發(fā)利用的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)上我國中蜂可劃分為北方中蜂、華南中蜂、華中中蜂、云貴高原中蜂、長白山中蜂、海南中蜂、阿壩中蜂、滇南中蜂和西藏中蜂等9個類型(國家畜禽遺傳資源委員會, 2011)。近些年來，線粒體分子標(biāo)記在我國中蜂的遺傳多樣性研究中大量應(yīng)用。姜玉鎖等(2007)利用線粒體分子標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)我國境內(nèi)不同地理型中蜂存在著較明顯的遺傳分化。周姝婧等(2016)利用線粒體分子標(biāo)記對福建省的中蜂研究發(fā)現(xiàn)遺傳分化不明顯。李彪等(2018)和王俊杰等(2018)分別利用線粒體分子標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)四川唐家河國家級自然保護(hù)區(qū)和陜西秦巴山區(qū)的中蜂遺傳多樣性豐富。關(guān)于浙江省中蜂的遺傳多樣性研究，趙東緒等(2013)利用形態(tài)學(xué)特征研究發(fā)現(xiàn)浙江省中蜂變異豐富，曹聯(lián)飛等(2017)利用線粒體分子標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)浙江麗水地區(qū)中蜂的遺傳多樣性水平較高。

金華市位于浙江省中部，交通便利，為浙中丘陵盆地地區(qū)，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，蜜源植物豐富。金華市中蜂養(yǎng)殖歷史悠久，各個區(qū)縣市均有分布。據(jù)統(tǒng)計，金華市中蜂養(yǎng)殖數(shù)量已由2012年的1萬余群增長到目前的7萬余群(趙東緒等, 2012)。然而目前還沒有關(guān)于金華市中蜂遺傳多樣性的系統(tǒng)研究。為了解金華市中蜂的遺傳多樣性及遺傳分化現(xiàn)狀，本研究基于常用的mtDNA tRNAleu～COⅡ序列對金華市中蜂進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為金華市中蜂資源的有效保護(hù)和合理開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2016年在金華市下轄所有9個區(qū)縣市各隨機(jī)選擇3個蜂場，每個蜂場采集3群中華蜜蜂。蜂場的蜂群來源主要為本地野生收捕，長期定地飼養(yǎng)。每群隨機(jī)取幾十頭工蜂，放入無水乙醇中，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1基因組DNA提取

取無水乙醇浸泡保存的蜜蜂樣本，每群隨機(jī)取1頭工蜂，剪取蜜蜂胸部肌肉，按照細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒DP1201(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)的說明和步驟提取蜜蜂總DNA。

1.2.2序列擴(kuò)增與測序

使用PCR引物E2: 5′-GGCAGAATAAGTG CATTG-3′和H2: 5′-CAATATCATTGATGACC-3′對mtDNA tRNAleu～COⅡ序列進(jìn)行擴(kuò)增(Garneryetal., 1992)。PCR反應(yīng)體系為40 μL，其中10×buffer 4 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，10 nmol/L引物各1.6 μL，DNA模板3 μL，Taq酶0.5 μL。反應(yīng)程序為：94°C 5 min；94°C 1 min，50°C 1 min，72°C 1 min，35個循環(huán)；72°C 10 min。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.3數(shù)據(jù)分析

使用DNAStar 5.0(DNASTAR Inc., Madison, WI)和Clustal X 2.0(Larkinetal., 2007)進(jìn)行序列拼接和比對。利用MEGA 7.0(Kumaretal., 2016)輸出堿基組成、變異位點、簡約信息位點，進(jìn)行遺傳距離計算，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹等。利用DnaSP 6.0(Rozasetal., 2017)進(jìn)行單倍型分析，計算單倍型多樣度、核苷酸多樣度和核苷酸差異數(shù)。應(yīng)用Arlequin 3.5(Excoffier and Lischer, 2010)軟件進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)檢測遺傳變異來源，計算群體間遺傳分化系數(shù)(F-statistics,FST)及其顯著性，并采用Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗估算群體歷史動態(tài)變化(Tajima, 1989; Fu, 1997)。應(yīng)用Network 4.0(Bandeltetal., 1999)構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列堿基組成及變異

對81個樣品的序列進(jìn)行比對，截除兩端引物序列后，大部分序列長度為414 bp，另外8條序列由于缺失1個堿基為413 bp。以414 bp序列為標(biāo)準(zhǔn)，1～18 bp為tRNAleu基因部分序列，19～107 bp為非編碼區(qū)序列，108～414 bp為COⅡ部分序列。1個堿基缺失發(fā)生在非編碼區(qū)。所有序列堿基A、T、G、C的平均含量為39.4%、45.2%、5.5%和9.9%，A+T堿基含量(84.6%)明顯高于G+C含量(15.4%)。

序列變異分析結(jié)果顯示共有14個變異位點，其中9個在非編碼區(qū)，5個在COⅡ編碼區(qū)。一個變異位點為A缺失，其余變異位點A/G有6個，T/C有3個，A/T有3個，A/C有1個。變異位點包括6個簡約信息位點和7個單一多態(tài)位點。

2.2 群體多樣性

金華市中蜂共發(fā)現(xiàn)14個單倍型，各地理群體的單倍型數(shù)量為2～4種(表1)。單倍型JH1為金華市所有9個地理群體的共享單倍型，占金華市中蜂總樣本數(shù)的61.73%。金東、義烏和浦江的單倍型JH1占各自樣本數(shù)不到50%，其余區(qū)縣市單倍型JH1占各自樣本數(shù)均超過50%。單倍型JH2和JH3分別僅在金東和浦江的樣本中發(fā)現(xiàn)，且均占自身樣本總數(shù)超過50%；單倍型JH5和JH9僅在東陽的樣本中發(fā)現(xiàn)；單倍型JH6僅在永康的樣本中發(fā)現(xiàn)；單倍型JH7和JH10僅在蘭溪的樣本中發(fā)現(xiàn)；單倍型JH11和JH12僅在磐安的樣本中發(fā)現(xiàn)；單倍型JH13和JH14僅在義烏的樣本中發(fā)現(xiàn)。所有單倍型中，單倍型JH9和JH13序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中尚未見報道(新申請的NCBI登錄號分別為MT263731和MT263732)。

金華市中蜂整體單倍型多樣度(Hd)為0.610(表1)。各個地理群體中，義烏的單倍型多樣度最高(0.750)，其次是東陽(0.639)，婺城、

表1 金華市中蜂樣本采集信息與多樣性指數(shù)

武義、磐安的單倍型多樣度最低(均為0.417)。金華市中蜂整體核苷酸多樣度(Pi)為0.00162，各地理群體中東陽最高(0.00282)，婺城和武義最低(均為0.00054)。各個地理群體的平均核苷酸差異數(shù)也是東陽最大，婺城和武義最小。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)

金華市中蜂地理群體間的遺傳距離分析顯示(表2)，平均遺傳距離為0.002±0.001。金東(JD)、浦江(PJ)、東陽(DY)兩兩群體間的遺傳距離最大，均為0.003，而且這3個群體與金華市其它群體間的遺傳距離也較大(0.002～0.003)。婺城(WC)與武義(WY)群體間的遺傳距離最小(0.000)。

群體分子變異分析(AMOVA)結(jié)果顯示，金華市中蜂地理群體間有較明顯的遺傳分化(FST=0.212,P<0.01)，但這種變異大部分來自于群體內(nèi)部，占78.79%，少部分的遺傳變異來自于群體間，占21.21%。

各地理群體間的遺傳分化系數(shù)FST為-0.125～0.500(表2)。其中金東(JD)與金華市其它地理群體間的遺傳分化系數(shù)FST最大(0.286～0.500)，存在顯著或極顯著差異(P<0.05或P<0.01)。其次，浦江(PJ)與金華市其它地理群體間的遺傳分化系數(shù)FST也較大(0.224～0.500)，存在顯著或極顯著差異(P<0.05或P<0.01)。

表2 金華市中蜂地理群體間的遺傳距離(對角線上)和遺傳分化指數(shù)(對角線下)

2.4 群體歷史動態(tài)

Tajima’sD中性檢驗和Fu’sFs中性檢驗可用于推測群體經(jīng)歷的歷史。當(dāng)Tajima’sD和Fu’sFs呈負(fù)值，并達(dá)到顯著水平(P<0.05)時，可能預(yù)示著群體經(jīng)歷過群體擴(kuò)張。而且一般認(rèn)為，與Tajima’sD相比，F(xiàn)u’sFs能更好地檢測種群擴(kuò)張現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示(表1)，婺城、蘭溪、義烏、武義、磐安中蜂群體的Tajima’sD和Fu’sFs均為負(fù)值，但是只有婺城、武義、磐安的Fu’sFs檢驗達(dá)到了顯著差異(P<0.05)。金華市中蜂整體的Tajima’sD和Fu’sFs均為負(fù)值，且都達(dá)到了極顯著差異(P<0.01)。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹及單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

利用鄰接法(NJ)對14個單倍型進(jìn)行聚類分析，形成了兩個較為明顯的分支(圖1)，單倍型JH3和JH9聚為一支，其它單倍型聚為一支。結(jié)合單倍型在樣本中的分布，JH3來源于浦江，且占浦江樣本的大多數(shù)，JH9來源于東陽的一個樣本。利用單倍型網(wǎng)絡(luò)圖能夠更直觀看出各單倍型之間的演化關(guān)系以及在不同地理群體中的分布情況。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示(圖2)，其它單倍型都以單倍型JH1為中心輻射分布，單倍型JH1可能是最原始的單倍型。

圖1 基于鄰接法對金華市中蜂單倍型聚類分析Fig.1 Neibor-Joining(NJ)method for cluster analyses of haplotypes of Apis cerana cerana in Jinhua

圖2 金華市中蜂單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析Fig.2 Network of haplotypes of Apis cerana cerana in Jinhua

3 結(jié)論與討論

蜜蜂是社會性昆蟲，同一個蜂群里的所有工蜂具有相同的母系，因此利用線粒體DNA進(jìn)行蜜蜂遺傳多樣性研究具有很大優(yōu)勢。目前已有大量基于線粒體DNA的中蜂遺傳多樣性研究，尤其是mtDNA tRNAleu～COⅡ序列最為常用(姜玉鎖等, 2007; 周姝婧等, 2016; 李彪等, 2018; 王俊杰等, 2018)。本研究采用mtDNA tRNAleu～COⅡ序列對金華市中蜂進(jìn)行遺傳多樣性分析，便于與鄰近地區(qū)中蜂已有研究數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析。

本研究單倍型分析發(fā)現(xiàn)，單倍型JH1占金華中蜂樣本總數(shù)的61.73%。而這一單倍型序列也是福建主體單倍型(59.9%)(周姝婧等, 2016)，與已報道的廣州序列(姜玉鎖等, 2007)以及浙江省麗水市中蜂的主體單倍型(41.5%)(曹聯(lián)飛等, 2017)也相同。說明金華市中蜂的主要遺傳背景與浙江麗水以及福建、廣州中蜂相同。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，其它單倍型都以單倍型JH1為中心輻射分布，說明單倍型JH1可能是最原始的單倍型，進(jìn)而進(jìn)化形成其它單倍型。這可能與群體歷史動態(tài)分析顯示的金華市中蜂群體經(jīng)歷了快速擴(kuò)張有關(guān)。其它13個單倍型中有11個單倍型為某個地理群體的獨享單倍型。單倍型JH9和JH13序列則為新發(fā)現(xiàn)的單倍型。說明各地理群體也有自己特有的遺傳背景。

線粒體序列遺傳多樣性豐富程度主要以單倍型多樣度(Hd)及核苷酸多樣度(Pi)為指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，81群金華中蜂共存在14個單倍型，平均單倍型多樣度Hd為0.610，平均核苷酸多樣度Pi為0.00162。之前鄰近地區(qū)麗水基于相同基因序列的研究發(fā)現(xiàn)94群中蜂存在20個單倍型，平均單倍型多樣度Hd為0.772，平均核苷酸多樣度Pi為0.00352(曹聯(lián)飛等, 2017)。金華市中蜂的遺傳多樣性低于麗水市中蜂。金華交通便利，而麗水多山區(qū)地理隔離條件更好，可能是主要影響因素。基于相同基因序列的福建省中蜂遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)，平均單倍型多樣度為0.484，平均核苷酸多樣度為0.00193(周姝婧等, 2016)。金華市中蜂的平均核苷酸多樣度略小于福建，而平均單倍型多樣度金華市中蜂明顯較大。可能的解釋是金華市中蜂群體經(jīng)歷了快速擴(kuò)張，擴(kuò)張過程中積累了大量的新突變，單倍型多樣性會非常豐富，但是沒有充足的時間積累足夠的核苷酸變異(Aviseetal., 1984)。本研究的群體歷史動態(tài)研究結(jié)果也給予了支持。中蜂適應(yīng)能力較強(qiáng)，當(dāng)氣候環(huán)境適宜時群體數(shù)量增長較快。金華市地處浙中丘陵盆地，蜜源植物豐富，可能為中蜂群體的快速擴(kuò)張?zhí)峁┝擞欣麠l件。

當(dāng)研究個體數(shù)較少時，核苷酸多樣度(Pi)比單倍型多樣度(Hd)更有說服力。金華市中蜂各地理群體中，東陽的核苷酸多樣度最高(0.00282)。此外，東陽與金華市其它地理群體間的遺傳距離也較大，在東陽群體中還發(fā)現(xiàn)了新單倍型JH9，聚類分析中單倍型JH9和JH3單獨聚為一支,說明東陽中蜂群體具有一定的特殊性。一般認(rèn)為，F(xiàn)ST>0.25時, 群體間有很大的遺傳分化。金東群體與金華市其它群體間的遺傳分化系數(shù)FST較大(0.286～0.500)，浦江群體與金華市其它群體間的遺傳分化系數(shù)FST也較大(0.224～0.500)。遺傳距離分析也顯示金東和浦江兩個群體與金華市其它群體間的遺傳距離較大。因此，在未來金華市中蜂資源的保護(hù)與利用中，金東、浦江、東陽群體需要給予重視。