賈棋 樊秦凱 侯文清 楊晨光 王利邦王浩 徐春華 李明 陸穎?

1) (中國科學院物理研究所, 北京 100190)

2) (中國科學院大學, 北京 100049)

DNA聚合酶是執(zhí)行DNA復(fù)制和修復(fù)的重要蛋白, 由于其只能從5′向3′方向聚合, 所以在聚合雙鏈DNA時會有兩種模式: 其一是先打開DNA雙鏈, 讓其暴露出3′-5′方向的模板鏈(先導(dǎo)鏈), 然后沿著這條鏈復(fù)制出新鏈以此置換舊鏈, 這就是鏈置換的合成.另一種是沿著已經(jīng)置換出的5′-3′方向的模板鏈(滯后鏈)進行延伸合成.T7噬菌體作為常被研究的模式生物, 其DNA聚合酶gp5在復(fù)制過程中既會參與鏈置換也會參與延伸合成, 已有的研究報道gp5自身獨立鏈置換的能力很弱, 其與T7解旋酶gp4耦合形成復(fù)制體后可以發(fā)生快速且持續(xù)的鏈置換, 這一現(xiàn)象的分子機制尚待厘清.本文通過單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的方法對gp5聚合過程的動力學進行了研究, 發(fā)現(xiàn)gp5在沒有外力幫助下時會進入鏈置換-外切的循環(huán), 導(dǎo)致聚合難以延伸, 調(diào)控這一循環(huán)的關(guān)鍵則是DNA雙鏈退火壓力.進一步的實驗表明gp5和gp4形成復(fù)制體后,gp4輔助gp5克服了退火壓力從而聚合可以延伸.

1 引 言

DNA復(fù)制過程中解旋酶和聚合酶會形成一個復(fù)制體先解開DNA雙鏈讓其形成3′-5′方向先導(dǎo)鏈和5′-3′方向滯后鏈.在先導(dǎo)鏈上聚合酶聚合的方向和打開DNA的方向是一致的, 所以會連續(xù)復(fù)制并且會置換出滯后鏈, 這種復(fù)制又被稱為鏈置換.而滯后鏈上聚合酶聚合的方向與打開DNA的方向相反, 只能打開一段再合成一段導(dǎo)致其合成是不連續(xù)的進而形成岡崎片段[1,2].由于DNA復(fù)制機制在各個物種間是高度保守的[1], 而T7噬菌體復(fù)制時所需蛋白非常簡單, 僅由DNA聚合酶(gp5)、DNA解旋酶(gp4)及單鏈結(jié)合蛋白(gp2.5)組成,是一個良好的研究模型[3-5].形成復(fù)制體后gp5聚合酶有著高速合成DNA的能力, 其鏈置換速度在飽和的脫氧核糖三磷酸(100 μmol/L dNTP)下可以達到200個核苷酸(nt)每秒[6,7].gp4作為解旋酶, 其單獨解旋速度在飽和脫氧脫氧胸苷三磷酸(1 mmol/L dTTP)下只能達到20 nt每秒, 遠遠低于gp5的速度[6-8].最近, 冷凍電鏡的研究發(fā)現(xiàn),gp5的前端有一個起到打開DNA雙鏈效果的氨基酸二級結(jié)構(gòu)[9], 也就是說gp5自身具有打開雙鏈的能力.又有報道顯示gp5如果沒有g(shù)p4的幫助就難以進行鏈置換[7,10].因此, 聚合酶在先導(dǎo)鏈上鏈置換過程的分子機制值得研究.

有研究者通過單分子磁鑷的方式對DNA雙鏈施加大于8 pN的拉力時, gp5可以持續(xù)鏈置換但是也有持續(xù)外切的現(xiàn)象, 而將外力變小, 持續(xù)外切的情況就會更加頻繁導(dǎo)致gp5難以鏈置換[11].這一結(jié)果說明了gp5可以獨自鏈置換, 但是新合成的堿基又會被外切掉.由于技術(shù)局限, 磁鑷無法在完全沒有力作用下(生理條件下)對gp5的鏈置換和外切進行測量, 這也留下了疑問: gp5在沒有力作用下, 有無一定程度的鏈置換及外切的現(xiàn)象.

這里我們使用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的方法在一個沒有力的生理條件下, 并在一個接近單核苷酸尺度的分辨率下對gp5的鏈置換動力學進行測量.本工作發(fā)現(xiàn)即使沒有外力的幫助, gp5也可以鏈置換, 但是鏈置換到4 nt左右后就會回退.通過突變掉外切活性的蛋白, 證明了這種回退是外切導(dǎo)致的.為了證明退火壓力對gp5的影響, 本文使用了納米張力器的FRET方法,對DNA雙鏈施加了一個微小的力[12,13], 以此來減弱DNA雙鏈的退火壓力.施加力后外切的長度減小、鏈置換的長度提高了.進一步的實驗發(fā)現(xiàn)gp4和gp5形成了復(fù)制體后合成速度會有一定升高, 而其最主要的特征是不再有外切的出現(xiàn).這說明了gp4幫助gp5克服了DNA的退火壓力, 從而減少了gp5外切的發(fā)生.

2 實驗材料與方法

2.1 聚丙烯酰胺電泳凝膠實驗步驟

首先配置12%聚丙烯酰胺電泳凝膠: 48 g尿素, 30 mL 40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺(19∶1)溶液, 10 mL 10 × TBE, H2O(補足100 mL), 10%APS 700 μL, TEMED 66 μL.配置好后在電泳儀上以400 V的電壓預(yù)跑30 min.在這一過程中準備電泳的樣品, 分別是樣品1: 10 nmol/L DNA;樣品2: 加入40 nmol/L DNA, 40 nmol/L gp5,100 μmol/L dNTP, 1 mmol/L二 硫 疏 糖 醇 在37 ℃水浴反應(yīng)1 min后用100 mmol/L EDTA終止反應(yīng); 樣品3: 使用exo—gp5, 其余和樣品2一樣; 樣品4: 和樣品2一樣, 但是反應(yīng)時間為5 min;樣品5: 和樣品3一樣, 但是反應(yīng)時間為5 min.然后將5個樣品加入不同的條帶處進行3 h的電泳,最后用凝膠成像儀分析條帶位置.

2.2 單分子實驗玻片的清洗與修飾

首先使用丙酮、甲醇、食人魚洗液(濃硫酸+雙氧水)對玻片進行深度清潔, 接著使用硅烷化試劑進行修飾, 最后使用100∶1的mPEG和biotin-PEG經(jīng)行修飾.詳情可以見參考文獻[14].

2.3 單分子熒光共振能量實驗步驟

首先將上訴的玻片用雙面膠粘成具有不同通道的樣品池, 接著加入鏈酶親和素連接波片的biotin-PEG, 然后加入100 pmol/L DNA, 最后加入1 nmol/L gp5和4 μmol/L dNTP, 收集Cy3和Cy5的光強信息, 并以此計算熒光轉(zhuǎn)移效率.對于gp5和gp4一起加入的實驗過程為, 先體外孵育1 nmol/L gp5, 20 nmol/L gp4和100 μmol/L dTTP形成復(fù)合體再加入到樣品池中.

2.4 蛋白和緩沖液

gp5購買于NEB公司, exo—gp5購買于GE health公司.gp4按照文獻[15]的方法純化得到.dNTP購買于Takara公司.DNA購買于上海生工公司, 退火的方法詳見文獻[16].實驗時的緩沖體系為: 50 mmol/L NaCl, 20 mmol/L pH為7.9的Tris緩沖液, 10 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L DTT.

3 結(jié)果與討論

3.1 外切活性對gp5鏈置換的影響

之前的文獻認為持續(xù)外切是導(dǎo)致gp5無法鏈置換的原因[11], 為了直接證明這一點, 本文使用突變了外切活性的exo—gp5作為對照組實驗(為了區(qū)分, 在后續(xù)的結(jié)果與討論部分, 把沒有突變的野生型gp5寫作exo+gp5), 并建立了如圖1(a)所示的DNA, 其引物鏈末端標記了Alexa488, 而變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)被用來分離這些引物鏈,最后使用488 nm激光照明就可以特異性地得到引物鏈的長度, 進而得知DNA聚合酶的鏈置換情況.通過對比exo+gp5和exo—gp5反應(yīng)產(chǎn)物, 從圖1(b)電泳結(jié)果的第3道中可以發(fā)現(xiàn)在1 min的時間內(nèi)exo—gp5大部分產(chǎn)物都被全部鏈置換了,只有極少數(shù)留在原來的位置, 相反的是, 在圖1(b)電泳結(jié)果的第2道中exo+gp5只有極少數(shù)全部被鏈置換.不僅如此, exo+gp5還外切了一些原有DNA.通過在圖1(b)電泳結(jié)果第4道和第5道中展示的延長反應(yīng)時間后的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn): 所有exo—gp5都全部合成了, 但是exo+gp5仍然只有很少的全長延伸產(chǎn)物.從聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的結(jié)果可以得知, exo+gp5是一個雙向的馬達, 它既可以鏈置換也可以外切, 但是由于外切活性的存在導(dǎo)致了其鏈置換能力很弱, 甚至會把原有的DNA外切的更短.而如果突變了外切活性, exo—gp5可以獨立的打開DNA雙鏈并進行合成.由于PAGE實驗只展示了最后的結(jié)果, 無法看到exo+gp5在鏈置換與外切中切換的動態(tài)過程, 也就無法測量exo+gp5單次鏈置換和外切的長度和速度,所以我們使用了單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法[17,18]來實時觀測其轉(zhuǎn)化的方式和原因.

圖1 exo+ gp5和exo— gp5的PAGE實驗 (a)電泳實驗的DNA, 在引物鏈5′端標記有Alexa488; (b) 對Alexa488照明得到的結(jié)果: 第1個條帶為DNA的原始長度, 第2個條帶是exo+ gp5合成1 min后的結(jié)果, 第3個條帶是exo— gp5合成1 min后的結(jié)果, 第4個條帶是exo+ gp5合成5 min后的結(jié)果, 第5個條帶是exo— gp5合成5 min后的結(jié)果Fig.1.PAGE assays of exo+ gp5 and exo— gp5.(a) Illustration of DNA that used in PAGE assays.Alexa488 is labeled on the 5′ overhand of primer DNA.(b) Results of various condition.The first lane: Original length of the DNA.The second lane: The synthesis-product of exo+ gp5 with 1 minute.The third lane: The synthesis-product of exo—gp5 with 1 minute.The fourth lane: The synthesis-product of exo+ gp5 with 5 minute.The fifth lane: The synthesisproduct of exo— gp5 with 5 minute.

3.2 gp5外切與鏈置換的動態(tài)過程

構(gòu)建了如圖2(a)所示的Y型DNA, 通過標記在DNA不同單鏈上的Cy3和Cy5來進行測量DNA聚合酶鏈置換的長度和速度.當DNA聚合酶打開DNA雙鏈時, Cy3和Cy5的距離會變遠,進而導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移效率FRET降低, 相反當DNA聚合酶回退時, FRET就會增加.因為FRET和距離的關(guān)系為6次方, 所以這種方法可以達到2—3 ?的精度.

之前報道中發(fā)現(xiàn)輔助因子Trx會幫助exo+gp5結(jié)合DNA, 進而延長exo+gp5在延伸時的合成長度, 使其從數(shù)十nt的量級變到數(shù)百nt的量級[19].圖2(a)和圖2(b)展示了不加入Trx的對照組實驗結(jié)果, exo+gp5幾乎無法鏈置換, 而從圖2(c)和圖2(d)可以看出加入Trx后exo+gp5可以打開DNA雙鏈進行鏈置換, 進而使得FRET下降,但是FRET下降到一定長度后就會發(fā)生回退.這里我們對曲線中每次下降的長度(synthesis processivity)進行統(tǒng)計, 通過擬合可以發(fā)現(xiàn)下降長度的分布是單e指數(shù)分布, 其分布的平均長度 〈 processivity 〉 = 0.26 ± 0.03 (圖2(g)).根據(jù)文獻[17]結(jié)果在不加力時ΔFRET = 0.07約為1 nt, 也就可以將下降的平均長度換算為約3.7個核苷酸.在之前的工作[11]中認為只有大于8 pN才有合成的出現(xiàn), 而在4 pN時只有外切被發(fā)現(xiàn), 這可能是其精度所限導(dǎo)致的, 無法看到這種短片段的鏈置換.本工作進一步對其鏈置換速度進行分析(鏈置換長度/時間), 發(fā)現(xiàn)其速度即使在低濃度dNTP(4 μmol/L)也可以達到8 nt/s (圖4(d)), 這些現(xiàn)象說明exo+gp5獨自鏈置換的速度是很快的, 但是容易回退.為了直接研究這種回退到底是什么導(dǎo)致的, 采用突變了外切結(jié)構(gòu)域的exo—gp5作為對照組進行了smFRET實驗, 從圖2(e)和圖2(f)可以發(fā)現(xiàn)在exo—gp5的實驗中幾乎就沒有回退的現(xiàn)象, 這說明了回退的確是外切導(dǎo)致的.之前的單分子文獻發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶在鏈置換時有持續(xù)外切的現(xiàn)象, 但是由于都是在施加外力的情況下發(fā)現(xiàn)的, 所以可能無法證實沒有力的情況下是否還有持續(xù)外切[11,20,21].我們對曲線中每次回退的長度(excision processivity)進行了統(tǒng)計, 從圖2(h)的擬合可以發(fā)現(xiàn)其長度的分布也是單e指數(shù)衰減的,平均長度為0.24 ± 0.03, 換算后就是在3.4 nt左右, 這一現(xiàn)象驗證了即使沒有外力的介入, exo+gp5在鏈置換時也有持續(xù)外切的現(xiàn)象.通過這些實驗可以發(fā)現(xiàn), gp5鏈置換到4 nt左右時, exo+gp5就開始外切, 而由于鏈置換和外切的長度差不多,聚合酶此時進入了鏈置換-外切的循環(huán)中無法真正的進行鏈置換.本文也發(fā)現(xiàn)如果外切活性突變后,聚合酶就可以一直鏈置換, 但是沒有了外切活性,聚合酶的復(fù)制保真度會大大降低, 導(dǎo)致生命復(fù)制的錯誤率增加.

圖2 T7 DNA聚合酶gp5不斷重復(fù)鏈置換和外切 (a), (b)沒有結(jié)合輔助因子Trx時聚合酶無法鏈置換DNA雙鏈; (c), (d)有輔助因子Trx時聚合酶能夠部分鏈置換DNA, 但是會回退; (e), (f)外切活性突變后的gp5不會再外切; (g) exo+ gp5 + Trx實驗中合成長度的統(tǒng)計圖, 其分布滿足單e指數(shù); (h) exo+ gp5 + Trx實驗中外切長度的統(tǒng)計圖, 其分布滿足單e指數(shù)Fig.2.T7 DNA polymerase gp5 repeats in synthesis-excision cycle: (a), (b) exo+ gp5 cannot have displacement synthesis without co-factor Trx; (c), (d) gp5 with Trx repeats in synthesis-excision cycle; (e), (f) exo— gp5 attain full-length displacement synthesis without excision; (g) histogram of synthesis processivity from assay of exo+ gp5 + Trx, the distribution is well fit by an exponential;(h) histogram of excision processivity from assay of exo+ gp5+ Trx, the distribution is well fit by an exponential.

3.3 力對野生型gp5鏈置換長度的影響

通常認為聚合酶的外切功能只會切除錯誤的核苷酸, 而exo+gp5只有萬分之一的概率插入錯誤的核苷酸[22], 所以鏈置換過程中的外切不全是錯誤導(dǎo)致的.上面的實驗發(fā)現(xiàn)外切是要exo+gp5鏈置換到一定程度后才會明顯出現(xiàn)的, 鏈置換的過程伴隨的是舊雙鏈退火壓力.為了證明是力改變了exo+gp5的模式, 我們通過圖3(a)所示的納米張力器來研究力對外切的影響.納米張力器的原理是通過一段彎曲的雙鏈DNA來對需要鏈置換的DNA施加張力, 這個張力大概在5—6 pN左右,而此時根據(jù)計算[12]ΔFRET = 0.11為1 nt, 也就對實驗精度有進一步的提高.通過實驗發(fā)現(xiàn)當張力加到DNA上后, 聚合酶鏈置換長度和外切長度仍然是單e指數(shù)衰減的分布(圖3(c)和圖3(d)),經(jīng)過換算后, 聚合酶的速度稍微有提高到9 nt/s(圖3(b)和圖4(d)), 而外切的平均長度變?yōu)?.9 nt,比不加力的情況稍微變小, 這意味著外切程度變低了.另一方面聚合酶的鏈置換平均長度變?yōu)榱?.9 nt, 比不加力變長了, 但是這種變長仍然無法完全鏈置換, 這說明了在6 pN的外力幫助下, gp5仍然無法克服退火壓力的影響.

圖3 T7 DNA聚合酶gp5外切的原因是退火壓力 (a)納米張力器示意圖; (b) 納米張力器實驗的典型曲線; (c) exo+ gp5 +Trx在受力后合成長度的統(tǒng)計圖, 其分布滿足單e指數(shù); (d) exo+ gp5 + Trx受力后外切長度的統(tǒng)計圖, 其分布滿足單e指數(shù)Fig.3.DNA regression pressure induced exonuclease activity: (a) Illustration of nanotensionior; (b) typical trace from assay of nanotensionior; (c) histogram of synthesis processivity from assay of exo+ gp5 + Trx with tension, the distribution is well fit by an exponential; (d) histogram of excision processivity from assay of exo+ gp5 + Trx with tension, the distribution is well fit by an exponential.

3.4 解旋酶幫助聚合酶克服了退火壓力解旋酶對聚合酶鏈置換的影響

我們之前的工作發(fā)現(xiàn)單獨加入gp4解旋速度是很慢的[16], 而單獨加入exo+gp5就無法完全鏈置換.為了研究復(fù)制體鏈置換的情況, exo+gp5,Trx和gp4以及dTTP被體外孵育好后加入到反應(yīng)池中(圖4(a)), 通過圖4(b)所示曲線可發(fā)現(xiàn)鏈置換速度變快了而且也沒有外切的出現(xiàn).由圖4(d)可知, 復(fù)制體的速度(14 nt/s)快于聚合酶單獨的速度(8 nt/s), 而加入gp4后最大的特點就是聚合酶不再回退(圖4(c)).這說明了聚合酶打開雙鏈后, 由于解旋酶阻擋了退火壓力, 聚合酶可以持續(xù)鏈置換而不會外切, 這就使得兩者配合在一起, 解旋酶阻擋聚合酶不再外切, 而聚合酶幫助解旋酶打開雙鏈.這里值得注意的是, 外切對于聚合酶的保真度是有很大幫助的[23,24], 在加入gp4后不再出現(xiàn)外切,這雖然提高了合成效率但是可能降低了保真度.

圖4 T7 DNA解旋酶幫助聚合酶克服退火壓力 (a) gp4, exo+ gp5和Trx共同鏈置換的示意圖, (b) gp4, exo+ gp5和Trx共同鏈置換時的典型曲線; (c) exo+ gp5 + Trx + gp4可以完全鏈置換; (d)不同情況的鏈置換速度Fig.4.gp4 decrease DNA regression pressure which facilitate gp5 to attain processive strand-displacement synthesis: (a) Illustration of displacement by gp4, exo+ gp5 and Trx; (b) typical trace from assay of gp4, exo+ gp5 and Trx; (c) exo+ gp5 + Trx +gp4 attain processive synthesis; (d) synthesis speed in various condition.

3.5 聚合酶鏈置換的機制

如圖5(a)所示單獨的聚合酶面對DNA雙鏈時, 能夠打開雙鏈, 但是其合成長度非常的低, 其原因在于退火壓力的出現(xiàn), 這種壓力使得聚合酶無法在打開雙鏈后順利插入核苷酸只能進行外切的反應(yīng), 而外切一旦開始就會持續(xù)3—4 nt左右導(dǎo)致過度外切的出現(xiàn), 當外切完后聚合酶又進入了鏈置換模式.單獨的聚合酶就會一直陷入這種聚合-外切循環(huán).但是有了解旋酶加入后, 如圖5(b)所示解旋酶幫助聚合酶承受了退火壓力, 使得聚合酶可以鏈置換.另一方面由于聚合酶打開雙鏈的能力很強, 這也就幫助了解旋酶進行解旋.這種互相配合使得復(fù)制體可以快速地進行鏈置換.

圖5 T7 DNA聚合酶不同情況鏈置換時的模型 (a) 野生型gp5單獨鏈置換時進入鏈置換和外切的循環(huán); (b) 野生型gp5在gp4的幫助下, 沒有外切的出現(xiàn)可以持續(xù)鏈置換Fig.5.Model for gp5 strand displacement activity in various condition: (a) exo+ gp5 repeats in synthesis-excision cycle; (b) gp4 facilitate exo+ gp5 to attain processive strand-displacement synthesis.

之前的文獻證明聚合酶和解旋酶不是一直同步進行的, 而是會有脫耦的出現(xiàn)[25].這些情況都需要野生型gp5本身有一定的鏈置換能力, 在本實驗中發(fā)現(xiàn)野生型gp5能夠獨立鏈置換4 nt左右才容易外切, 也就是說野生型gp5和gp4之間可以存在4 nt的脫耦而不影響復(fù)制體的合成.之前我們的工作也發(fā)現(xiàn)了gp4的解旋甚至有換鏈的情況[26],這種情況也說明了需要野生型gp5具有一定的獨立鏈置換能力, 否則DNA的復(fù)制就會完全停止.

4 結(jié) 論

本工作使用smFRET的方法發(fā)現(xiàn)gp5能夠獨自鏈置換, 但是其鏈置換4個核苷酸后就會由于退火壓力的影響, 進而外切核苷酸.有趣的是這種外切是有持續(xù)性的, 過度的外切會降低合成的效率.當對DNA施加力來抵抗退火壓力后, gp5合成的會變長, 外切會變短, 這說明了gp5的外切活性是受力調(diào)控的, 力越大越不容易出現(xiàn)外切.而加入解旋酶后, 幫助聚合酶克服了退火壓力, 使得聚合酶可以一直合成核苷酸.這種獨特的模式使得gp5, gp4的協(xié)同下可以快速的進行鏈置換.