馬敏彪，施金虎，王 帥，鄭火青

(1.浙江省畜牧技術(shù)推廣與種畜禽監(jiān)測(cè)總站，浙江 杭州 310021； 2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院)

1 養(yǎng)蜂概況

養(yǎng)蜂業(yè)是浙江省的一個(gè)特色產(chǎn)業(yè)，在促進(jìn)農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)發(fā)展和鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮重要作用，漿蜂養(yǎng)殖量和蜂產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值一直穩(wěn)居全國(guó)第一[1]。浙江省現(xiàn)有飼養(yǎng)蜂群140萬(wàn)群，其中漿蜂(西方蜜蜂)100萬(wàn)群，中華蜜蜂40萬(wàn)群[1]。

相比于本土的中華蜜蜂，漿蜂生產(chǎn)力更強(qiáng)，產(chǎn)品種類更加豐富，產(chǎn)業(yè)鏈更加完整[2]。雖然意蜂生產(chǎn)力較優(yōu)，但其在飼養(yǎng)過(guò)程中也面臨更嚴(yán)峻的病蟲(chóng)害威脅[3]。因此，蜂種的抗病力直接決定了蜂群的健康程度，進(jìn)而影響其生產(chǎn)力和蜂場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。目前，意蜂上常見(jiàn)的病蟲(chóng)害包括蜂螨、微孢子蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)以及病毒等病原體[4-5]，它們間的協(xié)同作用也被認(rèn)為是近年來(lái)世界范圍內(nèi)蜂群大量損失的誘發(fā)因子[6-7]，引起了行業(yè)的廣泛關(guān)注。

蜂螨，主要為狄斯瓦螨(俗稱大蜂螨)，是蜜蜂的一種體外寄生螨，主要以吸食蜜蜂體液為生，不僅直接對(duì)蜜蜂生理造成損害，縮減蜜蜂壽命，而其作為多種病原的載體，與其他病原(如病毒和微孢子蟲(chóng))間的協(xié)同作用更是影響了整個(gè)蜂群的健康[3,6-7]。微孢子蟲(chóng)作為蜜蜂腸道的專性寄生蟲(chóng)，對(duì)蜜蜂消化系統(tǒng)影響顯著，其也會(huì)與蜂螨和病毒產(chǎn)生協(xié)同作用從而降低蜂群的健康態(tài)勢(shì)[6]。目前，已經(jīng)報(bào)道和確認(rèn)的蜜蜂病毒超過(guò)30種[8]，而其中國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的蜜蜂病毒主要有黑蜂王臺(tái)病毒(Black queen cell virus, BQCV)、慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus, CBPV)、殘翅病毒(Deformed wing virus, DWV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)和囊狀幼蟲(chóng)病毒(Sacbrood virus, SBV)等5種[9]，且多數(shù)以隱性感染的狀態(tài)存在，直到有其他誘發(fā)因子(如寄生蟲(chóng)感染)造成顯性癥狀[10]。本文通過(guò)對(duì)浙江省內(nèi)主要6家漿蜂種蜂場(chǎng)蜜蜂對(duì)蜂螨(本文主要指狄斯瓦螨)、微孢子蟲(chóng)和5種常見(jiàn)病毒等抗病力指標(biāo)的測(cè)定，以期為漿蜂種質(zhì)資源的管理和利用提供參考，并為后續(xù)的蜜蜂相關(guān)育種以及蜜蜂病蟲(chóng)害防控等工作提供一定的借鑒。

2 材料與方法

2.1測(cè)試蜂群 從蕭山、淳安、長(zhǎng)興、紹興、蘭溪、江山等6縣市6家種蜂場(chǎng)，每家蜂場(chǎng)選取群勢(shì)相近的5個(gè)蜂群作為測(cè)試蜂群，于2019年9月18日運(yùn)到位于杭州市臨安區(qū)的浙江省種畜禽質(zhì)量檢測(cè)中心。測(cè)試蜂群到達(dá)后統(tǒng)一換用提前準(zhǔn)備的新箱，隨機(jī)交替放置在測(cè)試場(chǎng)地，并編號(hào)，由專人統(tǒng)一負(fù)責(zé)飼養(yǎng)管理。

2.2測(cè)定指標(biāo) 分別于2019年12月13日和2020年3月11日對(duì)每個(gè)蜂群取樣進(jìn)行抗病力測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)包括蜂螨寄生率、微孢子蟲(chóng)孢子數(shù)和主要病毒感染率和感染滴度。

2.2.1蜂螨寄生率 從每個(gè)蜂群的隔板和外側(cè)巢脾上分別取50只成年蜜蜂工蜂，冷凍麻痹后檢查每只蜜蜂體上的蜂螨個(gè)數(shù)，計(jì)算所檢查到的蜂螨總數(shù)與檢查蜜蜂總數(shù)的百分比分別獲得兩個(gè)取樣點(diǎn)的蜂螨寄生率，兩個(gè)取樣點(diǎn)的值取平均后得到該群蜜蜂的蜂螨寄生率。同時(shí)為了保證蜂群安全越冬，在越冬期間對(duì)每個(gè)蜂群均進(jìn)行治螨處理。同時(shí)檢測(cè)蜂群在越冬期的治螨效果，在越冬期間對(duì)每個(gè)蜂群均進(jìn)行治螨處理。

2.2.2微孢子蟲(chóng)孢子數(shù) 從每個(gè)蜂群的隔板和外側(cè)巢脾上分別取15只成年蜜蜂工蜂，剪下30只蜜蜂的腹部，加入30 mL純凈水，充分研磨；充分混勻后吸取10 μL研磨液滴于血球計(jì)數(shù)板中間，在10×40倍顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)下進(jìn)行微孢子蟲(chóng)孢子計(jì)數(shù)，每個(gè)蜂群重復(fù)3次，最后取平均值計(jì)算出各蜂群內(nèi)平均每只蜜蜂體內(nèi)的微孢子蟲(chóng)孢子數(shù)。

2.2.3病毒感染率和感染滴度 從每個(gè)蜂群的隔板和外側(cè)巢脾上各取15只成年蜜蜂工蜂，每群共30只蜜蜂，用液氮冷凍后充分研磨，取100 mg的粉末通過(guò)RNA提取試劑盒(Aidlab, Beijing, China)進(jìn)行總RNA提取，經(jīng)ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO, Osaka, Japan)得到cDNA，最后利用SYBR? Green Realtime PCR Master Mix熒光定量PCR試劑(TOYOBO, Osaka, Japan)檢測(cè)蜜蜂常見(jiàn)的5種病毒(BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV)的感染率和感染滴度。病毒的絕對(duì)定量采用浙江大學(xué)蜂學(xué)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)早先相應(yīng)病毒構(gòu)建質(zhì)粒所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，公式分別如下：YBQCV=-3.1935X+38.743,R2=0.9971；YCBPV=-3.3271X+45.973,R2=0.9907；YDWV=-3.3213X+40.914,R2=0.9997；YIAPV=-3.2646X+38.918,R2=0.9955；YSBV=-3.3639X+48.458,R2=0.9938(其中Y為檢測(cè)得到的CT值，X為病毒的log拷貝數(shù)，10Xcopies為病毒感染滴度)。

2.3統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)本研究中蜂群成蜂數(shù)量、子脾數(shù)量、微孢子蟲(chóng)孢子數(shù)和病毒感染滴度通過(guò)單因素方差分析(one-way ANOVA)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并選用單因素方差分析中的Tukey法進(jìn)行多重比較。對(duì)蜂螨侵染率和病毒感染率采用卡方檢驗(yàn)(Chi-square test)進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 20.0軟件(IBM, Armonk, USA)進(jìn)行，且當(dāng)P值小于0.05時(shí)即認(rèn)為差異顯著。

3 檢測(cè)結(jié)果

3.1蜂群進(jìn)場(chǎng)時(shí)基本情況 測(cè)試蜂群進(jìn)場(chǎng)當(dāng)天的基本情況見(jiàn)表1。30個(gè)蜂群除蕭山種蜂場(chǎng)的4個(gè)蜂群有11張巢脾外，其余所有蜂群均為10張巢脾。每群的蜂量和子脾數(shù)在不同蜂場(chǎng)間差異較大，蕭山、蘭溪、紹興、長(zhǎng)興蜂場(chǎng)，蜂群巢脾基本相稱，其中蕭山蜂場(chǎng)因巢脾數(shù)更多，蜂量和子脾數(shù)都明顯多于其它蜂場(chǎng)；淳安蜂場(chǎng)蜂群略少于脾；而江山蜂場(chǎng)蜂量明顯不足，子脾數(shù)也明顯少于其它蜂場(chǎng)的蜂群。

總體而言，各蜂場(chǎng)內(nèi)部蜂群之間在成蜂數(shù)量和子脾數(shù)上無(wú)顯著差異(P>0.05)，而在進(jìn)場(chǎng)時(shí)，蜂場(chǎng)間無(wú)論是成蜂數(shù)量(P<0.001)還是子脾數(shù)量(P<0.001)上差異均顯著，等到越冬期和春繁期時(shí)，各蜂場(chǎng)間蜂群群勢(shì)已無(wú)明顯區(qū)別(圖1)。

表1 測(cè)試蜂群進(jìn)場(chǎng)時(shí)的基本情況

圖1 不同時(shí)間段各地區(qū)種蜂場(chǎng)的成蜂量(A)和子脾數(shù)(B)情況

3.2蜂螨寄生率 越冬期(2019年12月)各蜂場(chǎng)蜂群蜜蜂通過(guò)取成年蜂檢查蜂螨數(shù)量，計(jì)算得到蜂螨寄生率在3.68%-8.67%之間，其中，長(zhǎng)興蜂場(chǎng)的平均蜂螨寄生率要高于其它蜂場(chǎng)，但差異不顯著(P>0.05，圖2)。因在越冬期間蜂群治螨比較徹底，而在3月份取樣前，蜂螨數(shù)量還未有明顯增加，在2020年3月取樣的所有蜂群的成年蜂體表均未檢查到蜂螨，即所有蜂群的蜂螨寄生率均為零。

圖2 各蜂場(chǎng)蜂群蜜蜂的蜂螨寄生率

3.3微孢子蟲(chóng)感染情況 在越冬期(2019年12月)，所有蜂群的微孢子蟲(chóng)孢子數(shù)在0-7.0×105個(gè)/蜂之間。長(zhǎng)興蜂場(chǎng)的5群蜜蜂均沒(méi)有觀察到微孢子蟲(chóng)感染；蕭山蜂場(chǎng)每群蜜蜂的微孢子蟲(chóng)感染情況都比較嚴(yán)重，平均每只蜜蜂體內(nèi)孢子數(shù)達(dá)到2.7×105個(gè)，顯著高于其它蜂場(chǎng)的蜂群(P<0.05)；其余蜂場(chǎng)的蜜蜂體內(nèi)僅有少量孢子(圖3)。而在春季(2020年3月)所有蜂群的微孢子蟲(chóng)孢子數(shù)在0-2.3×106個(gè)/蜂之間。其中，除了蕭山蜂場(chǎng)以外，其它5個(gè)蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)微孢子蟲(chóng)數(shù)量均有不同程度的上升，尤其是紹興蜂場(chǎng)平均每只蜜蜂體內(nèi)孢子數(shù)從越冬期的0.2×105個(gè)顯著上升到春繁期的9.1×105個(gè)，顯著高于淳安(P<0.05)和蕭山(P<0.05)蜂場(chǎng)的蜂群，而其它蜂場(chǎng)間有沒(méi)有顯著區(qū)別(P>0.05，圖3)。

圖3 各種蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)微孢子蟲(chóng)孢子數(shù)注：不同字母之間代表差異顯著。

3.4病毒感染情況

3.4.1病毒感染率 越冬期(2019年12月)和春繁期(2020年3月)各個(gè)種蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)常見(jiàn)的5種蜜蜂病毒(BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV)的感染率如圖4所示。在越冬期，各個(gè)蜂場(chǎng)均有很高比例的蜂群感染BQCV(60%～100%)、CBPV(80%～100%)和DWV(100%)，而IAPV(20%～80%)和SBV(0～20%)感染比例相對(duì)較低。從越冬期到春繁期，整體而言，除了BQCV以外，各個(gè)蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)其它4種病毒的感染率呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)。其中，在春繁期(2020年3月)，江山蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)IAPV感染率(60%)顯著高于千島湖蜂場(chǎng)(0%，P<0.05)，長(zhǎng)興蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)DWV感染率(100%)顯著高于紹興蜂場(chǎng)(40%，P<0.05)。除此之外，其它各組病毒感染率在越冬期和春繁期并沒(méi)有顯著變化(P>0.05，圖4)。

圖4 不同取樣時(shí)間點(diǎn)各種蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)常見(jiàn)病毒感染率注：*代表P<0.05。

圖5 不同取樣時(shí)間點(diǎn)各種蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)常見(jiàn)病毒感染滴度注：不同字母代表不同的顯著性水平。

3.4.2病毒感染滴度 對(duì)于6家種蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)五種常見(jiàn)病毒感染滴度的測(cè)定結(jié)果如圖5所示。在越冬期(12月13日)，各蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)只有SBV病毒感染滴度存在顯著差異，即沒(méi)有SBV感染的蕭山蜂場(chǎng)蜜蜂顯著低于其他5家蜂場(chǎng)(均為P<0.001)，蘭溪蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)SBV病毒感染滴度也要比淳安(P<0.05)和紹興(P<0.01)兩家蜂場(chǎng)明顯更高。而到春繁期(3月11日)，除了江山蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)SBV感染滴度明顯較高以外，其他5家蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)的病毒感染滴度已不可檢測(cè)到，此時(shí)，千島湖蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)IAPV病毒感染滴度也低于檢測(cè)限，顯著低于其他幾家蜂場(chǎng)(均為P<0.01)。除此之外，其他病毒的感染滴度在不同時(shí)間段內(nèi)各蜂場(chǎng)間無(wú)明顯區(qū)別(P>0.05，圖5)。

總體而言，平均每群蜜蜂體內(nèi)CBPV病毒感染滴度在3.99-6.19(基因組log拷貝數(shù)，下同)之間，并且病毒感染滴度在越冬期和春季產(chǎn)蜜期之間也無(wú)明顯區(qū)別。對(duì)于BQCV，平均每群蜜蜂體內(nèi)病毒感染滴度從越冬期(2.81-3.67)到春繁期(5.17-6.69)顯著上升(P<0.001)；而相反地，DWV病毒感染滴度(6.96-8.09)從越冬期到春繁期則呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)(P<0.001)。此外，和DWV類似，從越冬期到春繁期IAPV(越冬期：2.63-3.29；春繁期： 0.00-1.66，P<0.001)和SBV(越冬期：0.00-6.98，春繁期：0.00-5.47，P<0.001)的病毒感染滴度也均有明顯的下降趨勢(shì)(圖5)。

4 討論

蜜蜂作為社會(huì)性昆蟲(chóng)，蜂群整體健康狀態(tài)與外界環(huán)境息息相關(guān)，所以在做相關(guān)測(cè)定時(shí)，必須選擇一個(gè)適宜的地方進(jìn)行集中測(cè)定。本次對(duì)蜜蜂抗病力指標(biāo)的集中測(cè)定是近年來(lái)全國(guó)首次對(duì)蜜蜂種質(zhì)進(jìn)行的集中對(duì)比研究。目前的結(jié)果表明6家種蜂場(chǎng)的蜜蜂在微孢子蟲(chóng)和病毒感染等抗病力指標(biāo)上存在顯著差異，而對(duì)于蜂螨的寄生并無(wú)明顯區(qū)別。

雖然在進(jìn)場(chǎng)時(shí)，6個(gè)蜂場(chǎng)間的蜂群群勢(shì)差異較大，但在越冬期和春繁期時(shí)蜂群在蜂量和子脾數(shù)量上趨同(圖1)，說(shuō)明養(yǎng)蜂生產(chǎn)上的飼養(yǎng)管理能對(duì)蜂群群勢(shì)起到?jīng)Q定作用。這也為后續(xù)相關(guān)抗病力指標(biāo)的測(cè)定提供了參考，由此避免了蜂群群勢(shì)差異可能對(duì)本研究造成的一定影響。

漿蜂蜂螨寄生率主要和蜂群本身的抗螨性及蜂場(chǎng)治螨效果有關(guān)。目前浙江省的漿蜂蜂群都不是抗螨蜂種，本次的測(cè)定結(jié)果也表明不同時(shí)期不同種蜂場(chǎng)的蜂群在蜂螨寄生率上無(wú)顯著差異，顯示各蜂場(chǎng)蜜蜂的抗螨能力類似。在蜂種無(wú)抗螨性的情況下，蜂群的蜂螨寄生率基本取決于蜂場(chǎng)的治螨效果。在越冬期測(cè)得各蜂群的蜂螨寄生率在0-19.44%之間，說(shuō)明總體來(lái)看該時(shí)期蜂場(chǎng)治螨效果較佳，但仍有少數(shù)蜂群蜂螨寄生率超過(guò)了10%，蜂群健康處于明顯受威脅的狀態(tài)，這一點(diǎn)和越冬期間部分蜂群出現(xiàn)死蜂的現(xiàn)象相符。由于蜂螨的生命周期大部分是在蜂群巢房?jī)?nèi)的繁殖階段[3,11]，在越冬期無(wú)子脾的情況下進(jìn)行治螨處理效果較好。經(jīng)歷過(guò)漫長(zhǎng)的冬季待到春繁期時(shí)，成年蜂體表已沒(méi)有蜂螨寄生(圖2)，進(jìn)一步說(shuō)明越冬期為治螨的關(guān)鍵時(shí)期，決定著來(lái)年春季蜂群的整體健康態(tài)勢(shì)。

兩次的測(cè)定結(jié)果說(shuō)明不同種蜂場(chǎng)蜂群感染微孢子蟲(chóng)程度存在顯著差異，而在多數(shù)蜂場(chǎng)蜂群微孢子蟲(chóng)孢子數(shù)不多的情況下，蕭山蜂場(chǎng)和紹興蜂場(chǎng)分別在冬季和春季微孢子蟲(chóng)孢子數(shù)明顯高于其它種蜂場(chǎng)的蜂群(圖3)，說(shuō)明這兩個(gè)蜂場(chǎng)蜂群抗微孢子蟲(chóng)能力可能較差。這兩家種蜂場(chǎng)在蜂王選種和育王時(shí)需更多考慮蜂群感染微孢子蟲(chóng)的情況，逐步改善抗微孢子蟲(chóng)的能力。

在越冬期，各個(gè)蜂場(chǎng)均有一定比例的蜂群感染BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV等5種病毒，且其中較高感染比例的病毒為BQCV和DWV(圖4)，這與此前國(guó)內(nèi)西方蜜蜂病毒流行性調(diào)查結(jié)果類似[9,12]。此外，蜂群被多種病毒同時(shí)感染是普遍的現(xiàn)象[13]，本研究的結(jié)果也是如此。除了江山蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)IAPV感染率顯著高于千島湖蜂場(chǎng)，長(zhǎng)興蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)DWV感染率顯著高于紹興蜂場(chǎng)外，其它各組病毒感染率在越冬期和春繁期并沒(méi)有顯著變化(圖4)，這可能與各蜂群成年蜂體表蜂螨寄生率下降、蜂群抗病毒能力較強(qiáng)有關(guān)。整體而言，從越冬期到春繁期，除了BQCV以外，各個(gè)蜂場(chǎng)蜜蜂體內(nèi)其它4種病毒的感染率呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)。此前有報(bào)道顯示微孢子蟲(chóng)與BQCV間具有一定的協(xié)同作用[14]，本研究中6家蜂場(chǎng)蜜蜂上微孢子蟲(chóng)孢子數(shù)從越冬期到春繁期均有所增加，這可能是為什么BQCV感染率沒(méi)有隨著蜂群中蜂螨寄生率的下降而降低的原因。

從越冬期到春繁期，平均每群蜜蜂體內(nèi)BQCV病毒感染滴度顯著上升；而相反地，DWV、IAPV和SBV病毒感染滴度從越冬期到春繁期則呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)(圖5)。這種趨勢(shì)與前述病毒侵染率結(jié)果類似，也可能與各蜂群在春繁期蜂螨寄生率下降、蜂群抗病毒能力較強(qiáng)有關(guān)。由于蜜蜂病毒與蜂螨間聯(lián)系緊密[15]，DWV更是已經(jīng)證明與狄斯瓦螨存在緊密的協(xié)同作用[16]，這也進(jìn)一步解釋了為什么不同時(shí)期各蜂場(chǎng)間的蜜蜂病毒感染情況(除了BQCV)也基本差別不大，僅在較少的蜂場(chǎng)間存在病毒感染率和病毒感染滴度間的顯著差異。

本次測(cè)定僅選取了每家蜂場(chǎng)5群蜜蜂，而且在養(yǎng)殖過(guò)程中難免會(huì)有一些蜂群出現(xiàn)特殊情況(如盜蜂等)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，在條件允許的情況下，今后應(yīng)選取更多的蜂群開(kāi)展測(cè)定。本研究發(fā)現(xiàn)各種蜂場(chǎng)蜂群均沒(méi)有表現(xiàn)出自然抗蜂螨能力，且抗螨能力沒(méi)有顯著差異，且不同種蜂場(chǎng)蜂群感染微孢子蟲(chóng)程度存在顯著差異，部分蜂場(chǎng)蜂群感染微孢子蟲(chóng)情況更為嚴(yán)重。此外，各種蜂場(chǎng)蜂群病毒感染情況都比較嚴(yán)重，且抗病毒能力沒(méi)有顯著差異，而這與蜂螨和微孢子蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)的感染聯(lián)系較密切。在今后的蜜蜂飼養(yǎng)管理和蜜蜂育種工作中，有效防控蜂螨和微孢子蟲(chóng)的侵染程度將有助于促進(jìn)蜂群的抗病毒能力，增加蜂群的整體健康態(tài)勢(shì)。