王飄，鄭晴，胡婷，張海銀，許言午，包怡敏

基于PI3K/Akt/mTOR信號通路的三七總皂苷調控自噬抗H9c2細胞缺氧/復氧損傷機制研究

王飄，鄭晴，胡婷，張海銀，許言午，包怡敏

上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，上海 201203

探討三七總皂苷（PNS）能否通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調控自噬從而減輕H9c2細胞缺氧/復氧損傷機制。將H9c2細胞分為正常組、缺氧/復氧（A/R）組、A/R＋PNS組、A/R＋PNS＋雷帕霉素（Rapa）組、A/R＋Rapa組、A/R＋羥氯喹（HCQ）組、A/R＋3-甲基腺嘌呤（3-MA）組。通過缺氧6 h、復氧2 h建立H9c2細胞A/R模型。CCK-8法檢測細胞存活率，乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒檢測細胞損傷，Western blot檢測自噬相關蛋白Atg5、p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白PI3K、Akt、mTOR的表達，熒光法觀察細胞自噬流。與正常組比較，A/R組H9c2細胞存活率明顯下降，細胞損傷率明顯升高（＜0.05），自噬相關蛋白Atg5、Beclin-1表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高（＜0.05），自噬體和自噬溶酶體數(shù)量顯著增加，自噬流顯著增強（＜0.05）；與A/R組比較，用PNS預處理后，H9c2細胞存活率明顯上升，細胞損傷率明顯降低（＜0.05），自噬相關蛋白Atg5、Beclin-1表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低（＜0.05），p62蛋白表達明顯升高，與自噬抑制劑HCQ、3-MA作用相似，熒光結果顯示，PNS對自噬流有明顯抑制作用（＜0.05）；PNS預處理后p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達明顯升高（＜0.05）。PNS能有效減輕H9c2細胞A/R損傷，其機制與激活PI3K/Akt/mTOR信號通路從而抑制自噬流相關。

三七總皂苷；缺氧/復氧損傷；自噬；PI3K/Akt/mTOR信號通路；H9c2細胞

缺血性心臟病發(fā)病率逐年上升，迄今已成為發(fā)病率及致死率最高的疾病之一[1]。雖通過藥物或手術等手段可達到恢復血流灌注的目的[2]，但恢復過程中可引起不可逆的心肌組織損傷，即心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）[3]。目前研究表明，細胞自噬作為內源性調節(jié)機制參與到MIRI過程中[4]，抑制過度自噬可減輕MIRI[5]。研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路可抑制自噬并減少細胞氧化應激的發(fā)生[6-7]。中藥毒副作用小、安全性高，對MIRI防治效果較好。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，三七主要成分三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）能通過抗氧化應激、抗凋亡等途徑減輕MIRI[8-9]，但其能否通過調節(jié)自噬減輕MIRI仍不清楚。因此，本研究通過觀察PNS對缺氧/復氧H9c2細胞的影響，運用自噬激動劑及自噬抑制劑等工具藥，觀察PNS對自噬流的作用，探討PNS能否通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調控自噬流，從而達到減輕MIRI的目的。

1 材料與方法

1.1 細胞株和藥物

H9c2細胞，中國科學院上海細胞庫。血栓通注射液（成分PNS），昆明制藥集團股份有限公司，批號13HK03；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA），MCE，批號HY-19312；自噬抑制劑羥氯喹（HCQ），Selleck，批號S4430；自噬激動劑雷帕霉素（Rapa），MCE，批號HY-10219。

1.2 主要試劑與儀器

CCK-8，上海翊圣生物科技有限公司，批號40203ES76；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒，同仁化學研究所，批號CK12；DAPRed，同仁化學研究所，批號D677；DALGreen，同仁化學研究所，批號D675；SQSTM1/p62（CST，貨號5114s）、Beclin-1（CST，貨號3495s）、LC3B/MAP1LC3B（Novus，貨號NB100-2220）、Atg 5（CST，貨號12994s）、Akt（CST，貨號4691s）、p-Akt（CST，貨號4060s）、PI3K（CST，貨號4257S）、p-PI3K（Abcam，貨號ab182651）、mTOR（CST，貨號2983S）、p-mTOR（CST，貨號5536S）抗體。全自動凝膠成像系統(tǒng)，上海天能公司，型號Tanon-2500；激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡，型號TCS SP8；細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific，型號class100；超凈臺，蘇州凈化設備公司，型號SW-CS-IFD。

1.3 分組、造模及給藥

將H9c2細胞分為正常組、缺氧/復氧（A/R）組、A/R＋PNS組、A/R＋PNS＋Rapa組、A/R＋Rapa組、A/R＋HCQ組、A/R＋3-MA組。造模前H9c2細胞分別用含PNS（100 μg/mL）、Rapa（50 nmol/L）、HCQ（50 μmol/L）、3-MA（5 mmol/L）的培養(yǎng)液處理2 h。A/R模型制備時，細胞培養(yǎng)液更換為含/不含藥物的無血清培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿置于缺氧條件下（95%N2和5%CO2）培養(yǎng)6 h，之后培養(yǎng)液更換為含/不含藥物的正常培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。正常組細胞正常條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。

1.4 細胞存活率檢測

將細胞按1×105個/孔鋪于96孔板，另設只添加培養(yǎng)液的空白組。造模前PNS組根據藥物濃度梯度給藥2 h；缺氧前PNS組和A/R組分別更換為含/不含藥物的無血清培養(yǎng)液；缺氧6 h后，更換為含/不含藥物的正常培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；2 h后每孔加入10 μL CCK-8，培養(yǎng)1 h，于酶標儀波長450 nm處檢測OD值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝（模型組OD值－空白組OD值）÷（正常組OD值－空白組OD值）×100%。

1.5 細胞損傷率檢測

根據LDH試劑盒說明書配制工作液。造模完成后，每孔加100 μL工作液，用鋁箔紙包裹96孔板，避光室溫反應30 min；反應結束后每孔加50 μL終止液，并于酶標儀波長490 nm處檢測OD值，計算細胞損傷率。細胞損傷率（%）＝（模型組OD值－空白組OD值）÷（正常組OD值－空白組OD值）×100%。

1.6 細胞自噬熒光檢測

將細胞按2×105個/皿鋪于激光共聚焦專用皿中，培養(yǎng)24 h；依次使用1 μmol/L紅色熒光（DAPRed）和0.5 μmol/L綠色熒光（DALGreen）在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min[10]；隨后進行A/R造模，最后在相同條件下使用激光共聚焦顯微鏡進行熒光圖片拍攝。自噬體被DAPRed染色，自噬溶酶體被DALGreen染色。根據紅綠熒光強度判斷細胞自噬體、自噬溶酶體數(shù)量和自噬流的變化。

1.7 Western blot檢測

造模結束后收集細胞，RIPA裂解液裂解細胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清得細胞總蛋白；BCA法檢測蛋白濃度。蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%BSA封閉1 h，加入稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑顯影蛋白條帶，Image J軟件測定蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 三七總皂苷對模型細胞存活率及損傷率的影響

與正常組比較，A/R組H9c2細胞存活率明顯降低（＜0.05），細胞損傷率明顯升高（＜0.05）；與A/R組比較，PNS濃度為100、200 μg/mL時，H9c2細胞存活率明顯升高（＜0.05）；PNS濃度為50、100、200 μg/mL時，H9c2細胞損傷率明顯降低（＜0.05）。見圖1、圖2。綜合細胞存活率及損傷率結果可以看出，濃度為100 μg/mL PNS減輕A/R損傷效果最顯著。

注：與正常組比較，*P＜0.05；與A/R組比較，#P＜0.05

注：與正常組比較，*P＜0.05；與A/R組比較，#P＜0.05

2.2 三七總皂苷對模型細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響

與正常組比較，A/R組H9c2細胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；與A/R組比較，PNS預處理后，H9c2細胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），見圖3。

注：A.正常組；B. A/R組；C. A/R＋PNS組；與A/R組比較；#P＜0.05

2.3 三七總皂苷對模型細胞自噬相關蛋白表達的影響

與正常組比較，A/R組H9c2細胞Atg5、Beclin-1蛋白表達明顯升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著增加（＜0.05），p62蛋白表達無明顯變化；與A/R組比較，A/R＋PNS組H9c2細胞自噬相關蛋白Atg5、Beclin-1表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低（＜0.05），p62蛋白表達明顯升高（＜0.05），見圖4。表明PNS對自噬有明顯抑制作用，且可能抑制自噬流，其作用與自噬抑制劑HCQ和3-MA一致。此外，A/R＋PNS＋Rapa組H9c2細胞Atg5、Beclin-1蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯低于A/R＋Rapa組，提示PNS逆轉了Rapa增強自噬的作用。

2.4 三七總皂苷對模型細胞自噬流的影響

使用自噬熒光染料標記H9c2細胞，DAPRed代表自噬體，DALGreen代表自噬溶酶體。結果顯示，正常組DAPRed和DALGreen熒光強度較弱，表明此時自噬程度較低。經A/R造模后各組DAPRed和DALGreen熒光強度均明顯增強，見圖5a，表明A/R后自噬增強。結果顯示，A/R組和A/R＋Rapa組DAPRed和DALGreen熒光強度明顯增強（＜0.05），表明自噬流水平顯著增加；與A/R組比較，A/R＋PNS組和A/R＋3-MA組DAPRed熒光強度明顯降低（＜0.05），見圖5b，表明此時自噬體形成較少，但PNS無3-MA作用強。A/R＋PNS組和A/R＋HCQ組DALGreen熒光強度明顯低于A/R組（＜0.05），見圖5c，表明此時自噬溶酶體數(shù)量減少，其可能與前期對自噬體生成抑制有關；也可能是PNS與HCQ作用效果一致，即對自噬溶酶體形成產生抑制作用。此外，A/R＋PNS＋Rapa組DALGreen熒光強度明顯低于A/R＋Rapa組（＜0.05），表明PNS可能通過抑制自噬溶酶體形成逆轉Rapa的作用。綜合自噬蛋白表達與熒光結果發(fā)現(xiàn)，PNS可通過抑制自噬體及自噬溶酶體的形成抑制自噬流。

A.正常組；B. A/R組；C. A/R＋PNS組；D. A/R＋PNS＋Rapa組；E. A/R＋Rapa組；F. A/R＋HCQ組；G. A/R＋3-MA組；與正常組比較，*P＜0.05；與A/R組比較，#P＜0.05；與A/R＋Rapa組比較，▲P＜0.05

注：A.正常組；B. A/R組；C. A/R＋PNS組；D. A/R＋PNS＋Rapa組；E. A/R＋Rapa組；F. A/R＋HCQ組；G. A/R＋3-MA組；與正常組比較，*P＜0.05；與A/R組比較，#P＜0.05；與A/R＋Rapa組比較，▲P＜0.05

3 討論

心肌缺血再灌注可引起心肌細胞損傷甚至死亡，表現(xiàn)為心功能下降、心律失常等。本研究采用H9c2細胞制備A/R模型，模擬在體心肌缺血/再灌注模型，觀察PNS對A/R損傷細胞的影響。本實驗結果顯示，A/R后H9c2細胞存活率明顯下降，100、200 μg/mL PNS處理后細胞存活率明顯升高。除細胞活力檢測外，細胞培養(yǎng)液LDH含量檢測也能部分反映細胞損傷情況。LDH在細胞受損或死亡時被釋放到細胞外環(huán)境。本實驗中，不同濃度PNS處理細胞后，其培養(yǎng)液中LDH含量呈劑量依賴性降低，且濃度為50、100、200 μg/mL時較A/R組差異有統(tǒng)計學意義，表明此濃度PNS對H9c2細胞A/R損傷有一定的改善作用。

現(xiàn)有研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路可能因損傷、氧化應激等刺激而被激活[11]，是保護心肌減輕MIRI的有效手段之一。此外，PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活與自噬的發(fā)生密切相關[12]。當發(fā)生MIRI時，PI3K被激活并可上調自噬的關鍵調節(jié)因子，包括Akt，PI3K可磷酸化Akt的Thr308和Ser473位點使Akt活化[13-14]，而活化的Akt可磷酸化mTOR[15]。mTOR是細胞生長和代謝的關鍵調節(jié)劑，其mTORC1亞型也是自噬過程中發(fā)揮調節(jié)作用的上游活性因子之一[16]。磷酸化的mTOR可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制由局部缺血誘導的瞬時自噬，從而降低MIRI[17-18]。本實驗結果表明，A/R組p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表達無明顯變化，PNS組p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表達顯著升高，表明PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活。

為探討PNS能否通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調控自噬，本研究進行了自噬相關實驗。心肌缺血時自噬增強，以清除受損的細胞器和細胞；再灌注時過高水平的自噬則加速心肌細胞死亡，導致MIRI[19]。自噬相關蛋白Atg5、Beclin-1表達水平可反映細胞自噬起始階段的變化情況[20-21]。LC3存在于自噬小體，同時也對自噬體形成具有重要作用[22]，當自噬發(fā)生時，LC3Ⅰ大量轉化為LC3Ⅱ，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加[23]。本研究中，A/R組H9c2細胞Atg5、Beclin-1蛋白表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高，表明此時自噬水平上升；而PNS處理后H9c2細胞Atg5、Beclin-1表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低，表明PNS逆轉了A/R所致的自噬相關蛋白表達升高的趨勢，對自噬有一定的抑制作用。p62作為自噬下游階段的經典標志物之一，也可反映自噬的變化，其可與自噬體內膜上的泛素化底物和LC3結合，并通過在溶酶體系統(tǒng)中形成自噬溶酶體而被降解[24]。當自噬被抑制時，p62蛋白表達升高[25]。本研究結果顯示，PNS預處理后，H9c2細胞p62蛋白表達明顯升高，結合LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的變化，推測自噬體與溶酶體結合受阻，自噬流處于被抑制狀態(tài)。

為探明PNS對自噬流的作用，我們通過自噬熒光檢測自噬體和自噬溶酶體的形成情況，觀察PNS對自噬流上下游環(huán)節(jié)的作用。細胞自噬熒光檢測試劑可觀察自噬流的整個過程，以DAPRed標記自噬體，其熒光強度較弱時，表明自噬體數(shù)量較少；以DALGreen標記自噬溶酶體，其熒光強度弱時，表明自噬溶酶體數(shù)量較少，其生成可能受阻或被過度降解。本實驗結果顯示，正常組DAPRed和DALGreen熒光強度較弱，表明自噬程度較低；A/R組H9c2細胞DAPRed和DALGreen熒光強度均明顯增強，表明A/R可顯著增強自噬流。與A/R組比較，A/R＋PNS組和A/R＋3-MA組DAPRed熒光強度明顯降低，表明PNS與3-MA作用相似，即可抑制自噬體形成和發(fā)展[26]；由于PNS不能完全抑制自噬體的形成，因此使用自噬抑制劑HCQ，結果顯示，A/R＋PNS組和A/R＋HCQ組DALGreen熒光強度明顯降低，表明PNS與HCQ作用相似，可能抑制自噬溶酶體形成[27]。此外，A/R＋PNS＋Rapa組DALGreen熒光強度低于A/R＋Rapa組，表明PNS可通過抑制自噬溶酶體發(fā)揮逆轉Rapa的作用。綜合自噬蛋白表達及熒光結果，表明PNS影響自噬流的上下游環(huán)節(jié)，抑制自噬體及自噬溶酶體的形成，從而抑制自噬流。

綜上，PNS可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制自噬流，發(fā)揮對A/R H9c2細胞的保護作用，從而達到減輕MIRI保護心臟的作用。

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Study on Panax Notoginseng Saponins Regulate Autophagy Against H9c2 Cells Anoxia/reoxygenation Injury via PI3K/Akt/mTOR Signaling Pathway

WANG Piao, ZHENG Qing, HU Ting, ZHANG Haiyin, XU Yanwu, BAO Yimin

To explore mechanism whether Panax notoginseng saponins (PNS) can regulate autophagy through the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway to reduce anoxia/reoxygenation (A/R) injury of H9c2 cells.H9c2 cells were divided into seven groups: control, anoxia-reoxygenation (A/R), A/R+PNS, A/R+PNS+ Rapamycin (Rapa), A/R+Rapa, A/R+hydroxychloroquine (HCQ), and A/R+3-methyladenine (3-MA). The A/R model of H9c2 cells was established by anoxia for 6 h and reoxygenation for 2 h. Cell survival rate was detected by CCk-8 method; cell damage was detected by LDH detection kit; autophagy-related proteins of Atg5, p62, Beclin-1, LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and PI3K/Akt/mTOR signaling pathway related proteins PI3K, Akt, mTOR expression were detected by Western blot; autophagy flow was observed by fluorescence.Compared with the control group, the cell viability of A/R group was decreased significantly while the cell damage rate was increased (<0.05). The expressions of autophagy-related proteins Atg5, Beclin-1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio were increased significantly (<0.05); The numbers of autophagosome and autolysosome increased significantly, and the level of autophagic flow increased significantly (<0.05). Compared with the A/R group, PNS preconditioning increased cell viability, reduced cell damage rate (<0.05); The expressions of Atg5, Beclin-1, and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio were reduced significantly (<0.05), and the expression of p62 was increased significantly, which were similar to the autophagy inhibitors HCQ and 3-MA; Autophagy fluorescence detection also revealed an inhibition of autophagic flow (<0.05). The expressions of p-PI3K, p-Akt and p-mTOR protein were increased after PNS preconditioning (<0.05).PNS can effectively reduce A/R damage in H9c2 cells, and its mechanism is related to the inhibition of autophagic flow by activating the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Panax notoginseng saponins; anoxia/reoxygenation injury; autophagy; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; H9c2 cells

R285.5

A

1005-5304(2021)08-0087-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202012070

國家自然科學基金（81303256）

包怡敏，E-mail：yiminbao@163.com

（收稿日期：2020-12-04）

（修回日期：2021-01-05；編輯：華強）