欒明鑒，何熹，林榮芳，姚艷艷，趙祥忠

1. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院（濟(jì)南 250353）；2. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院（濟(jì)南 250353）；3. 威海長青海洋科技股份有限公司（威海 264200）

褐藻是中國重要的經(jīng)濟(jì)藻類之一，也是沿海地區(qū)重要的生物能源制造者，有超過250個(gè)屬，1800余種[1]。目前應(yīng)用最多的是瓊膠、褐藻膠和卡拉膠。其中，褐藻膠在海藻工業(yè)中產(chǎn)量最大、品種最多、用途最廣，被廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)。褐藻膠的降解產(chǎn)物褐藻膠寡糖也具有許多生物活性，因此近年來受到許多科研工作者的極大關(guān)注[2]。

我們通常所指的褐藻膠是褐藻酸的鈉鹽——褐藻酸鈉，又名海藻酸鈉，廣泛存在于各種褐藻中的一類水溶性酸性多糖物質(zhì)。褐藻酸鈉分子式為（C6H7O8Na）n，是由β-D-甘露糖醛酸（M）與α-L-古羅糖醛酸（G）兩種基礎(chǔ)物構(gòu)成，通過β-1, 4-糖苷鍵相連接[3]。相對分子質(zhì)量在33～250 K之間，一般為白色或淡黃色粉末，無臭無味，不溶于乙醇、乙醚、氯仿和酸（pH＜5.4），易溶于堿水，吸水膨脹變軟，成黏稠狀膠體。

褐藻膠是褐藻細(xì)胞壁的重要組分，具有分子質(zhì)量大、高聚合度、高黏度及高纖維性等特征，因而人體吸收利用程度差，很大程度上限制了使用范圍[4]。人們通過科學(xué)的方法將其分解，變成可吸收利用的有效成分。褐藻膠的降解產(chǎn)物——褐藻膠寡糖所具有的免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗病毒能力等生物活性，在醫(yī)藥界具有很大的潛在價(jià)值。褐藻膠寡糖屬于低分子聚合物，是由2～10個(gè)單糖通過糖苷鍵結(jié)合而成的，具有溶解性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，易被機(jī)體吸收且安全無毒等特點(diǎn)[5]。目前有大量文獻(xiàn)對褐藻膠寡糖進(jìn)行了深入研究和開發(fā)，使其更多的活性應(yīng)用到食品、藥品、環(huán)保、化工領(lǐng)域中，因此具有很高的應(yīng)用價(jià)值[6]。

褐藻膠裂解酶作為生產(chǎn)褐藻膠寡糖的工具酶，反應(yīng)效率高，反應(yīng)條件溫和，可控性強(qiáng)，便于定向制備褐藻膠寡糖，其研究具有深遠(yuǎn)理論意義和應(yīng)用前景。

1 褐藻膠裂解酶及其酶解特性

根據(jù)目前的研究結(jié)果，褐藻膠制備AOS方法分為三種：物理方法，化學(xué)方法和生物酶解方法。物理方法主要有輻射降解，熱液降解等。降解程度與溫度和時(shí)間呈正相關(guān)。缺點(diǎn)是降解的產(chǎn)物相對分子質(zhì)量大，較難獲得具有生物活性價(jià)值的褐藻膠寡糖?；瘜W(xué)方法主要有酸水解、堿水解和氧化水解。但是化學(xué)方法不容易控制，耗時(shí)長，褐藻膠被降解到一定程度后，副產(chǎn)物多，降解產(chǎn)物濃度低，很難再進(jìn)一步降解。而利用褐藻膠裂解酶，可大大提高低聚糖片段的產(chǎn)率，綠色環(huán)保?，F(xiàn)如今酶解法將逐漸取代傳統(tǒng)的化學(xué)降解法[7-8]。

褐藻膠裂解酶屬于多糖裂解酶（Polysaccharide Lyase，PLs）的一類，褐藻膠裂解酶分布于PL家族5，6，7，14，15，17，18的7個(gè)家族中。褐藻膠裂解酶還可根據(jù)酶切位點(diǎn)分為內(nèi)切酶和外切酶兩種，大部分為內(nèi)切酶。多數(shù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)褐藻膠裂解酶多為poly M偏好型，少數(shù)為poly G偏好型。雖然褐藻膠裂解酶存在降解poly M或者poly G的偏好性，但不代表其不能降解非特異性的底物[9]。

褐藻膠裂解酶通過β-消除機(jī)制（β-eliminate），作用于單體間的1-4糖苷鍵，隨著糖苷鍵的消除，產(chǎn)物末端六元環(huán)C4和C5位會生成不飽和雙鍵，底物的非還原性末端也會生成不飽和4-deoxy-L-erythro- hex-4-enopyranosyl糖醛酸，從而使得褐藻膠降解成一系列長短不一的寡糖片段。其酶解機(jī)理如下圖所示。不論是D-甘露糖醛酸或L-古羅糖醛酸都可生成不飽和衍生物。不飽和糖醛酸在235 nm波長處有強(qiáng)烈的紫外吸收，因此酶活力大小可在此波長處進(jìn)行測定。

圖1 褐藻膠裂解酶作用原理圖

2 影響褐藻膠裂解酶活性的因素

2.1 褐藻膠裂解酶來源

褐藻膠裂解酶的來源有很多，細(xì)菌與真菌中都存在，但大多數(shù)存在于細(xì)菌中，常見的有海洋弧菌，交替假單胞菌，鹽單胞菌，黃桿菌屬等。目前已有50多種褐藻膠裂解酶從藻類、海洋軟體動物以及土壤細(xì)菌中分離出來[10]。李婷婷等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，以海藻酸鈉為唯一碳源，從天然腐爛海帶中篩選得到一株高效褐藻膠降解菌株53#，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和16SrRNA鑒定，確定為類芽抱桿菌Paenibacillus agaridevorans。采用正交試驗(yàn)方法，以pH、溫度、NaCl濃度和海藻酸鈉初始濃度為影響因素，對該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，得到53#菌的最佳產(chǎn)酶條件：pH 8，25 ℃，NaCl質(zhì)量濃度15 g/L，海藻酸鈉初始濃度15 g/L。在最佳產(chǎn)酶條件下，褐藻膠裂解酶達(dá)到最大酶活。篩選得到的類芽抱桿菌Paenibacillus agaridevorans53#具有易于培養(yǎng)、產(chǎn)酶速度快和酶活力高等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)褐藻膠的高效糖化，在褐藻生產(chǎn)生物乙醇領(lǐng)域具有潛在利用價(jià)值[11]。然而周敏[12]研究發(fā)現(xiàn)以褐藻酸鈉為唯一碳源，從海帶降解菌群、海螺、鮑魚內(nèi)臟中共篩選出褐藻膠裂解酶產(chǎn)酶菌株共7株，其中鮑魚內(nèi)臟來源的弧菌屬細(xì)菌Vibriosp. B4.活性最高。對Vibriosp. B4產(chǎn)褐藻膠裂解酶的發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)化，獲得發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源為褐藻酸鈉10 g/L，最適氮源為硫酸銨10 g/L，最適發(fā)酵條件為溫度30 ℃，接種量1%，培養(yǎng)基初始pH 6.0。因此可見，由于菌種的不同，培養(yǎng)條件不同，酶活也不盡相同。

2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

培養(yǎng)條件、接種量、接種齡、培養(yǎng)基的各成分配比都會影響酶活性。李雙等[13]以交替單胞菌屬新種HB161718為研究菌株，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法優(yōu)化獲得該菌的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基：海藻酸鈉7.23 g/L，蛋白胨7 g/L，NaCl 23.11 g/L，K2HPO40.1 g/L，MgSO40.1 g/L，優(yōu)化條件下酶活力達(dá)到優(yōu)化前的1.59倍。

褐藻膠裂解酶在常溫、常壓和溫和的酸堿環(huán)境下，可以進(jìn)行高效的催化反應(yīng)。褐藻膠裂解酶本身是蛋白質(zhì)，無毒，對酸堿度敏感，故可通過調(diào)節(jié)反應(yīng)環(huán)境酸堿度、改變反應(yīng)環(huán)境溫度或添加抑制劑（助力劑）的方法控制酶促反應(yīng)進(jìn)行。pH、金屬離子、溫度等因素，對于酶活有顯著影響。楊錦等[14]發(fā)現(xiàn)適合濃度的Mg+、K+、Fe2+對產(chǎn)酶起到了促進(jìn)作用，這與之前的研究結(jié)果相一致。此外，菌株SH-1幾乎不能在無 K+的培養(yǎng)基中生長和產(chǎn)酶，表明K+是其生長和產(chǎn)酶所必需的無機(jī)鹽。Microbulbifersp. SH-1適宜生長的條件為pH 7～8.5，溫度25～32 ℃，最適產(chǎn)酶條件pH 7.5，溫度32 ℃，該條件溫和可控易于實(shí)現(xiàn)。

3 褐藻膠裂解酶分子生物學(xué)研究

決定酶活性的兩個(gè)關(guān)鍵性因素，一個(gè)是足夠的酶表達(dá)量，另一個(gè)是酶的結(jié)構(gòu)決定單位酶活性。足夠的酶表達(dá)量，可以利用分子生物學(xué)的方法，將不同生物的褐藻膠裂解酶基因進(jìn)行過量異源表達(dá)最為常見。其中大腸桿菌和畢赤酵母是最常見的模式菌株。酶的單位活性可以通過研究催化機(jī)制，改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高酶的活性。

由于定向改造后的產(chǎn)酶菌株適合于工業(yè)發(fā)酵，可以滿足市場對該酶的需要，具有較大的發(fā)展前景。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的蓬勃興起，為褐藻膠裂解酶研究提供了新的技術(shù)手段。通過基因工程技術(shù)、異源表達(dá)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改造等方法對褐藻膠裂解酶進(jìn)行改造，設(shè)計(jì)適用于不同工業(yè)化應(yīng)用的褐藻膠裂解酶生產(chǎn)菌株。

3.1 褐藻膠裂解酶基因表達(dá)研究

近年來，在NCBI數(shù)據(jù)庫中已收錄多種來源的褐藻膠裂解酶基因。Masayuki等[15]在PL-7家族中，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌基因組中存在一個(gè)編碼與藻鞘氨醇單胞菌裂解酶A1-II同源的蛋白（PA1167）的基因。在大腸桿菌中過表達(dá)的PA1167產(chǎn)物降解褐藻酸鈉并釋放了不飽和糖。Zhu等[16]從深海細(xì)菌Flammevirgasp.中克隆并鑒定了一種新型的雙功能褐藻膠裂解酶FsAlgB。重組FsAlgB的特征是內(nèi)切褐藻膠裂解酶，它可以識別四糖為最小底物并切割相關(guān)亞位點(diǎn)之間的糖苷鍵。在菌種中發(fā)現(xiàn)新的基因并克隆表達(dá)，是現(xiàn)階段褐藻膠裂解酶的基礎(chǔ)研究。

Yang等[17]從Microbulbifersp. Q7克隆了編碼新褐藻膠裂解酶AlyM的基因alyM并在大腸桿菌中表達(dá)。AlyM在pH 7.0和55 ℃時(shí)表現(xiàn)出最大的活性，并且特別偏愛聚古洛糖醛酸（polyG）。ESI-MS分析表明，AlyM主要產(chǎn)生聚合度（Degree of polymerization，DP）為2-5的寡糖。Li等[18]在Flavobacteriumsp. H63中發(fā)現(xiàn)褐藻膠裂解酶基因sag I，并對其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，成功在畢赤酵母中高效表達(dá)。酵母培養(yǎng)上清液中sagI重組酶（rSAGL）的最高產(chǎn)量達(dá)到226.4 μg/mL（915.5 U/mL）。該酶的最佳反應(yīng)溫度和pH為45 ℃和7.5。Yang等[19]構(gòu)建重組褐藻膠裂解酶cAlyM及其熱穩(wěn)定突變體102C300C，并在畢赤酵母中成功表達(dá)，鑒定結(jié)果顯示出兩種酶具有很好的熱穩(wěn)定性，兩種酶在50 ℃和pH 8.0時(shí)均表現(xiàn)出最大活性，并且對polyG偏愛。大腸桿菌和畢赤酵母均為模式生物，但在這兩種不同的微生物系統(tǒng)表達(dá)中，由于過量表達(dá)而未及時(shí)折疊成有活性的結(jié)構(gòu)，形成包涵體，酶活將受到不同程度的影響。這也是目前研究中遇到的難題之一，包涵體的解決，可以極大地提高異源表達(dá)的成功率。

3.2 褐藻膠裂解酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究

近年來隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，越來越多褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制得到解析。從結(jié)構(gòu)上來看，褐藻膠裂解酶通常采取3種結(jié)構(gòu)：β果凍卷、（α/α）n桶狀結(jié)構(gòu)和β螺旋結(jié)構(gòu)。褐藻膠裂解酶通過β消除的方式來降解褐藻膠，根據(jù)催化過程中有無金屬離子的輔助，褐藻膠裂解酶的催化機(jī)制又可進(jìn)一步分為His（Tyr）/Tyr型β消除和金屬離子輔助的β消除。這一理論為褐藻膠裂解酶的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)[20]。對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定向定點(diǎn)的改造，可以解決褐藻膠裂解酶的低熱穩(wěn)定性等一系列的問題。Yang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在這項(xiàng)研究中，引入二硫鍵，可以提高M(jìn)icrobulbiferspQ7的褐藻膠裂解酶cAlyM的熱穩(wěn)定性。與cAlyM相比，設(shè)計(jì)的兩種突變體，在45 ℃的半衰期分別增加2.25 h和1.16 h，并且在融解中分別增加1.7 ℃和0.4 ℃。這項(xiàng)研究中使用的合理設(shè)計(jì)策略，為提高褐藻膠裂解酶的熱穩(wěn)定性，提供了一種有價(jià)值的方法。Emil等[22]從腸道細(xì)菌Bacteroides cellulosilyticus（BcelPL6）細(xì)菌中提取了6家族的褐藻膠裂解酶，將保守的催化位點(diǎn)殘基Lys249，Arg270和His271進(jìn)行取代，導(dǎo)致活性喪失。Dong等[23]為了探索Aly36B的催化機(jī)理，研究并了解了野生型Aly36B及其突變體的結(jié)構(gòu)?；诮Y(jié)構(gòu)和突變分析，解釋了Aly36B對褐藻膠降解的催化機(jī)理。在催化過程中，Arg169，Tyr185和Tyr187負(fù)責(zé)中和底物的負(fù)電荷，而Lys143既充當(dāng)催化堿又充當(dāng)催化酸，代表了褐藻膠裂解酶的一種新型催化機(jī)制。定點(diǎn)突變這一高效改造，可以更清楚地了解催化機(jī)制的關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)。

蛋白質(zhì)的催化結(jié)構(gòu)域是底物結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)域的改造是提高蛋白質(zhì)活性的技術(shù)手段之一。Yan等[24]為了確定褐藻膠裂解酶中非催化結(jié)構(gòu)域的功能，構(gòu)建了僅包含催化結(jié)構(gòu)域的重組AlgH-I和包含催化結(jié)構(gòu)域和碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）結(jié)構(gòu)域的AlgH-II。結(jié)果表明，缺失相關(guān)結(jié)構(gòu)域，顯著提高了重組酶的活性和熱穩(wěn)定性。與改造前的酶相比，修飾后的褐藻膠裂解酶酶活更高，可用于工業(yè)生產(chǎn)AOS。

4 褐藻膠裂解酶的應(yīng)用

4.1 食品行業(yè)

褐藻膠裂解酶在食品行業(yè)的應(yīng)用是降解褐藻膠產(chǎn)生褐藻膠寡糖，褐藻膠寡糖的抗菌活性用于食品保鮮。虞銘霞等[25]發(fā)現(xiàn)在6周凍藏過程中，海藻糖和褐藻膠寡糖顯著（p＜0.05）降低了紫貽貝肉解凍損失率，肉組織結(jié)構(gòu)相對較為完整、致密，細(xì)胞間隙冰晶顆粒面積較小，并維持了較好的彈性和咀嚼性等特性，同時(shí)有效抑制了紫貽貝肉中菌落總數(shù)的快速增加。因此海藻糖和褐藻膠寡糖可作為一種高效的低溫保護(hù)劑，用于保持紫貽貝及其制品品質(zhì)及延長凍藏產(chǎn)品貨架期。陳淑瓊等[26]研究結(jié)果顯示，褐藻膠寡糖具有較強(qiáng)的清除自由基的能力和抑菌能力，將其作用于蝦頭中提取的多酚氧化酶，發(fā)現(xiàn)能有效地抑制多酚氧化酶的活性，表明褐藻膠寡糖對對蝦的腐敗菌生長具有一定的抑制作用，為酶解褐藻酸鈉制備的褐藻寡糖的開發(fā)和對對蝦的貯藏保鮮研究提供了理論依據(jù)?？寡趸赃@一特性對食品保鮮，延長貨架期提供了理論依據(jù)。

4.2 醫(yī)藥行業(yè)

褐藻膠裂解酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用目前是抗生物膜劑的制備。銅綠假單胞菌是一種機(jī)會性致病病原體，臨床上最常見的三大致病菌之一，是免疫受損個(gè)體和肺囊性纖維化患者主要致病因子。銅綠假單胞菌侵入肺上皮后，從非褐藻膠產(chǎn)生菌株（非黏液型）到褐藻膠產(chǎn)生菌株（黏液型）的遺傳轉(zhuǎn)化，有利于細(xì)菌生物膜的形成并粘附在肺黏膜并發(fā)生細(xì)菌的免疫逃逸，導(dǎo)致臨床上出現(xiàn)持續(xù)性，難治性感染。王亞男[27]利用96孔板模型和flow cell模型檢測，A1y08對銅綠假單胞菌生物膜具有抑制和清除作用。為了進(jìn)一步改善褐藻膠裂解酶生物學(xué)特性和抗生物膜活性，以離子交聯(lián)法將純酶A1y08固定在殼聚糖（CS-NPs）上構(gòu)建納米粒。褐藻膠裂解酶A1y08具有較高活性及較好的溫度穩(wěn)定性和堿適應(yīng)性以及高效降解褐藻膠底物的能力，同時(shí)固定化的褐藻膠裂解酶-殼聚糖納米粒，將有助于褐藻膠裂解酶作為抗生物膜劑的進(jìn)一步開發(fā)。這一應(yīng)用對細(xì)菌性肺部感染提供了新的治療方法。

5 結(jié)語與展望

綜上所述，褐藻膠裂解酶具有極高的應(yīng)用價(jià)值，能夠適用于各個(gè)行業(yè)，長久以來受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因工程技術(shù)將成為研究褐藻膠裂解酶的關(guān)鍵技術(shù)。因此，根據(jù)來源不同的褐藻膠，篩選出相應(yīng)的產(chǎn)酶菌株，建立褐藻膠裂解酶的菌種庫；應(yīng)用研究褐藻膠裂解酶的活性機(jī)理，以便利用，可以更好地應(yīng)用其特點(diǎn)造福人類；在對菌株產(chǎn)酶特異性研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，對菌株的產(chǎn)酶種類、產(chǎn)酶效率進(jìn)行分子層面的改造，提高其產(chǎn)酶活性和穩(wěn)定性，以達(dá)到酶制劑工業(yè)化的需要，構(gòu)建高效率的工程菌株；應(yīng)用發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程、基因工程和酶工程技術(shù)，生產(chǎn)工具專用酶，酶解褐藻膠，開發(fā)具有特殊功能的褐藻寡糖，為海洋資源的高附加值化的開發(fā)，探索新的途徑。以上幾個(gè)方面將是褐藻膠裂解酶未來的研究方向。