■劉 澤 郭云霞 郭曉軍 楊會英 趙婷婷 張 昭 張月肖 郝慶紅*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學，河北保定 071001；2.保定市畜牧工作站，河北保定 071051；3.武強縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北衡水 053000；4.武強縣百潤有限公司，河北衡水 053000）

隨著藥物性飼料添加劑有序地退出歷史舞臺，抗生素替代產(chǎn)品的開發(fā)應用成為動物營養(yǎng)領(lǐng)域的研究熱點。微生物發(fā)酵飼料富含益生菌和多種活性代謝產(chǎn)物，如功能性寡聚糖、活性小肽、抗菌肽等，可提高動物免疫力和生長性能[1]，實現(xiàn)從減抗到無抗養(yǎng)殖轉(zhuǎn)型具有重要意義。日糧經(jīng)過微生物發(fā)酵后，抗營養(yǎng)因子極顯著下降[2-3]，粗蛋白含量顯著增加，粗脂肪和粗纖維含量顯著下降，飼料營養(yǎng)價值得到提升[4-5]。另外，微生物發(fā)酵還可顯著增加飼料中乳酸和乙酸含量，pH降至4.0以下，從而抑制沙門氏菌的增殖[6]。發(fā)酵飼料在畜禽上應用，可顯著增加斷奶仔豬平均日增重，而料重比極顯著下降[7-8]，而且飼喂母豬發(fā)酵飼料還可提高初生仔豬的生長性能[9]。用50%和100%的發(fā)酵菜籽粕飼喂雛雞，可促進初生雛雞的增重速度和較低的料重比[10]。添加10%的發(fā)酵臍橙粕可使肉雛鴨糞便中氮、磷、鉀等的排放極顯著減少，同時血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性及尿素、高密度脂蛋白膽固醇含量顯著升高[11]。另外還可增加盲腸擬桿菌門豐度，而脫硫弧菌、內(nèi)考拉桿菌屬的數(shù)量顯著下降，增強腸道健康和營養(yǎng)物質(zhì)吸收，進而促進機體生長[12]。綜上表明，微生物發(fā)酵飼料可降解大分子物質(zhì)和抗營養(yǎng)因子，同時提供大量有效活菌，進而促進飼料營養(yǎng)成分的消化吸收，從而降低養(yǎng)殖成本，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。然而，不同微生物、不同的發(fā)酵過程，會產(chǎn)生不同的活性代謝產(chǎn)物，從而影響發(fā)酵飼料的品質(zhì)。本研究利用自主研發(fā)得到的芽孢益生菌對Z型鴨配合料進行發(fā)酵處理，并通過飼喂試驗，明確Z型肉鴨日糧中發(fā)酵飼料適宜的添加比例，旨在為微生物發(fā)酵飼料在畜禽日糧中的應用提供理論依據(jù)。

1 試驗材料及方法

1.1 材料

1日齡的肉公鴨（Z型鴨）由武強縣牧興肉鴨養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM-21、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B-1、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）Y5-39：河北省飼用微生物技術(shù)創(chuàng)新中心及河北農(nóng)業(yè)大學生命科學院制藥工程系自主篩選。

1.2 飼養(yǎng)管理及試驗設計

試驗在河北武強縣牧興肉鴨養(yǎng)殖專業(yè)合作社進行。試驗鴨1～3日齡采用網(wǎng)上平養(yǎng)，4日齡后采用雙層疊層籠養(yǎng)。日常管理按照武強縣牧興Z型鴨養(yǎng)殖專業(yè)合作社常規(guī)飼養(yǎng)管理要求進行，各組保持一致。試驗期間各組肉鴨自由采食顆粒料和飲水，每天觀察鴨群的精神狀況，記錄各組死亡數(shù)，按武強縣牧興肉鴨養(yǎng)殖專業(yè)合作社免疫程序進行免疫接種和鴨舍。

選擇體重相近的1日齡肉公鴨480只，隨機分為4組，每組6個重復，每個重復20只。試驗期43 d，試驗分為3個階段，1～10日齡飼喂Z型鴨初期料，11～28日齡飼喂Z型鴨中期料，29～43日齡飼喂Z型鴨后期料。試驗組發(fā)酵料分別按各期飼料進行發(fā)酵，分別按干物質(zhì)比例7%、14%、21%的添加量添加到日糧中，混勻后飼喂，配制與對照組日糧相等營養(yǎng)濃度的日糧。基礎日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.3 發(fā)酵全價料的制備

具有抗腹瀉功能及毒素降解功能的芽孢益生菌，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B-1、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）Y5-39和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM-21，按3∶5∶2比例進行混合制成復合菌劑（1×108CFU/L），以3%接種量與配合飼料均勻混合，使發(fā)酵飼料中含水量最終為40%，將混合均勻的發(fā)酵料裝入帶有出氣閥的青貯袋（25 kg規(guī)格），用扎帶扎好后，室溫靜置發(fā)酵7 d，發(fā)酵前后各階段飼料營養(yǎng)成分見表2。

表2 發(fā)酵前后各階段飼料營養(yǎng)成分

1.4 樣品采集及檢測

1.4.1 生長性能和發(fā)病率

以重復為單位，準確記錄每日投料量，并于第2 d晨飼前稱剩料量，計算每只肉鴨的平均日采食量。正式試驗開始前和結(jié)束后，空腹稱重，計算平均日增重和料重比。試驗期觀察肉鴨的發(fā)病情況和死亡情況，試驗結(jié)束后統(tǒng)計存活率。

1.4.2 屠宰性能及器官指數(shù)

試驗結(jié)束早晨（空腹12 h），每組中取6只體重接近平均體重的肉鴨，稱活重后頸動脈放血致死，參考《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計方法》（NY/T 823—2004）[13]進行屠宰性能測定，計算屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率，并測定內(nèi)臟器官發(fā)育指數(shù)，計算公式如下：

屠宰率（%）=屠體重/活重×100

半凈膛率（%）=半凈膛重/活重×100

全凈膛率（%）=全凈膛重/活重×100

胸肌率（%）=雙側(cè)胸肌重/全凈膛重×100

腿肌率（%）=雙側(cè)大小腿凈肉重/全凈膛重×100

器官發(fā)育指數(shù)（%）=器官重量（g）/活體重（g）×100

1.4.3 血清生化指標及激素水平

試驗結(jié)束當天，晨飼前每重復隨機取6只肉仔鴨，翅下靜脈采集10 mL血液，4℃靜置過夜，8 000×g離心5 min，分離血清置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3.1 血清常規(guī)生理指標

總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、尿酸（UA）、葡萄糖（Glu）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）等采用全自動生化分析儀（OLYMPUS-AU600）測定。

1.4.3.2 血清激素

血清生長激素（GH）、胰島素（INS）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）含量，采用酶標儀（芬蘭，Labsystems Multiskan MS，352型）測定，試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司。

1.4.4 養(yǎng)分表觀消化率測定

于正式期第29～33 d每天08：00和17：00以每個重復為單位收集新鮮糞樣100～200 g，然后混勻，加入10%H2SO410 mL固氮，-20℃保存，連續(xù)收集3 d，65℃烘箱烘干，粉碎保存，使用鹽酸不溶灰分（AIA）法測定糞樣中粗蛋白、粗脂肪、鈣、磷表觀消化率的方法參考劉燕[14]。公式如下：

某養(yǎng)分表觀消化率（%）=100×[1-(飼糧中AIA含量/糞中AIA含量)×（糞中該養(yǎng)分含量/飼糧中該養(yǎng)分含量）]

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理后用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan’s法進行多重比較，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨生長性能的影響（見表3）

表3 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，10日齡體重試驗Ⅰ組顯著降低6.67%（P＜0.05），試驗Ⅱ組和Ⅲ組分別增加4%（P＞0.05）和8.0%（P＜0.01），其中試驗Ⅰ組極顯著低于試驗Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.01）；28日齡體重試驗Ⅱ組比試驗Ⅰ組增加20.30%（P＜0.05），而與其他組間差異不顯著（P＞0.05）；1～10日齡平均日增重，與對照組相比，其中試驗Ⅰ組顯著降低7.55%（P＜0.05），試驗Ⅲ組極顯著增加9.50%（P＜0.01），試驗Ⅱ組增加了4%，但差異不顯著（P＞0.05）；11～28日齡平均日增重，與對照組相比，試驗Ⅱ組極顯著增加16.84%（P＜0.01），試驗Ⅰ組顯著降低6.34%（P＜0.05）；29～43日齡和全期平均日增重各組間無顯著差異。與對照組相比，試驗Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組采食量分別極顯著下降9.87%、12.59%和13.59%（P＜0.01）。與對照組相比，試驗Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組料重比分別極顯著下降18.15%、20.46%和18.53%（P＜0.01）。

2.2 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨屠宰性能及器官發(fā)育指數(shù)的影響（見表4）

由表4可知，與對照組相比，各試驗組肉鴨屠宰率、半凈膛率、腿肌率、胸肌率、心臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、肌胃指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）。試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組全凈膛率顯著增加4.95%（P＜0.05）和5.44%（P＜0.05）。肝臟指數(shù)試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組分別顯著下降13.15%（P＜0.05）和19.92（P＜0.05）。腎臟指數(shù)試驗Ⅱ組顯著下降21.74%（P＜0.05）。腺胃指數(shù)試驗Ⅰ組和Ⅱ組極顯著低于其他組（P＜0.01）。

表4 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨屠宰性能及器官指數(shù)的影響

2.3 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨血清生化指標的影響（見表5）

由表5可知，與對照組相比，各試驗組血清TC、HDL-C含量差異不顯著；LDL-C含量試驗Ⅰ組顯著下降17.51（P＜0.05），試驗Ⅱ組和Ⅲ組分別下降24.75%（P＜0.01）和13.64%（P＜0.05）；試驗Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組TG含量分別下降30.46%（P＜0.01）、45.70%（P＜0.01）和43.05%（P＜0.01），試驗Ⅱ組和Ⅲ組與試驗Ⅰ組 相 比 分 別 下 降21.90%（P＜0.05）和18.10%（P＜0.05）；AST活性顯著下降，試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組分別下降50.72%（P＜0.01）、66.42%（P＜0.01）和57.15%（P＜0.01），其中試驗Ⅱ組和Ⅲ組極顯著低于試驗Ⅰ組（P＜0.01）；AST/ALT比值與AST趨勢一致。UA含量試驗Ⅱ組和Ⅲ組分別下降24.00%（P＜0.01）和31.42%（P＜0.01），極顯著低于對照組，而試驗Ⅲ組顯著低于試驗Ⅱ組（P＜0.05）。

表5 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨血清生化指標的影響

2.4 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨血清激素的影響（見表6）

由表6可知，與對照組相比，試驗Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組GH含量分別極顯著增加32.68%（P＜0.01）、32.57%（P＜0.01）和19.28%（P＜0.01），其中試驗Ⅰ、Ⅱ組極顯著高于試驗Ⅲ組（P＜0.01）；INS含量試驗Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組分別極顯著增加了25.62%（P＜0.01）、25.20%（P＜0.01）和34.20%（P＜0.01），其中試驗Ⅲ組極顯著高于試驗Ⅰ、Ⅱ組（P＜0.01）；IGF-1含量試驗Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組分別極顯著增加了33.10%（P＜0.01）、24.89%（P＜0.01）和25.76%（P＜0.01），其中試驗Ⅰ組極顯著高于試驗Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.01）。

表6 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨血清激素的影響

2.5 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響（見表7）

由表7可知，粗蛋白的消化率顯著提高，其中試驗Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組比對照組分別增加了11.32%（P＜0.05）、9.17%（P＜0.05）、8.90%（P＜0.05）。淀粉的消化率試驗Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組比對照組分別增加9.01%（P＜0.05）、11.37%（P＜0.05）、10.65%（P＜0.05）。脂肪、鈣和磷的表觀消化率無顯著變化（P＞0.05）。

表7 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響（風干基礎，%）

3 結(jié)果與討論

3.1 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨生長性能的影響

生長性能直接反映動物的營養(yǎng)狀態(tài)和健康狀況。發(fā)酵飼料將飼料中大分子物質(zhì)降解，利于幼齡動物消化吸收，且發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機酸[15]，酸化飼料不僅可抑制有害菌的生長，減弱大腸桿菌導致腸毒癥的能力[16]，同時還可激活與蛋白質(zhì)和碳水化合物代謝相關(guān)的蛋白酶、淀粉酶等消化酶類，從而提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。試驗結(jié)果表明，發(fā)酵飼料營養(yǎng)濃度分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后飼料中酸溶蛋白含量顯著增加，蛋白酶活性增強，蛋白酶抑制因子顯著下降，同時發(fā)酵飼料中乳酸菌活菌數(shù)量極顯著增加，而在乳酸菌或有機酸存在下，pH下降明顯。通過飼喂試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在1～10日齡平均日增重以試驗Ⅲ組最高，11～28日齡組平均日增重試驗Ⅱ組最高，而29～43日齡平均日增重試驗Ⅰ組最高，且1～10日齡體重增加最快，29～43日齡體重增加速度減緩。推測可能由于雛鴨階段生長速度快，腸道分泌消化酶能力不足，且易受飼料中的抗營養(yǎng)因子、抗原蛋白導致過敏反應，使得飼料的消化利用率降低，而大劑量的添加發(fā)酵飼料可利用發(fā)酵飼料中的酸溶蛋白等小分子物質(zhì)，提高其在腸道的消化吸收率，同時蛋白酶活力、乳酸菌數(shù)量增加，可通過調(diào)整腸道菌群的平衡，同時飼料pH較低，可抑制腸道中沙門氏菌的數(shù)量，增加乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量[17]，改善動物腸道微生態(tài)區(qū)系，促進腸道健康，使得料重比顯著下降[18]。小劑量添加發(fā)酵料可在育肥后期得到明顯的效果，推測在育肥后期腸道發(fā)育完善，消化能力增強，使得發(fā)酵飼料小劑量即可達到最佳的增長速度。

3.2 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨屠宰性能及器官指數(shù)的影響

屠宰性能是評價胴體品質(zhì)的一個重要指標，屠宰率和全凈膛率是衡量畜禽產(chǎn)肉性能的重要標準，一般屠宰率在80%以上，全凈膛率在60%以上，可認為肉用性能良好[19]。影響屠宰性能的因素包括日齡、宰前活重、飼料營養(yǎng)、飼喂方式等，另外，內(nèi)臟器官重量也是影響屠宰性能的重要因素，內(nèi)臟器官指數(shù)越大，屠宰性能就越低[20]。試驗結(jié)果顯示，各組屠宰率均大于90%，但各組間差異不顯著。全凈膛率各組均在76%以上，且隨著發(fā)酵料添加量的增加呈顯著上升，其中試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組與對照組相比顯著增加了4.95%和5.44%。與Yan等[12]報道的添加7.5%的發(fā)酵飼料可增加鵝的體重和日增重結(jié)果一致?？赡苁怯捎陲曃拱l(fā)酵料促進了淀粉酶、蛋白酶等消化酶的活性[21]，進而提高機體的消化吸收及營養(yǎng)物質(zhì)沉積。

肝臟作為機體內(nèi)重要的免疫器官，同時也是家禽體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝的主要器官。在強度育肥的過程中，隨著肉鴨的生長，肝臟代謝負擔過大，導致腫大。血清生化指標中ALT和AST以及AST/ALT作為肝臟健康狀態(tài)的重要指標，只有當肝細胞受到嚴重損傷引起線粒體膜明顯損傷后，血清中AST才會顯著升高[22]。試驗結(jié)果顯示，AST活性和AST/ALT試驗各組與對照組相比呈極顯著下降，表明飼喂發(fā)酵料可促進肝臟功能健康，這與肝臟器官指數(shù)顯著下降趨勢相一致。另外，肝臟也是外源性有毒有害物質(zhì)的重要靶組織，也是毒性評價的重要指標。LEE等[23]研究得出，當?shù)半u飼料中含有高劑量黃曲霉毒素（2.0 mg/kg）時能夠增加產(chǎn)蛋雞肝臟指數(shù)，應對機體對毒素的降解。試驗結(jié)果顯示，肝臟指數(shù)降低也可能與發(fā)酵配合飼料可顯著降低真菌毒素的含量有關(guān)，這有待后續(xù)的研究證實。

3.3 復合益生菌發(fā)酵全價料對Z型鴨血清生化和激素指標的影響

血清生化指標可反映動物的生理代謝和健康情況。TG是機體酶儲存能量的主要形式。HDL-C是機體內(nèi)具有抗動脈粥樣硬化的脂蛋白，可將組織內(nèi)多余的膽固醇經(jīng)膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白的作用，轉(zhuǎn)運至肝臟或?qū)⒛懝檀嫁D(zhuǎn)移給LDL形成LDL-C進入肝臟，然后經(jīng)肝臟脂蛋白受體吸收轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼崤懦鲶w外，從而調(diào)節(jié)膽固醇[24]。試驗結(jié)果顯示，通過飼喂發(fā)酵料，HDL-C含量與對照組相比增加，但差異不顯著，LDL-C和TG含量均顯著下降趨勢，這與在肉雞飼喂發(fā)酵飼料[25]或發(fā)酵菜籽餅[10]的結(jié)果一致。飼料經(jīng)發(fā)酵后可能具有一些成分可抑制肝臟中TG合成的活性。周露等[26]報道發(fā)酵飼料可顯著降低育肥期文昌雞血清TG的含量，可能是由于微生物發(fā)酵產(chǎn)生纖維素等物質(zhì)，抑制文昌雞日糧中TG的消化吸收，從而引起血液中TG含量降低。

UA是家禽蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，是反應蛋白質(zhì)代謝的重要指標[24]，UA主要通過腎臟排泄，當腎臟損傷時，血清中UA含量就會增加。試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著發(fā)酵料飼喂量的增加，UA含量均顯著下降，其中試驗Ⅱ組和Ⅲ組下降幅度較大。表明飼喂發(fā)酵料可促進蛋白質(zhì)分解代謝，對腎臟功能具有積極的促進作用。

GH、INS、IGF-1在動物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。GH是由動物腺垂體分泌的一種肽類激素，協(xié)調(diào)一系列生理過程，包括對骨骼、肌肉和脂肪的影響，最終誘導生長，尤其對幼齡動物作用最為顯著[22]。吳先華等[27]研究證實，飼喂15%的發(fā)酵豆粕可顯著提高斷奶仔豬血清中GH的含量。在代謝方面，GH可使儲存的TG分解為游離脂肪酸，這與飼喂發(fā)酵飼料后，血清中TG含量顯著下降一致。IGF-1是內(nèi)分泌生長因子，最初由肝臟產(chǎn)生，是生長激素GH的重要介質(zhì)。研究表明，GH直接激活生長激素受體（GHR），刺激IGF-1的合成，IGF-1作用于靶細胞發(fā)揮生長激素的生理功能[28]。飼喂發(fā)酵玉米-豆粕型日糧可顯著增強CCAT/增強連接蛋白β（C/EBP）與IGF-1啟動子結(jié)合，促進C/EBP和IGF-1蛋白在肝臟中的表達，進而促進豬的生長[29]。INS是由胰島β細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)刺激時分泌的一種蛋白質(zhì)激素，具有調(diào)節(jié)血糖的作用。利用地衣芽孢桿菌和酵母菌替代莫能菌素可顯著提高育肥羊的生長性能，血清中GH、IGF-1和INS的含量均顯著增加[30]。試驗結(jié)果顯示，飼喂發(fā)酵料可顯著增加胰島素的分泌，而血清葡萄糖濃度變化不大，推測可能是由于發(fā)酵用復合益生菌劑能產(chǎn)生促進胰島素分泌的成分。

3.4 復合益生菌發(fā)酵料對Z型鴨營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收是提高飼料報酬的關(guān)鍵。微生物發(fā)酵飼料，能夠促進幼齡動物腸道的發(fā)育及各種營養(yǎng)物質(zhì)（氮、氨基酸、纖維素、鈣等）的消化吸收[31]和飼料適口性[32]。曲浩杰等[33]研究報道，采用全收糞-套算法對濕料基礎的發(fā)酵料和風干基礎的發(fā)酵料進行對比發(fā)現(xiàn)，風干發(fā)酵料的粗蛋白、干物質(zhì)、能量真實利用率和代謝能水平顯著增加。試驗結(jié)果表明，飼喂復合益生菌發(fā)酵飼料可顯著促進蛋白質(zhì)和淀粉的表觀消化率，其中以14%添加組效果最好。

4 結(jié)論

復合益生菌發(fā)酵飼料替代14%的基礎日糧，可顯著增加血清GH、INS和IGF-1含量，促進蛋白質(zhì)代謝，顯著降低了BUN和UA含量及AST活性和AST/ALT比值，提高飼料中蛋白質(zhì)和淀粉的表觀消化率，全期料重比顯著下降，提高育肥效果。