李 靜 李艷紅 陸雪瑩 張志強(qiáng) 吳思雅

（1.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院 新疆烏魯木齊 830021；2.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 新疆烏魯木齊830054；3.中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 新疆烏魯木齊 830011）

優(yōu)良品種是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要基礎(chǔ)，小麥（Triticum aestivum L）作為世界上第一大糧食作物，是人類(lèi)最主要的食物來(lái)源。轉(zhuǎn)基因大穗小麥?zhǔn)潜緦?shí)驗(yàn)室采用花粉管通道法將大賴(lài)草總DNA導(dǎo)入受體春麥761后獲得的轉(zhuǎn)基因小麥新株系，其具有大穗、多粒、大粒、高蛋白、抗黃萎病等優(yōu)良變異[1]?？娷?、王子霞等對(duì)大賴(lài)草、轉(zhuǎn)基因大穗小麥及春麥761進(jìn)行了RFLP、RAPD及SSR等一系列分析工作，從分子的角度證實(shí)了轉(zhuǎn)基因大穗小麥中確實(shí)引入了供體大賴(lài)草的基因[2-3]。由于轉(zhuǎn)基因大穗小麥?zhǔn)峭ㄟ^(guò)導(dǎo)入大賴(lài)草總DNA獲得的，其在獲得優(yōu)良變異性狀的同時(shí)，也引入了生長(zhǎng)期延長(zhǎng)、冬性化、分蘗數(shù)增加、株型分散等不利變異。為了去除不利變異基因，進(jìn)一步獲取優(yōu)良性狀基因片段，本文對(duì)轉(zhuǎn)基因大穗小麥中導(dǎo)入的外源性DNA片段進(jìn)行化學(xué)發(fā)光生物素探針標(biāo)記Southern雜交檢測(cè)分析，以期為后續(xù)小麥的遺傳育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因大穗小麥和春麥761幼苗葉片（將其同條件種植后幼苗長(zhǎng)至5 cm～8 cm時(shí)，剪取幼嫩葉片作為實(shí)驗(yàn)材料）；大賴(lài)草基因組總DNA為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取純化

（1）提取。將植物幼嫩葉片樣品分別加液氮依次磨碎，分別用CTAB法[4]抽提，經(jīng)兩次離心后，使用無(wú)水乙醇洗滌，真空抽干，在得到的DNA中加入2 mLl0 mmol/L的Tris·HCl（pH=8.0）充分溶解，于4 ℃保存。

（2）純化。第一次純化：向DNA溶液中加入RNA酶（RNase）（10 mg/mL），37 ℃保溫30 min，加蛋白酶K使終濃度為100 μg/mL，37 ℃保溫1 h，苯酚抽提兩次，氯仿抽提一次；上清液分別過(guò)Sepharose 2B柱（柱長(zhǎng)22 cm，直徑2.4 cm），洗脫液為0.2 M NaCl、10 mmol/L Tris·HCl（pH=8.0），洗脫速度3 滴/min～4 滴/min，走紙6 cm/min，靈敏度2A；收集第一峰，乙醇沉淀，-20 ℃放置4 h以上，離心，真空抽干，10 mmol/L Tris·HCl溶解沉淀。第二次純化：由于第一次過(guò)柱后，RNA峰和DNA峰分界不明顯，認(rèn)為仍然混有RNA，故又加入RNase，再過(guò)柱。

1.2.2 基因組總DNA電泳檢測(cè)及紫外分光光度法定量測(cè)定

將提取的兩種樣品總DNA于1.2%Agarose、40 V電泳2 h[5]，紫外燈下看條帶是否清晰。分別取30 μL兩種樣品總DNA稀釋至3 mL，蒸餾水對(duì)照，紫外分光光度計(jì)分別測(cè)OD260和OD280值。

1.2.3 化學(xué)發(fā)光生物素標(biāo)記Southern雜交檢測(cè)

（1）植物材料基因組總DNA的限制性雙酶切。

取滅菌0.5 mL離心管，按照表1中所列配制反應(yīng)液進(jìn)行酶切反應(yīng)，總體積為30 μL。37 ℃水浴鍋中保育5 h，同時(shí)對(duì)作為對(duì)照的λDNA進(jìn)行37 ℃保育2 h，BamHⅠ和HindⅢ雙酶切。

表1 不同植物材料基因組總DNA限制性雙酶切反應(yīng)液配制量表

（2）酶切DNA的電泳分離及硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印。

酶切DNA的電泳分離：酶切后的DNA樣品與Marker一起進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

酶切片段的原位變性及硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印：變性，將凝膠上的雙鏈DNA片段經(jīng)過(guò)原位變性處理，使之成為單鏈；凝膠上的單鏈DNA片段經(jīng)毛細(xì)管的虹吸作用，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，硝酸纖維膜真空80 ℃烘烤處理2 h固定，室溫保存。

（3）生物素標(biāo)記探針的制備。

對(duì)大賴(lài)草基因組DNA進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ的限制性雙酶切后，-20 ℃保存。探針的制備方法按照碧云天生物公司的《生物素隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒操作說(shuō)明書(shū)》，生物素標(biāo)記好的DNA探針于-20 ℃保存。

（4）印跡雜交并放射自顯影。

轉(zhuǎn)印完畢且固定好的硝酸纖維素膜與制備好的生物素標(biāo)記大賴(lài)草DNA探針進(jìn)行雜交，清洗干凈的雜交膜進(jìn)行化學(xué)發(fā)光自顯影檢測(cè)，雜交檢測(cè)生物素標(biāo)記核酸探針的方法參照碧云天生物公司的《化學(xué)發(fā)光法生物素標(biāo)記核酸檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)》進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA純化結(jié)果與分析

提取植物材料總DNA的目的是要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，做限制性雙酶切、Southern雜交等，要求DNA純度較高，將雜蛋白、多糖、RNA有效去除。殘余的雜蛋白和多糖通過(guò)酚-氯仿進(jìn)行多次抽提，然后用乙醚除去酚，之后再加入蛋白酶K來(lái)去除。而RNA的去除，起初認(rèn)為過(guò)柱可以順利將其除去，但過(guò)柱后，如圖1所示，RNA峰和DNA峰分界不明顯，認(rèn)為溶液中仍然混有RNA，故又加入RNase，再次過(guò)柱后，如圖2所示，RNA去除得較干凈。

圖1 總DNA Sepharose2B柱層析洗脫曲線圖

圖2 RNA酶解后總DNA Sepharose2B柱層析洗脫曲線圖

2.2 總DNA電泳檢測(cè)及紫外分光光度法定量測(cè)定結(jié)果與分析

總DNA電泳圖（如圖3）和紫外分光光度計(jì)定量測(cè)定結(jié)果（如表2）顯示，利用CTAB法提取再過(guò)柱純化得到的植物材料基因組總DNA的純度較高，濃度達(dá)到了預(yù)期的值，滿(mǎn)足限制性雙酶切及Southern雜交等后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖3 總DNA電泳圖

表2 總DNA的OD260和OD280值

2.3 總DNA的限制性雙酶切結(jié)果與分析

對(duì)轉(zhuǎn)基因大穗小麥和春麥761進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，將酶切的總DNA進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳的目的是將酶切后得到的不同長(zhǎng)度的片段在凝膠上依次分開(kāi)，然后把凝膠上分開(kāi)的DNA片段原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。實(shí)驗(yàn)對(duì)高純度的植物材料基因組總DNA和作為對(duì)照的λDNA進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，電泳結(jié)果如圖4所示，得到了長(zhǎng)度合適的在凝膠上依次分開(kāi)的DNA片段，為后續(xù)成功地將雙酶切的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上打下良好的基礎(chǔ)。

對(duì)轉(zhuǎn)基因大穗小麥和春麥761進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，將酶切的總DNA進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳的目的是將酶切后得到的不同長(zhǎng)度的片段在凝膠上依次分開(kāi)，然后把凝膠上分開(kāi)的DNA片段原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。實(shí)驗(yàn)對(duì)高純度的植物材料基因組總DNA和作為對(duì)照的λDNA進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，電泳結(jié)果如圖4所示，得到了長(zhǎng)度合適的在凝膠上依次分開(kāi)的DNA片段，為后續(xù)成功地將雙酶切的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上打下良好的基礎(chǔ)。

圖4 總DNA雙酶切電泳圖

2.4 化學(xué)發(fā)光生物素標(biāo)記Southern雜交檢測(cè)結(jié)果與分析

化學(xué)發(fā)光Southern雜交檢測(cè)自顯影后的X光膠片如圖5所示，由圖可知，雜交條帶位于第四條泳道上，即轉(zhuǎn)基因大穗小麥所在的泳道上，且只有唯一一條，而春麥761泳道上沒(méi)有，經(jīng)過(guò)和轉(zhuǎn)膜前瓊脂糖凝膠上的條帶位置及Marker比對(duì)，條帶大小約在750 bp～1 000 bp。

圖5 Southern雜交化學(xué)發(fā)光自顯影圖

3 討論與結(jié)論

20世紀(jì)90年代，花粉管通道法被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因小麥的研究中[6]。本實(shí)驗(yàn)室采用與小麥同亞族的且具有多種小麥不具有的優(yōu)良性狀的大賴(lài)草總DNA對(duì)春麥761進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得了一系列的轉(zhuǎn)基因新品系。分析研究轉(zhuǎn)基因大穗小麥中大穗相關(guān)的功能基因?qū)π←溒焚|(zhì)育種具有重要意義[7]。本研究利用化學(xué)發(fā)光生物素標(biāo)記大賴(lài)草總DNA探針對(duì)轉(zhuǎn)基因大穗小麥和受體春麥761基因組DNA進(jìn)行了Southern印跡雜交，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因大穗小麥和大賴(lài)草共有的而春麥761中沒(méi)有的特異性DNA條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該DNA片段長(zhǎng)度約在750 bp～1 000 bp，推測(cè)它是大賴(lài)草總DNA導(dǎo)入受體春麥761之后在轉(zhuǎn)基因大穗小麥中留下的DNA片段，即此片段來(lái)自大賴(lài)草基因組，為后續(xù)獲取并研究該特異性外源DNA片段奠定了基礎(chǔ)。