劉 雙,王亞男

湖南省婦幼保健院婦產(chǎn)科,湖南長沙 410008

宮頸癌是危害女性健康的主要生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其病死率可達50%[1]，因此對宮頸癌進行早發(fā)現(xiàn)早干預(yù)具有重要的臨床實踐意義。高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的危險因素，但是從HR-HPV感染到成為宮頸癌是一個多基因、多因素共同作用的過程[2]。而目前，宮頸癌的早期篩查方法及標(biāo)志物比較缺乏，因此尋找一種特異性的分子標(biāo)志物對宮頸癌及其癌前病變進行早期識別具有重要意義。FAM19A4是TAFA基因家族成員，已經(jīng)有研究證實，F(xiàn)AM19A4甲基化與宮頸癌及其癌前病變存在密切關(guān)系，有望成為一種新型的宮頸癌早期篩查標(biāo)志物[3]。但是目前，關(guān)于FAM19A4甲基化與不同基因型人乳頭瘤病毒(HPV)感染宮頸癌相關(guān)性方面的研究報道比較少見?；诖?，本研究將通過探討FAM19A4甲基化檢測在HR-HPV陽性宮頸癌及其癌前病變評估中的臨床價值，以期為宮頸癌的早期防控提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 連續(xù)性納入2020年1-12月本院收治的80例宮頸癌患者作為宮頸癌組，年齡30～70歲，平均(47.55±8.43)歲；以90例宮頸癌前病變患者作為癌前病變組，年齡28～70歲，平均(45.20±6.91)歲；以同期的80例健康體檢者作為對照組，年齡20～60歲，平均(42.19±5.57)歲。3組研究對象的年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均在陰道鏡下經(jīng)宮頸組織病理學(xué)確診分組，且經(jīng)兩位高級職稱病理科醫(yī)生核實，宮頸癌按2018年FIGO指南分期[4]；(2)癌前病變符合《2019 ASCCP宮頸癌篩查和癌前病變管理指南共識》[5]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)納入研究前未進行相關(guān)藥物治療及手術(shù)；(4)患者年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤;(2)伴有其他宮頸疾病或并發(fā)癥；(3)先天性子宮發(fā)育不良；(4)臨床、影像及病理資料不完整；(5)診療依從性比較差。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審批，患者或家屬均知情并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1HPV的篩查及基因分型 采集宮頸脫落細胞保存于采集瓶中，保存條件4 ℃。標(biāo)本采集前72 h禁止性行為、陰道用藥及沖洗。采用雜交捕獲法進行HPV的篩查及基因分型，該方法能夠檢出13種HR-HPV。

1.2.2DNA提取 利用TIANamp GenomicDNA提取試劑盒提取HR-HPV陽性者的宮頸脫落細胞標(biāo)本中的DNA，按試劑盒說明書操作。立即使用紫外分光光度計對以上提取的DNA進行濃度測量。

1.2.3重亞硫酸鹽修飾 取HR-HPV陽性者的宮頸脫落細胞標(biāo)本進行DNA的提取，然后按照試劑盒說明書要求進行重亞硫酸鹽修飾(EZ DNA甲基化試劑盒-DIRECT由Zymo Research公司提供)；加入900 μL ddH2O和300 μL M-Dilution Buffer和50 μL M-Dissolving S Buffer到CT Conversion Reagent干粉中，充分混勻，室溫下漩渦振蕩10 min；將DNA 標(biāo)本加入PCR管中，130 μL CT Conversion Reagent，充分混勻。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：98 ℃，10 min；64 ℃，30 min；4 ℃保存最長20 h；上述制備的重亞硫酸鹽修飾后 DNA 使用 Quawell Q5000 紫外分光光度計進行濃度測量，立即用于PCR檢測。

1.2.4熒光定量PCR 以ACTB作為內(nèi)參基因進行PCR擴增，擴增引物見表1。擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火20 s及65 ℃延伸40 s，共40個循環(huán)。每個標(biāo)本均重復(fù)試驗3次。擴增結(jié)果通過采集熒光信號，得到循環(huán)閾值(Ct值)及ACTB和FAM19A4的擴增曲線。所有樣品的CtACTB值均< 32，以保證樣品質(zhì)量，CtFAM19A4值>40的標(biāo)本被認為代表陰性檢測結(jié)果，CtFAM19A4值<40的標(biāo)本計算甲基化評分，計算公式：2(CtACTB -CtFAM19A4)×100。擴增曲線目標(biāo)基因越早擴增，甲基化評分越高，表示基因甲基化水平越高。

表1 擴增引物序列

2 結(jié) 果

2.13組HR-HPV檢出率的比較 宮頸癌組、癌前病變組及對照組的HR-HPV陽性率分別為92.50%(74/80)、55.56%(50/90)及7.50%(6/80)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3組HR-HPV陽性者中HPV16/18的感染率分別為66.22%(49/74)、56.00%(28/50)及16.67%(1/6)。

2.23組HR-HPV陽性者FAM19A4基因甲基化檢出率的比較 宮頸癌組FAM19A4基因甲基化檢出率最高,對照組檢出率最低，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。采用 Cochran-Armitage趨勢檢驗發(fā)現(xiàn)宮頸病變程度與FAM19A4甲基化之間存在線性趨勢(P<0.05)，即隨著宮頸病變嚴(yán)重程度增加，F(xiàn)AM19A4基因甲基化的檢出率逐漸升高。見表2。

表2 3組HR-HPV陽性者FAM19A4基因甲基化檢出率的比較

2.3HR-HPV感染的類型與FAM19A4基因甲基化檢出率的關(guān)系 HR-HPV陽性者的宮頸脫落細胞中，宮頸癌組HPV16/18陽性者的FAM19A4基因甲基化檢出率(100.00%)高于非HPV16/18陽性者(92.00%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；癌前病變組中HPV16/18陽性者的FAM19A4甲基化檢出率(75.00%)高于非HPV16/18陽性者(68.18%)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 HR-HPV感染的類型與FAM19A4基因甲基化檢出率的關(guān)系

3 討 論

宮頸癌對女性的生命健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響。HPV基因分型和液基薄層細胞學(xué)檢查(TCT)是目前臨床對宮頸癌進行篩查的主要手段，但是TCT的靈敏度比較低，容易產(chǎn)生假陰性，HPV基因分型與TCT聯(lián)合檢測的靈敏度雖然得到了提高，但是特異性并沒有得到改善[6]。有研究證實，降低或者清除HPV感染能夠?qū)m頸癌起到有效的防治作用，但是目前還沒有治療HPV感染的特效方法[7]。本研究對宮頸癌患者、宮頸癌前病變患者及健康體檢者中的HR-HPV陽性率進行了篩查，結(jié)果顯示：宮頸癌患者的HR-HPV陽性率(92.50%)最高，其次是宮頸癌前病變患者(55.56%)、健康體檢者(7.50%)，具有明顯差異，與以往研究的報道一致[8]。說明HR-HPV感染對宮頸癌及其癌前病變的早期篩查具有重要意義。

單純的HR-HPV感染并不足以導(dǎo)致宮頸上皮細胞發(fā)生惡變，表觀遺傳學(xué)發(fā)生改變能夠?qū)m頸癌的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生影響[9]。FAM19A4是一種分泌蛋白，在正常組織中呈低水平表達，在單核細胞及巨噬細胞中呈高水平表達，能夠?qū)奘杉毎耐淌杉斑w移起到促進作用，對炎癥及應(yīng)激反應(yīng)起到調(diào)控作用[10]。有研究顯示，宮頸癌組織中FAM19A4甲基化的檢出率明顯高于正常組織[11]。多項研究證實，F(xiàn)AM19A4甲基化在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[12-13]。本研究通過檢測HR-HPV陽性患者宮頸脫落細胞標(biāo)本中的 FAM19A4甲基化，結(jié)果顯示隨著宮頸病變嚴(yán)重程度增加，F(xiàn)AM19A4甲基化檢出率升高。本研究還發(fā)現(xiàn)HR-HPV陽性宮頸癌患者中HPV16/18陽性者的FAM19A4基因甲基化檢出率高于非HPV16/18陽性者(P<0.05)，在癌前病變組該差異無統(tǒng)計學(xué)意義可能與樣本量小有關(guān)。目前，關(guān)于HPV感染與宮頸癌基因異常甲基化之間的相關(guān)性還不夠清楚；有研究顯示，HR-HPV的E6/E7基因能夠促進DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1的表達，對E6基因進行敲除后DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1的表達也降低[14-15]；在轉(zhuǎn)染了HPV16/18的細胞中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b均呈高水平的表達[16]。由此，本研究可以認為宮頸癌及其癌前病變組織中FAM19A4甲基化的改變，可能與 HPV16/18誘導(dǎo)的表觀遺傳重新編程有關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)AM19A4 基因可能是宮頸細胞癌變的特異性分子標(biāo)志物，該基因甲基化可能在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著一定作用。宮頸脫落細胞FAM19A4基因甲基化檢測可能作為宮頸癌及癌前病變的輔助篩查方法。然而，為了進一步確認其診斷價值，需要進行大樣本量的前瞻性研究。