訪花昆蟲野蚜蠅線粒體基因組結(jié)構(gòu)分析

閆 艷，程夢迪，曹春橋，李 虎

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000)

野蚜蠅Syrphustorvus(Osten-Sacken, 1875)是雙翅目Diptera蚜蠅科Syrphidae常見昆蟲，其成蟲和幼蟲在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)過程中都扮演重要角色。成蟲主要外形特征為頭和中胸背板暗黑色；小盾片黃色；腹部黑色，第2背板具1對黃斑，第3、4背板各具黃色橫帶，第4、5背板后緣黃色(黃春梅等，2013)，具有訪花習(xí)性，常見于林間野花、蕓薹屬植物及禾本科植物附近(Fazlullahetal., 2018)，是重要的傳粉昆蟲；幼蟲為蛆，可捕食多種植物上的蚜蟲，在1960年Brown和Clark的研究中，野蚜蠅幼蟲是冷杉球蚜Adelgespiceae的主要天敵之一。該種在古北區(qū)、新北區(qū)、東洋區(qū)、新熱帶區(qū)和澳洲區(qū)均有分布(霍科科等，2006)。

蚜蠅的形態(tài)和體色多變，生物學(xué)特征復(fù)雜，不同學(xué)者提出了不同的分類系統(tǒng)，現(xiàn)行的3亞科分類系統(tǒng)：蚜蠅亞科Syrphinae、管蚜蠅亞科Eristalinae和巢穴蚜蠅亞科Microdontinae，被大多數(shù)學(xué)者接受。近些年來有些學(xué)者利用線粒體與細(xì)胞核的基因片段構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，討論蚜蠅科分類系統(tǒng)，把蚜蠅科中縮顏蚜蠅提為亞科水平，將蚜蠅科劃分為4亞科(蚜蠅亞科、管蚜蠅亞科、巢穴蚜蠅亞科和縮顏蚜蠅亞科Pipizinae)(Mengualetal., 2015)。線粒體基因組由于其母系遺傳、分子較小、突變率高等特點(diǎn)，被廣泛用于昆蟲的鑒定、種群遺傳、物種進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的研究中(Cameron, 2014)。

本研究對野蚜蠅的線粒體基因組全序列進(jìn)行測序組裝、基因注釋，分析其基因組的基本結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)一步豐富了蚜蠅科線粒體基因組學(xué)研究；利用野蚜蠅線粒體全序列并聯(lián)合已公布的21種蚜蠅科線粒體全序列，重新構(gòu)建蚜蠅科系統(tǒng)發(fā)育樹，嘗試對蚜蠅科內(nèi)部分類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行討論分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與保存

本實(shí)驗(yàn)所用的野蚜蠅于2019年3月23日采自陜西省漢中市南鄭區(qū)大漢山(106.93° E, 33.97° N)，無水乙醇浸泡并保存于-20℃的冰箱。

1.2 DNA提取與基因組測序

取野蚜蠅胸部和腿部肌肉組織，用無菌研磨棒將其研磨成粉末狀后嚴(yán)格按照基因組DNA提取試劑盒中使用手冊(天根生化科技有限公司)進(jìn)行基因組DNA提取，檢驗(yàn)合格(使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度>25 mol/μL)后將基因組送至公司于Illumina NovaSeq 6000測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序，測序模式為150 PE，每樣品產(chǎn)生6 GB數(shù)據(jù)，每樣本數(shù)據(jù)量不低于目標(biāo)量的95%，平均Q≥85%。

1.3 PCR擴(kuò)增與測序

COXI基因的片段序列(約600 bp)通過構(gòu)建50 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中基因組DNA 5 μL，TaqDNA聚合酶25 μL，上下游通用引物L(fēng)CO1490(GGTCAACAAATAATAAAGATATTGGG)和HCO2198(TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)和Mg2+各1 μL，超純水17 μL。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min一個(gè)循環(huán)，94℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，最后在72℃下后延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，進(jìn)行測序。

1.4 序列拼接、注釋與分析

利用Geneious R9軟件，使用COXI基因的片段序列作為誘餌進(jìn)行序列組裝，并對獲得的線粒體基因組全序列進(jìn)行注釋，利用ARWEN(Laslett and Canb?ck, 2008)預(yù)測22個(gè)tRNA位置和二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用ClustalX比對意大利蜜蜂Apismellifera、煙草天蛾Manducasexta和橫帶刺莖葉蟬Taharanafasciana的16SrRNAs和12SrRNAs預(yù)測野蚜蠅的2個(gè) rRNAs二級(jí)結(jié)構(gòu)(Gillespieetal., 2006；Cameron and Whiting, 2008；Wangetal., 2017)。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

本研究收集了NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的21條蚜蠅科和2條縞蠅科物種線粒體全基因組序列(表1)。利用包括野蚜蠅在內(nèi)的24個(gè)物種線粒體基因的13個(gè)PCGs序列，使用比對網(wǎng)站http://pc16141.mncn.csic.es/index_v4.html(Abascaletal., 2010)將13個(gè)PCGs序列分別比對后在MEGA7中串聯(lián)(Kumaretal., 2016)，在分區(qū)網(wǎng)站https://cushion3.sdsc.edu/portal2/login!input. action(Milleretal., 2010)上，使用PatitionFinder 2 on XSEDE工具選取適合PCG數(shù)據(jù)集的最佳分區(qū)，BI樹在建樹網(wǎng)站https://cushion3.sdsc.edu/portal2/login!input.action運(yùn)行5 000代，收斂值為0；使用IQ-tree(Nguyenetal., 2015)構(gòu)建ML樹，參數(shù)為Bootstrap analysis: Ultrafast, Number of bootstrap alignments: 1 000, Maximum iterations: 1 000, Minimum correlation: 0.99，重復(fù)1 000次。

表1 本研究所用物種完整線粒體基因組信息

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組結(jié)構(gòu)

野蚜蠅線粒體基因組全長16 444 bp，總A+T含量為80.6%，各類型基因的AT含量均大于78%，表現(xiàn)出較強(qiáng)AT偏向性，詳見表2。線粒體基因組包括13個(gè)PCGs，22個(gè)tRNAs，2個(gè)rRNAs和D-loop區(qū)。基因間隔共19處，最長的間隔位于tRNA-Tyr和COXI之間?；蛑丿B共有12處，最長基因重疊區(qū)位于ATP8和ATP6之間。37個(gè)基因中，4個(gè)tRNAs和9個(gè)PCGs位于J鏈，其余8個(gè)tRNAs、4個(gè)PCGs和2個(gè)rRNAs位于N鏈(表3)。

表2 野蚜蠅線粒體基因組堿基組成及偏向性

表3 野蚜蠅線粒體基因組組成

續(xù)表3 Continued table 3

2.2 蛋白編碼基因

野蚜蠅PCGs序列長度為11 230 bp，A+T含量為78.4%，AT skew為-0.142，T的含量高于A的含量。以ATN為起始密碼子的基因有9個(gè)，其中ND2、ND5和ND6以ATT為起始密碼子，ND4L、COX2和ND3以ATA為起始密碼子，COX3、ND4和Cytb以ATG為起始密碼子；COXI、ATP8、ATP6、和ND1以TTG為起始密碼子。COXI的終止密碼子為不完整T--，ATP6的終止密碼子為TAG，其余11個(gè)PCGs的終止密碼子都為TAA(表3)。

野蚜蠅PCGs序列共編碼5 480個(gè)氨基酸，其中使用頻率最高的密碼子是AAA共437個(gè)，而相對密碼子使用頻率最高的密碼子為UUA，頻率為2.92；Leu是使用頻率最高的氨基酸。從密碼子使用情況來看，使用頻率較高的密碼子，如AAA、AAU和AUU等，它們的堿基大部分都由A、T組成(圖1)，這可能是PCGs序列中AT偏斜大于GC偏斜的原因。

圖1 蛋白編碼基因相對同義密碼子使用和密碼子數(shù)量Fig.1 Relative synonymous codon usage(RSCU)and codon number of PCGs in Syrphus torvus mitogenome

2.3 tRNAs基因與rRNAs基因

22個(gè)tRNAs基因總長度為1 472 bp，單個(gè)基因長度從64 bp(tRNA-Arg)到72 bp(tRNA-Val)不等。22個(gè)tRNAs的二級(jí)結(jié)構(gòu)都是典型的三葉草結(jié)構(gòu)(圖2)，出現(xiàn)了37對錯(cuò)配，其中DHU臂上有18對，反密碼子臂上有10對，氨基酸接受臂上有5對，TΨC上有4對，其中G-T錯(cuò)配數(shù)量最多，共有17對。

圖2 野蚜蠅22個(gè)tRNAs的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary structure of the 22 tRNAs genes of Syrphus torvus

兩個(gè)rRNAs都位于N鏈，16SrRNA位于tRNA-Leu2和tRNA-Val之間，長度為1 342 bp；12SrRNA位于tRNA-Val和D-loop之間，長度為791 bp。16SrRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)由I、II、III、IV、V和VI 6個(gè)區(qū)域組成(節(jié)肢動(dòng)物第Ⅲ區(qū)域缺失)，44個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)(圖3)；12SrRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)由I、II和III 3個(gè)區(qū)域組成，24個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖3 野蚜蠅16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Predicted secondary structure of the 16S rRNA of the mitogenome of Syrphus torvus注：破折號(hào)(-)代表Watson-Crick配對，點(diǎn)(·)代表GU配對。Note：Dashes(-)indicated Watson-Crick base pairing, hereas GU pairs were connected by dots(·).

圖4 野蚜蠅12S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Predicted secondary structure of the 12S rRNA of the mitogenome of Syrphus torvus

2.4 非編碼區(qū)與重疊區(qū)

野蚜蠅線粒體基因組除D-loop區(qū)外，有19個(gè)非編碼區(qū)，長度在2～39 bp之間；9個(gè)重疊區(qū)，長度在1～13之間。

D-loop區(qū)位于12SrRNA與tRNA-Ile之間，長度為1 379 bp?？刂茀^(qū)的A+T含量在所有基因中含量最高，為92.2%。在該區(qū)找到了4個(gè)長度大于15 bp的重復(fù)序列和3個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，詳見圖5。

圖5 野蚜蠅D-loop的重復(fù)序列和莖環(huán)結(jié)構(gòu)Fig.5 Repetitive sequences and the stem-loop structures in the D-loop of Syrphus torvus注：藍(lán)色表示重復(fù)，黃色表示莖環(huán)結(jié)構(gòu)。Note：Bule for repetitions and yellow for stem-loops.

2.5 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

縞蠅科2個(gè)物種作為外群，22種蚜蠅(含本研究測序的野蚜蠅)為內(nèi)群。選擇線粒體全序列的13個(gè)PCGs序列構(gòu)建數(shù)據(jù)集，使用BI和ML兩個(gè)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6～圖7)。在兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹中，野蚜蠅聚在了蚜蠅亞科Syrphinae，始終與黑足蚜蠅Syrphusvitripennis聚成一支，互為姊妹種；蚜蠅亞科物種均聚為一支，且支持度均很高，表現(xiàn)出單系性，管蚜蠅亞科Eristalinae物種沒有聚成一支。

圖6 基于13個(gè)蛋白編碼基因構(gòu)建的貝葉斯樹(BI)Fig.6 BI tree built based on 13 PCGs

圖7 基于13個(gè)蛋白編碼基因構(gòu)建的最大似然樹Fig.7 ML tree built based on 13 PCGs

在蚜蠅亞科中，墨蚜蠅族Melanostomini(東方墨蚜蠅Melanostomaorientale+梯斑墨蚜蠅Melanostomascalare)聚為姊妹種并與蚜蠅族Syrphini互為姊妹群關(guān)系；蚜蠅族中蚜蠅屬(野蚜蠅Syrphustorvu+黑足蚜蠅Syrphusvitripennis)聚為一支；蚜蠅亞科中(((黑帶蚜蠅Episyrphusbalteatus+大角類蚜蠅Simosyrphusgrandicornis)+Ocyptamussativus)+大灰優(yōu)蚜蠅Eupeodescorollae)，它們分屬蚜蠅族不同屬，在系統(tǒng)發(fā)育樹中的聚類與前人研究結(jié)果一致(Puetal., 2017; Li, 2019; Li and Li, 2019、2020)。管蚜蠅亞科中管蚜蠅族Eristalini單獨(dú)聚為一支，而黑蚜蠅族Cheilosiini、迷蚜蠅族Milesiini、蜂蚜蠅族Volucellini和Brachyopini聚在一起并與蚜蠅亞科聚為姊妹群關(guān)系。管蚜蠅族中斑眼蚜蠅屬Eristalinus物種聚為一支，管蚜蠅屬Eristalis兩個(gè)物種聚為姊妹關(guān)系，與Yan等(2020)和Li等(2020)的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

本研究獲得了野蚜蠅Syrphustorvus線粒體基因組全序列，長度為16 444 bp，A+T含量為80.6%，表現(xiàn)出明顯的AT偏向性；野蚜蠅線粒體包含22個(gè)具典型三葉草結(jié)構(gòu)的tRNAs基因，長度在64～72 bp之間；目前蚜蠅科物種線粒體rRNAs基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)還沒有被預(yù)測，由于雙翅目Diptera昆蟲中的rRNA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)都沒有被預(yù)測，本研究參照膜翅目Hymenoptera、鱗翅目Lepidoptera和同翅目Homoptera已預(yù)測的16SrRNA和12SrRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用ClustalX預(yù)測野蚜蠅rRNAs二級(jí)結(jié)構(gòu)。

野蚜蠅D-loop區(qū)的A+T含量最高(92.2%)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)存在一些重復(fù)序列和莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可能在控制DNA甲基化、基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制方面發(fā)揮作用(Huetal., 2019)。在本研究所涉及的22個(gè)蚜蠅的基因間隔區(qū)與重疊區(qū)中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)保守區(qū)域：區(qū)域1：位于tRNA-Trp與tRNA-Cys之間(AAGTCTTA)；區(qū)域2：位于tRNA-Tyr與COXI之間(TCAACTAATCATAAAGAT)；區(qū)域3：位于RNA-Lys和tRNA-Asp之間(Poly A)；區(qū)域4：位于ATP8與ATP6之間(ATGATAA)；區(qū)域5：位于ND4和ND4L之間(TTAACAT)；區(qū)域6：位于ND1與tRNA-Leu2之間(ATAAAACAAC)。區(qū)域1、3、4和6在蚜蠅亞科物種中被發(fā)現(xiàn)；區(qū)域2、4和5在管蚜蠅亞科物種中被發(fā)現(xiàn)。此外，區(qū)域4不僅發(fā)現(xiàn)存在于蚜蠅科，在半翅目Hemiptera一些物種中也有發(fā)現(xiàn)，該區(qū)被認(rèn)為是在翻譯時(shí)作為一個(gè)雙順反子使用(Xuetal., 2019)。這些保守區(qū)域在控制PCGs序列長度和轉(zhuǎn)錄等方面有重要作用(Cameron and Whiting, 2008)。

BI和ML系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，蚜蠅亞科Syrphinae的分支都很穩(wěn)定，其單系性也被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可(Puetal., 2017; Paulietal., 2018；Li, 2019)。而管蚜蠅亞科Eristalinae的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還存在一定的爭議，St?hls等(2003)利用形態(tài)學(xué)與分子相結(jié)合的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹證實(shí)管蚜蠅亞科為單系；然而，近年來，Skevington和Yeates(2000)、Mengual等(2015)、Young等(2016)和Pauli等人(2018)的研究結(jié)果顯示管蚜蠅亞科為并系，本研究結(jié)果也支持這一結(jié)論。

管蚜蠅亞科內(nèi)部的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系存在一定爭議，如斑眼蚜蠅屬Eristalinus，在BI樹中，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖6)如下：(((E.fuscicornis+E.barclayi)+(E.tabanoides+E.vicarians))+黑色斑眼蚜蠅Eristalinusaeneus)，與Sonet等(2019)和Yan等(2020)的研究結(jié)果一致；而在ML拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖7)中：(((E.fuscicornis+E.barclayi)+E.tabanoides)+E.vicarians)+黑色斑眼蚜蠅Eristalinusaeneus)，這與Li等(2019, 2020)研究結(jié)果相同；黑蚜蠅族Cheilosiini、迷蚜蠅族Milesiini、蜂蚜蠅族Volucellini和Brachyopini各只有一個(gè)代表種，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不穩(wěn)定，在BI拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中，黑蜂蚜蠅Volucellanigricans與狹腹斜環(huán)蚜蠅Korinchiaangustiabdomena聚為姊妹種，符合Li(2019)的研究結(jié)果，而在ML拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中，黑蜂蚜蠅和狹腹斜環(huán)蚜蠅沒有聚為一支，與Li等(2020)的研究結(jié)果一致。

本研究得到的兩個(gè)蚜蠅科拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，蚜蠅亞科Syrphinae始終聚成一支，其單系性得到了驗(yàn)證；而管蚜蠅亞科Eristalinae并未聚成一支，可能為并系，支持前人的研究結(jié)果，但這一結(jié)論仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，后期應(yīng)加大基因組測序力度，補(bǔ)充大量蚜蠅科物種基因組后，進(jìn)一步深刻理解、闡明蚜蠅科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。