張倩，陳斌，閆福華

1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，南京市口腔醫(yī)院兒童口腔科，江蘇 南京（210008）；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，南京市口腔醫(yī)院牙周病科，江蘇 南京（210008）

牙周炎是人類最常見(jiàn)的口腔疾病之一，慢性牙周炎發(fā)病率高、早期癥狀不明顯，不易引起重視，而當(dāng)出現(xiàn)牙齒松動(dòng)、疼痛等癥狀時(shí)，已發(fā)展為重度牙周炎，可致牙齒松動(dòng)、脫落，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量［1-3］。因此，對(duì)牙周組織破壞進(jìn)行早期診斷、判斷牙周基礎(chǔ)治療的療效和牙周炎的預(yù)后具有重要意義。牙菌斑是牙周炎的始動(dòng)因子，但是宿主的免疫反應(yīng)決定了牙周組織破壞的進(jìn)程。齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）作為一種牙周的局部滲出液，一定程度上可以反映宿主的免疫反應(yīng)。由于GCF收集方法簡(jiǎn)單且無(wú)創(chuàng)，采用GCF作為牙周炎早期診斷或預(yù)測(cè)牙周組織破壞的指標(biāo)，具有非常良好的應(yīng)用前景。雖然已有關(guān)于不同牙周狀態(tài)下GCF中細(xì)胞因子水平的相關(guān)研究［4-6］，但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)在牙周基礎(chǔ)治療后隨訪期間出現(xiàn)牙周炎進(jìn)展的位點(diǎn)GCF中進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)的研究。GCF成分眾多，本研究選取了與牙周組織破壞有關(guān)的2種常見(jiàn)促炎因子——腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6），抗炎因子白細(xì)胞介素10（interleukin 10，IL-10），在骨代謝中發(fā)揮重要作用的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP），觀察重度慢性牙周炎患者治療前后GCF中以上4種生物標(biāo)志物水平，探討GCF中生物標(biāo)志物水平對(duì)于判斷牙周基礎(chǔ)治療的療效和隨訪期間局部出現(xiàn)牙周炎進(jìn)展的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

本項(xiàng)研究經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2013NL-007），并在中國(guó)臨床試驗(yàn)中心注冊(cè)（注冊(cè)號(hào)：ChiCTR-OCH-13004679），所有受試者在進(jìn)入研究前均對(duì)本研究知情同意并簽署了知情同意書(shū)。

選擇就診于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周病科的患者，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，有30例患者（男性11例，女性19例，年齡40～56歲）參與并完成了這項(xiàng)2015年12月～2016年12月為期1年的縱向試驗(yàn)研究。

依據(jù)1999年牙周病分類標(biāo)準(zhǔn)［7］，納入標(biāo)準(zhǔn)：①40歲及以上年齡、至少有14顆可評(píng)估的牙（其中有4顆磨牙）；②全身健康無(wú)系統(tǒng)性疾病，無(wú)吸煙史，婦女未妊娠；③至少3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)抗生素；④1年內(nèi)無(wú)牙周治療史；⑤全口1/3以上的患牙滿足以下條件：牙周支持組織的破壞超過(guò)根長(zhǎng)1/3；Ⅱ度或Ⅲ度根分叉病變；探診深度（probing depth，PD）>6 mm；臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL）≥5 mm。

同時(shí)招募了15例牙周健康志愿者作為重度慢性牙周炎患者基線時(shí)的對(duì)照（男性6例，女性9例，年齡22～35歲，無(wú)全身系統(tǒng)性疾病，無(wú)吸煙史，PD＜3 mm，沒(méi)有附著喪失和牙槽骨吸收，全口探診出血陽(yáng)性位點(diǎn)≤20%）。

1.2 基線牙周臨床檢查、齦溝液的收集

對(duì)參與者進(jìn)行初步的牙周檢查，僅包括菌斑指數(shù)（plaque index，PLI）、牙齒松動(dòng)度和影像學(xué)檢查（全景片或錐形束CT）［8］。根據(jù)齦緣位置和影像學(xué)檢查顯示的牙槽骨位置預(yù)估慢性牙周炎患者的PD，對(duì)預(yù)估PD≥6 mm（深袋）和PD≤4 mm（淺袋）的位點(diǎn)采集GCF，以避免探診后采樣導(dǎo)致牙周袋內(nèi)GCF被干擾，從而獲得相對(duì)真實(shí)的結(jié)果。

取樣之前，用棉卷隔濕，然后使用無(wú)菌刮匙刮除齦上菌斑，氣槍輕輕吹干后，將尺寸為2 mm×8 mm的無(wú)菌濾紙（Whatman，美國(guó)）放入牙周袋中，直到感到阻力為止，30 s后取出［7］。然后將濾紙條放入預(yù)先稱重的無(wú)菌Eppendorf管中。如果濾紙被血液或唾液污染，則將其丟棄并選擇另一個(gè)位點(diǎn)。2 min后，再次使用相同的方法從相同的位置收集GCF，并將試紙條放入相同的試管中。所有GCF樣品均由同一人收集。使用精密電子天平（Mettler-Toledo，XS205，梅特勒-托利多，中國(guó)）稱取采樣前后濾紙的重量，兩次的重量差就是GCF的重量，以齦溝液的比重為1 mg/μL計(jì)算GCF的體積。將樣品密封并保存在-80℃待檢。

待采樣結(jié)束再使用牙周探針（Hu-Friedy，美國(guó)）測(cè)量并記錄齦溝出血指數(shù)（sulcus bleeding index，SBI）、PD、CAL［8］，當(dāng)實(shí)際也滿足6 mm≤PD≤9 mm或PD≤4 mm時(shí)將該樣本納入研究，反之則剔除。最終每例患者收集2個(gè)深袋位點(diǎn)和2個(gè)淺袋位點(diǎn)納入研究。所有臨床檢查均由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的牙周病專科醫(yī)生進(jìn)行。以相同的方式收集并保存了15名牙周健康志愿者中30個(gè)健康牙位的GCF。

1.3 牙周基礎(chǔ)治療及牙周臨床指標(biāo)測(cè)量

在基線GCF采樣和牙周臨床指標(biāo)記錄后，每例患者均接受了由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的牙周病?？漆t(yī)生進(jìn)行操作的牙周基礎(chǔ)治療，包括口腔衛(wèi)生宣教、齦上潔治、全口齦下刮治和根面平整。在基礎(chǔ)治療后1、3、6和12個(gè)月隨訪時(shí)，對(duì)每例患者進(jìn)行重新評(píng)估，記錄數(shù)據(jù)，按照上述方法取同樣牙位的GCF，-80℃冰箱保存待檢。隨訪治療主要包括有針對(duì)性的強(qiáng)化口腔衛(wèi)生指導(dǎo)、齦上潔治，2次隨訪期間CAL增加≥2 mm的位點(diǎn)被認(rèn)為是牙周炎活動(dòng)期位點(diǎn)，即這些位點(diǎn)出現(xiàn)了牙周炎進(jìn)展，對(duì)這些位點(diǎn)需要再次進(jìn)行齦下刮治。

1.4 GCF中IL-6、IL-10、TNF-α、ALP水平的檢測(cè)

將收集到的樣品在同一日檢測(cè)。檢測(cè)當(dāng)天，將Eppendorf管中的GCF樣品在室溫下融化，并在搖床上以150 rpm的轉(zhuǎn)速用500μL去離子水洗脫1 h，10 000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min后，去除上清液。

用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）（IL-6、IL-10、TNF-α試劑盒購(gòu)于美國(guó)R＆D公司；ALP試劑盒購(gòu)于美國(guó)Cloud-Clone公司）檢測(cè)齦溝液中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP含量，嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。試劑盒中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP的平均最低可檢測(cè)劑量分別為0.039 pg/mL、0.063 pg/mL、0.049 pg/mL和1.27 ng/mL。如果某位點(diǎn)的生物標(biāo)志物水平測(cè)出來(lái)低于最低值，則認(rèn)為該位點(diǎn)水平不可測(cè)，剔除該位點(diǎn)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生物標(biāo)志物的濃度，然后乘以體積就是該生物標(biāo)志物的水平，計(jì)算為pg/牙位。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0中文版分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 5做圖。使用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)比較基線時(shí)和治療后1、3、6和12個(gè)月時(shí)GCF中牙周臨床指標(biāo)和生物標(biāo)志物水平的組內(nèi)比較，Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較兩組之間牙周臨床指標(biāo)以及GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP水平的差異。GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP水平與牙周臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線期重度慢性牙周炎患者不同位點(diǎn)、健康對(duì)照者GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP水平

基線期重度慢性牙周炎患者未經(jīng)治療的牙周炎位點(diǎn)GCF中IL-6、TNF-α、ALP水平顯著高于對(duì)照組牙周健康者的位點(diǎn)（P＜0.001），IL-10水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.001）。此外，重度慢性牙周炎患者深袋位點(diǎn)的GCF中TNF-α、ALP、IL-6水平顯著高于淺袋位點(diǎn)（P<0.001），IL-10水平顯著低于淺袋位點(diǎn)（P<0.001）（表1）。

2.2 基礎(chǔ)治療后1、3、6、12個(gè)月重度慢性牙周炎患者不同位點(diǎn)GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP水平和臨床指標(biāo)

2.2.1 生物標(biāo)志物水平 牙周基礎(chǔ)治療后1、3、6、12個(gè)月，與基線期相比，重度慢性牙周炎患者淺袋、深袋位點(diǎn)GCF中的TNF-α、ALP水平顯著降低，IL-10水平顯著升高（P＜0.005），但是IL-6水平只在深袋位點(diǎn)GCF中顯著降低（P＜0.005），淺袋位點(diǎn)的IL-6水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖1）。

表1 基線期重度慢性牙周炎患者牙周炎位點(diǎn)和對(duì)照組健康位點(diǎn)GCF中生物標(biāo)志物的水平Table 1 Levels of biomarkers in GCFat periodontitis sites in patients with severe chronic periodontitis at baseline and healthy sites in the control group Median(IQR)

Figure 1 Levels of IL-6,TNF-α,IL-10,and ALP in the GCF of deep-pocket and shallow-pocket sites at the baseline and 1,3,6 and 12 months after nonsurgical periodontal therapy圖1 基線及牙周基礎(chǔ)治療1、3、6、12個(gè)月深袋、淺袋位點(diǎn)GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP的水平

2.2.2 臨床牙周指標(biāo) 牙周基礎(chǔ)治療后1、3、6、12個(gè)月，重度慢性牙周炎患者深袋和淺袋位點(diǎn)的PD和CAL與基線相比，明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）。深袋位點(diǎn)的PLI和SBI與基線相比，基礎(chǔ)治療后明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）；淺袋位點(diǎn)的PLI和SBI，治療后有一定下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

Figure 2 Clinical indicators of deep pocket and shallow pocket sites at the baseline and 1,3,6 and 12 months after nonsurgical periodontal therapy圖2 基線及牙周基礎(chǔ)治療1、3、6、12個(gè)月深袋、淺袋位點(diǎn)的臨床指標(biāo)

2.3 GCF中生物標(biāo)志物水平與牙周臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性

GCF中IL-6、TNF-α水平和ALP與牙周臨床指標(biāo)（PD、CAL、PI、SBI）間存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的正相關(guān)（P<0.05），而IL-10水平與牙周臨床指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），具體相關(guān)系數(shù)及P值見(jiàn)表2。其中GCF中4種生物標(biāo)志物水平與PD、CAL的相關(guān)性更大。

表2 牙周臨床指標(biāo)與GCF中生物標(biāo)志物水平的相關(guān)性Table 2 Correlation between periodontal parameters and the levels of biomarkers in GCF

2.4 GCF中生物標(biāo)志物水平與該位點(diǎn)牙周炎進(jìn)展間的關(guān)系

在牙周基礎(chǔ)治療后1、3、6、12個(gè)月的隨訪期間，≥90%的牙周炎位點(diǎn)沒(méi)有新的附著喪失，這些位點(diǎn)GCF中IL-6、TNF-α、IL-10和ALP水平相較上一次，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖1）。但是，有不超過(guò)10%位點(diǎn)出現(xiàn)了牙周炎進(jìn)展，這些位點(diǎn)GCF中的IL-6、TNF-α、IL-10和ALP水平與上一次檢查相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）（表3）。

3 討論

目前臨床上常用牙周臨床指標(biāo)如附著喪失、探診深度、骨喪失、牙齒松動(dòng)、牙齒移位、牙菌斑指數(shù)、牙齦退縮和影像學(xué)表現(xiàn)來(lái)反映牙周炎癥和牙周治療的效果。但是，這些指標(biāo)存在一定的滯后性，并且?guī)в幸欢ǖ闹饔^性。因此，尋找一種更準(zhǔn)確、更靈敏并且能夠客觀地評(píng)估牙周狀態(tài)、預(yù)測(cè)牙周組織破壞的方法是很有必要的。

GCF是一種血清滲出液，它包含血清的許多成分和局部產(chǎn)生的生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，GCF中數(shù)十種生物標(biāo)志物可用于評(píng)估牙周炎的發(fā)生和發(fā)展［9-10］，研究GCF用于牙周炎的診斷、治療評(píng)估以及疾病發(fā)展的監(jiān)測(cè)是當(dāng)前牙周病學(xué)的重要課題之一［11-12］。在炎癥狀態(tài)下，許多細(xì)胞因子、酶和蛋白質(zhì)，被釋放到GCF中［6，13］。在這些生物標(biāo)志物中，IL-6是與牙周組織破壞有關(guān)的促炎因子，被認(rèn)為與牙周疾病的進(jìn)展有關(guān)［14-16］。研究者認(rèn)為，IL-6在激活炎癥介質(zhì)釋放的同時(shí)還可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集［17］。同樣，TNF-α可以激活破骨細(xì)胞并促進(jìn)骨吸收，與牙周病的發(fā)展密切相關(guān)［18］?？寡滓蜃覫L-10則可以抑制一系列促炎因子的產(chǎn)生，例如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶等［19］，同時(shí)IL-10也參與調(diào)節(jié)了骨吸收過(guò)程［20］。ALP是骨代謝、炎癥反應(yīng)和牙周再生中一種重要的酶，白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等許多細(xì)胞均可產(chǎn)生堿性磷酸酶［21］。

表3 牙周基礎(chǔ)治療后1、3、6、12個(gè)月，出現(xiàn)牙周炎進(jìn)展的位點(diǎn)GCF中生物標(biāo)志物水平Table 3 Levels of biomarkersin GCFat the sitesof periodontitis progression 1,3,6,and 12 months after nonsurgical periodontal therapyx±s

目前已經(jīng)有研究通過(guò)檢測(cè)牙周炎患者GCF中的成分來(lái)評(píng)估牙周組織的炎癥狀況或牙周治療的效果［22-24］。還有研究通過(guò)測(cè)量GCF中炎性介質(zhì)水平來(lái)評(píng)估個(gè)人患牙周疾病的風(fēng)險(xiǎn)［9，25］。然而，本研究采樣方法較其他研究有一定先進(jìn)性，即采樣前不探診，根據(jù)齦緣位置和影像學(xué)檢查顯示的牙槽骨位置預(yù)估PD，以避免探診后采樣導(dǎo)致牙周袋內(nèi)GCF被干擾，從而獲得相對(duì)真實(shí)的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，重度慢性牙周炎患者的炎癥位點(diǎn)IL-6、TNF-α和ALP水平顯著高于志愿者的牙周健康位點(diǎn)，對(duì)照組牙周健康位點(diǎn)的IL-10水平高于牙周炎患者炎癥位點(diǎn)的IL-10水平，說(shuō)明不同牙周狀態(tài)下GCF中以上4種生物標(biāo)志物水平不同，這與以前研究結(jié)果的趨勢(shì)基本一致［16，18，26-27］，說(shuō)明本研究選取的這4種生物標(biāo)志物有一定的代表性。

此外，本研究結(jié)果顯示，同一患者不同位點(diǎn)GCF中4種生物標(biāo)志物水平亦不同，在患者深袋位點(diǎn)GCF中IL-6、TNF-α和ALP水平的水平顯著高于淺袋位點(diǎn)的水平，深袋位點(diǎn)GCF中IL-10水平顯著低于淺袋位點(diǎn)水平，進(jìn)一步證明了IL-6、IL-10、TNFα和ALP能反映該位點(diǎn)的牙周狀態(tài)。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)臨床指標(biāo)（PD、CAL、PLI和SBI）與IL-6、IL-10、TNF-α、ALP水平之間存在顯著相關(guān)性，這些結(jié)果說(shuō)明GCF中生物標(biāo)志物的水平與牙周組織破壞的程度相關(guān)。其中，GCF中4種生物標(biāo)志物水平與PD、CAL的相關(guān)性更大。

有研究表明，在菌斑控制良好的基礎(chǔ)上，在一些深牙周袋也可以通過(guò)牙周基礎(chǔ)治療達(dá)到良好的治療效果，無(wú)需進(jìn)一步的手術(shù)治療［28-30］。迄今為止，許多研究報(bào)道了基礎(chǔ)治療后GCF中生物標(biāo)志物的變化［31-33］。本研究中，基礎(chǔ)治療后，重度慢性牙周炎患者淺袋、深袋位點(diǎn)GCF中的TNF-α和ALP水平顯著降低，IL-10水平顯著升高，但是只有深袋位點(diǎn)GCF中的IL-6水平顯著降低，淺袋位點(diǎn)的IL-6水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明IL-6的敏感程度可能不如其他3種生物標(biāo)志物。此外，這4種生物標(biāo)志物水平在深袋位點(diǎn)的變化比淺袋位點(diǎn)更顯著。通過(guò)檢測(cè)GCF中的TNF-α、IL-10、ALP，可評(píng)估牙周基礎(chǔ)治療效果。本研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果的變化趨勢(shì)基本一致［34，19，32-35］，但具體數(shù)值并不相同，原因可能包括種族原因、個(gè)體差異、不同的樣本量和不同的測(cè)量方法，后續(xù)可能需要更多的樣本量，以提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)治療后1、3、6、12個(gè)月的隨訪期間，90%以上位點(diǎn)GCF中的IL-6、TNFα、IL-10、ALP水平與上一次相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩次隨訪之間有部分位點(diǎn)的CAL增加≥2 mm，即這些位點(diǎn)出現(xiàn)了牙周炎進(jìn)展，可能是由于清創(chuàng)不徹底和/或口腔衛(wèi)生不佳導(dǎo)致的，在這些位點(diǎn)的GCF中，TNF-α、ALP、IL-6水平顯著升高，IL-10水平顯著降低。這說(shuō)明，GCF這4種生物標(biāo)志物可能是評(píng)估局部位點(diǎn)牙周炎進(jìn)展的有價(jià)值的指標(biāo)。

綜上，本研究檢測(cè)重度慢性牙周炎患者不同位點(diǎn)中GCF中細(xì)胞因子和酶水平，以評(píng)估其水平與牙周狀態(tài)的關(guān)系，以及判斷牙周基礎(chǔ)治療的療效和牙周炎的預(yù)后，這是國(guó)內(nèi)首次對(duì)牙周基礎(chǔ)治療后隨訪期間發(fā)生了牙周炎進(jìn)展的位點(diǎn)進(jìn)行GCF中TNF-α、IL-10、IL-6炎癥因子和ALP的檢測(cè)，結(jié)果表明，GCF中這4種生物標(biāo)志物表達(dá)水平作為炎癥相關(guān)指標(biāo)可輔助判斷重度慢性牙周炎患者局部位點(diǎn)的牙周炎進(jìn)展情況及牙周基礎(chǔ)治療的療效，將來(lái)可能作為預(yù)測(cè)牙周組織破壞程度的敏感指標(biāo)應(yīng)用于臨床。

【Author contributions】 Zhang Q collected the GCF samples，performed the research，analyzed the data and wrote the article.Chen B performed the periodontal treatment and revised the article.Yan FH designed the study and revised the article.All authors read and approved the final manuscript submitted.